論 文 題 名

別紙様式1

修 士 学 位 論 文

論 文 題 名

(注:学 位 論 文 題 名 が 欧 文 の 場 合 は和 訳 を つ け る こ と。)

ES細 胞 由 来 の 神 経 系 細 胞 に お け る Necdinの 発 現 解 析

Analysis of Necdin expression in ES cell-derived neural cells

平 成24年7月12日 提 出

首都 大 学東 京 大 学 院

人 間健 康 科 学研 究 科 博 士 前 期課 程 人 間健 康 科 学 専 攻 フ ロンテ ィアヘ ル スサ イ エ ン ス学 域 学修 番 号:09898605

氏 名:鈴 木 朝 美

(指導 教 員 名:木 下 正信)

要 旨

神 経 発 生 に お い て 、 初 期 神 経 管 は 一 層 の神 経 幹 細 胞(神 経 上 皮 細 胞)で 構 成 され る が 、 発 生 と共 に神 経 幹 細 胞 は 活 発 に増 殖 して 細 胞 数 を 増 加 させ 神 経 管 は 肥 厚 し、神 経 幹 細 胞 は 神 経 細 胞 お よ び グ リア へ 分 化 し、 移 動 して 、複 雑 な 神 経 系 が 構 築 され る。 一 方 、神 経 幹 細 胞 は神 経 疾 患 や 損 傷 の 移 植 治 療 に 用 い る神 経 細 胞 な ど神 経 系 細 胞 の 供 給 源 と して も注 目 さ れ て い る。 した が っ て 神 経 幹 細 胞 の増 殖 と分 化 を解 明 す る こ とは 非 常 に 重 要 で あ る が 、 神 経 幹 細 胞 解 析 用 の マ ー カ ー は 、Nestinな ど 良 く知 られ て い る も の が あ る が ま だ 十 分 で は な い 。 そ こ で 本 研 究 で は神 経 幹 細 胞 に 対 す る細 胞 学 的 解 析 に利 用 で き る新 た な マ ー カ ー を探 索 す る こ と を 目的 と し、胚 性 幹 細 胞(ES細 胞)に 由来 す る神 経 系 細 胞 を 用 い て 神 経 細 胞 に 発 現 す る核 タ ン パ ク質 で あ る と報 告 され て い るNecdin遺 伝 子 お よ び タ ンパ ク質 の 発 現 を 解 析 した 。NeuralStemSphere(NSS)法 に 従 い 、 マ ウスES細 胞 を ア ス トロ サ イ ト条 件 培 地 中 で 浮 遊 培 養 して 神 経 系 細 胞 だ け に 分 化 させ 、 分 化 過 程 に お け る遺 伝 子 発 現 変 化 を リ ア ル タ イ ムRT‑PCRを 用 い て 調 べ た 。 そ の 結 果Necdin遺 伝 子 は 神 経 幹 細 胞 が 出 現 す る培 養4日 目に 現 れ 、 神 経 細 胞 が 出現 す る 培 養6日 目で 最 も発 現 が 多 くな る こ と か ら、ES細 胞 か ら神 経 幹 細 胞 お よ び 神 経 細 胞 へ の 分 化 に伴 い 遺 伝 子 が発 現 す る こ とが 分 か っ た 。 次 に 均 質 な マ ウ スES細 胞 、 神 経 幹 細 胞 、 神 経 細 胞 お よ び ア ス トロサ イ トに お け るNecdinの 遺 伝 子 発 現 を解 析 し、Necdin遺 伝 子 は 神 経 幹 細 胞 、 神 経 細 胞 お よび ア ス トロ サ イ トに 発 現 す るが 、神 経 細 胞 に お け る発 現 が最 も 高 い こ とが 分 か っ た 。 さ らに 抗Necdin抗 体 を用 い た 蛍 光 免 疫 染 色 法 に よ り、マ ウス 神 経 幹 細 胞 、神 経 細 胞 お よび ア ス トロ サ イ トに お い て 、 す べ て の 細 胞 の 核 周 辺 あ る い は細 胞 質 にNecdinタ ン パ ク 質 の発 現 を確 認 し、 遺 伝 子 発 現 解 析 の 結 果 を裏 付 け る こ とが で き た。一 方 、 ヒ トES細 胞 をNSS法 に 従 い 神 経 系 細 胞 へ 分 化 誘 導 させ てNecdin遺 伝 子 の発 現 変 化 を 調 べ た と こ ろ 、 マ ウス と同 様 に 、神 経 幹 細 胞 が 出 現 し神 経 細 胞 へ 分 化 す る と と も にNecdin遺 伝 子 の発 現 が 見 られ 増 加 す る こ とが 分 か っ た 。 以 上 の 結 果 よ り、Necdinは 種 の 違 い に よ らず 神 経 系 細 胞 に普 遍 的 に 存 在 す る が 、 神 経 細 胞 で 特 に 高 い こ と、 そ し て神 経 系 細 胞 の マ ー カ ー と して 利 用 で き る 可 能 性 が あ る こ と が 示 唆 され た 。

キ ー ワ ー ド:Necdin、 遺 伝 子 発 現 、 神 経 幹 細 胞 、 神 経 細 胞 、ES細 胞

Abstract

During the early stages of neural development, a single layer of neural stem cells (NCSs), neuroepithelial cells, forms the neural tube. As development proceeds, NSCs proliferates actively and differentiates into neurons and glia, which constitute brain.

NSCs have recently become cells of interest as a possible source of cells for therapeutic transplantation. Therefore, elucidation of cellular characteristics of NSCs is very important, but so far there is not enough number of NSC markers. In the present study, we analyzed expression of Necdin, which was reported as a neuronal mitotic suppressor, in NSCs differentiated from embryonic stem cells (ESCs) to explore new NSC marker. When cultured in astrocyte-conditioned medium (ACM) under free-floating conditions, colonies of mouse ESCs formed floating cell spheres, neural stem sphere (NSSs), and ESCs differentiated uni-directionally into neural cells. Gene expression of Necdin was up-regulated beginning on culture day 4 and increased by day 6, while expression of neural stem cell and neuron markers was up-regulated on days 4 and 6, respectively. Mouse NCSs, which were prepared from NSSs, expressed Necdin gene. When the NSCs were differentiated into neurons, Necdin expression was up-regulated. Astrocytes differentiated from NSCs also expressed Necdin gene.

Immunofluorescence analysis demonstrated expression of Necdin protein in mouse NSCs, neurons and astrocytes. Expression of Necdin gene was shown in human NSSs coincidentally with neural differentiation from human ESCs. Human NCSs prepared from NSSs formed from human ESCs expressed Necdin gene and the expression was up-regulated by differentiation into neurons. These results suggest that Necdin is present ubiquitously in neural cells and especially highly in neurons and Necdin has a potential to be work as a marker for neural cells without species difference to elucidate cellular characteristics of neural cells.

Keywords: Necdin, Gene expression, Neural stem cell, Neuron, Embryonic stem cell

1.緒 言

近 年 、 様 々 な 幹 細 胞 に 関す る研 究 が 目覚 ま しい発 展 を遂 げ て い る。 そ の な か で 、 神 経 幹 細 胞(neuralstemcell)は 神 経 系 細 胞 の 元 とな る 細 胞 で 、パ ー キ ン ソ ン病 等 の 神 経 変 性 疾 患 に対 す る細 胞 移 植 治 療 を 実 現 させ る うえ で 、 移 植 用 の 細 胞 を 作 り出 す も と に な る細 胞 と

して 注 目を 集 め て い る。 神 経 幹 細 胞 は 、成 体 の 脳 に も 一 部 存 在 す る が 、 主 に は 胚 発 生 の 初 期 段 階 の神 経 管 に お い て 、 神 経 上 皮 細 胞(neuroepithelialcell)あ る い は神 経 上 皮 幹 細 胞 (neuroepithelialstemce11)と 呼 ばれ る 均 質 な 細 胞 と して 存 在 す る。 そ して 神 経 幹 細 胞 は 、 神 経 系 の 発 生 過 程 に お い て 最 初 に 活 発 な増 殖 を して 細 胞 数 を増 や し、 そ の 後 神 経 細 胞 お よ び グ リア へ 分 化 し神 経 系 細 胞 と して 神 経 系 を構 築 す る 。 当 研 究 室 が 確 立 したES細 胞 (embryonicstemcell:胚 性幹 細 胞)か ら神 経 系 細 胞 へ の 分 化 誘 導 法 で あ るNeuralStem Sphere(NSS)法1)は 、invitroでES細 胞 か ら神 経 系 細 胞 を効 率 よ く一 方 向 的 に 分 化 誘 導 で き る方 法 で あ り2)、 均 質 な 神 経 幹 細 胞 を 調 製 す る こ と が で き る4)。 そ の 神 経 幹 細 胞 は 増 殖 能 、お よ び 神 経 細 胞 とグ リア へ の 分 化 能 を保 持 し、神 経 幹 細 胞 と して増 殖 ・維 持 した り、

神 経 細 胞 や グ リア へ 分 化 誘 導 させ た りす る こ と が 可 能 で あ る3)，4)。ま た このNSS法 は 、マ ウス や サ ル 、お よび ヒ トのES細 胞 に も応 用 で き5)、ES細 胞 か ら神 経 系 細 胞 を 短 期 間 で 効 率 よ く分 化 誘 導 ・調 製 す る こ とが で き る。

一 方 で

、 幹 細 胞 の 研 究 で は 細 胞 の性 質 を 調 べ る 目的 で 、様 々 な マ ー カ ー 遺 伝 子 が 利 用 さ れ て い る。神 経 幹 細 胞 の マ ー カ ー とな る 遺 伝 子 は 、Nestinな ど良 く知 られ て い る も の が あ る が 、 特 異 性 が 十 分 とは 言 え ず 、 神 経 幹 細 胞 と、 神 経 幹 細 胞 よ りい く らか 分 化 の進 ん だ 細 胞 で あ る神 経 前 駆 細 胞 を 明確 に 区 別 で き るマ ー カ ー は未 だ発 見 され て い な い 。 そ の た め 、 神 経 幹 細 胞 お よび 神 経 細 胞 か らの 分 化 過 程 を解 析 で き る新 た な マ ー カ ー を見 出 す こ とが 求 め られ て い る。 神 経 幹 細 胞 に 関す る新 しい マ ー カ ー を発 見 す る こ とは 、今 後 再 生 医 療 と し て 体 外 で 培 養 した 神 経 幹 細 胞 を 患 者 へ の移 植 な どに 利 用 す る際 、 均 一 な 細 胞 を提 供 す る た め に重 要 で あ り、 再 生 医 療 の ひ とつ の テ ー マ で あ る神 経 系 細 胞 の 移 植 治 療 に 貢 献 で き る と 考 え られ る。

そ こで 本 研 究 で は 神 経 系 細 胞 に 利 用 で き る新 た な マ ー カ ー を 探 索 す る こ と を 目的 と し、

Necdinに 注 目 した 。Necdinは 、マ ウスEC細 胞(embryonalcarcinomace11:胚 性 腫 瘍 細 胞)の 一 つ の 細 胞 株 で あ るP19細 胞 を レチ ノ イ ン 酸 で 処 理 し、神 経 細 胞 に 分 化 させ た 際 に 誘 導 され るmRNAに コー ドされ た 核 タ ンパ ク質 と して 見 出 され 、neurallydifferentiated ECce11‑derivedfactorに 由 来 してNecdinと 名 付 け られ た6)。 そ のmRNAは 中枢 お よび 末 梢 神 経 の ほ とん どす べ て の 神 経 細 胞 に発 現 し て い る が 、増 殖 中 の神 経 幹 細 胞 や 神 経 前 駆 細 胞 、 グ リア に は発 現 して い な い7)と 言 わ れ て き た 。 本 研 究 で は マ ウス お よび ヒ トES細 胞 を使 用 したNSS法 を 用 い て発 生 初 期 か らの 様 々 な 段 階 の 神 経 系 細 胞 モ デ ル を 分 化 誘 導

し、 そ の 過 程 で のNecdinの 発 現 を 遺 伝 子 発 現 解 析 や 蛍 光 免 疫 染 色 法 を 用 い て 解 析 した 。 併 せ て 現 在 知 られ て い る神 経 系 細 胞 の マ ー カ ー の解 析 も行 い 、 そ れ ぞ れ の 遺 伝 子 発 現 変 化 を解 析 す る こ とでNecdinが 神 経 系 細 胞 の新 しい マ ー カ ー とな り うる か 検 討 を行 っ た 。

2.方 法

2.1.マ ウ スES細 胞 の 培 養

0.1%ゼ ラ チ ン(Sigma)水 溶 液 で コ ー ト し た デ ィ ッ シ ュ に 、 マ イ ト マ イ シ ンC (MitomycinC:Wako)に よ っ て 分 裂 抑 制 処 理 を し た マ ウ ス 胎 性 線 維 芽 細 胞(Mouse embryonicfibroblast:MEF)を フ ィ ー ダ ー 細 胞 と し て 播 種 し 、 ダ ル ベ ッ コ 改 変 イ ー グ ル 培 地(Dulbecco'smodifiedEagle'smedium:DMED,Invitrogen11965‑092)に10%の

ウ シ 胎 仔 血 清(Fetalbovineserum:FBS,Hana‑NescoBio)、1%の

Penicillin‑Streptomycin(SIGMA)を 加 え たMEF培 養 液 で1日 間 培 養 し た 。

そ の 後 、同 デ ィ ッ シ ュ に マ ウ スES細 胞 を 播 種 し 、DMEM(Invitrogen11965‑065)に 、 15%のKnockoutSerumReplacement(KSR,Invitrogen)、1%の

Penicillin‑Streptomycin(SIGMA)、1%のnon‑essentialaminoacid(NEAA,

Invitrogen)、 β ・メ ル カ プ ト エ タ ノ ー ル(Invitrogen)を 最 終 濃 度 が0.1mMに な る よ う に 、 白 血 病 阻 害 因 子(Leukemiainhibitoryfactor:LIF,Chemicon)を 最 終 濃 度 が 1000U/mｌ に な る よ う に 加 え たES細 胞 培 養 液 で 培 養 し た 。

2.2.マ ウ スES細 胞 か ら神 経 系 細 胞 へ の 分 化 誘 導

マ ウスES細 胞 を 、2003年 お よ び2006年 にNakayama等 に よ っ て 報 告 され た 方 法 (NSS法)1)，8)に 従 い 神 経 系 細 胞 へ 分 化 誘 導 した 。マ ウスES細 胞 を 培 養 す る こ とで 形 成 され た コ ロニ ー を 、ガ ラ ス キ ャ ピ ラ リー を用 い て 剥 離 し、浮 遊 培 養 用 デ ィ ッシ ュ(住 友 べ 一 ク ラ イ ト)に 移 し、ACM(ア ス トロ サ イ ト条 件 培 地,住 友 べ 一 ク ライ ト)で6日 間培 養 す る こ とで 、 神 経 幹 細 胞 や 神 経 細 胞 な ど の 神 経 系 細 胞 が 存 在 す る 細 胞 の 球 状 集 合 体 (Neuralstemsphere:NSS)を 形 成 させ た 。

2.3.マ ウ スES細 胞 か ら 神 経 幹 細 胞 へ の 分 化 誘 導 と 神 経 幹 細 胞 の 調 製 ES細 胞 コ ロ ニ ー をACM中 で4日 間 浮 遊 培 養 す る こ と で 得 ら れ たNSSを 、BDMatrige1 基 底 膜 マ ト リ ッ ク ス(マ ト リ ゲ ル,BDFalcon)で コ ー ト し た デ ィ ッ シ ュ に 移 し 、 Neurobasal培 地(Invitrogen)に2%のB‑27supplement(Invitrogen)、1%の

L‑Glutamine(SIGMA)、1%のPenicillin‑Streptomycin(SIGMA)、 さ ら に 線 維 芽 細 胞 増 殖 因 子 −2(fibroblastgrowthfactor‑2:FGF‑2)を 最 終 濃 度 が20ng/m1と な る よ う に 添 加 し た 神 経 幹 細 胞 培 養 液 を 用 い て 接 着 培 養 し た 。 接 着 培 養 後 、NSSの 周 囲 に 遊 走 し て き た 神 経 幹 細 胞 を 回 収 、 マ ト リ ゲ ル で コ ー ト し た 新 し い デ ィ ッ シ ュ に 移 し神 経 幹 細 胞 培 養 液 を 用 い て 未 分 化 な 状 態 を 保 っ た ま ま 継 代 維 持 し た 。

2.4.マ ウ ス 神 経 幹 細 胞 か ら神 経 細 胞 あ る い は ア ス ト ロ サ イ トへ の 分 化 誘 導 マ ウ ス 神 経 幹 細 胞 か ら 神 経 細 胞 へ の 分 化 誘 導 は 、 マ ウ ス 神 経 幹 細 胞 の 培 養 液 を Neurobasal培 地 に10%のACMを 含 む 培 養 液 に 変 更 し、 必 要 な 日数 培 養 して 行 っ た 。

マ ウス 神 経 幹 細 胞 か らア ス トロサ イ トへ の 分 化 誘 導 は 、神 経 幹 細 胞 の 培 養 液 をDMEM:

NutrientmixtureF‑12HAM1:1(D/F培 地,SIGMA)に1%のG5supplementを 含 む 培 養 液 に 変 更 し 、 必 要 な 日数 培 養 し て 行 っ た 。

2.5.マ ウ ス 神 経 幹 細 胞 か ら神 経 細 胞 お よ び ア ス ト ロ サ イ トへ の 分 化 誘 導 NSS法 で 得 た マ ウ ス 神 経 幹 細 胞 の 培 養 液 をD/F培 地 に1%のN2supplement (Invitrogen)を 加 え た分 化 誘 導 条 件 培 養 液 に 変 更 し 、4日 間 培 養 した 。

2.6.ヒ トES細 胞 、ヒ トNSS、 ヒ ト神 経 幹 細 胞 お よ び ヒ ト神 経 細 胞 のcDNA 試 料

当研 究 室 に在 籍 した 大 津 に よ っ て 培 養 され た 、 ヒ トES細 胞 、 お よ び ヒ トES細 胞 を ACM中 で 浮 遊 培 養 した 際 に形 成 され た 培 養6、12、20日 目のNSS、 さ ら に ヒ トES細 胞 か ら調 製 した ヒ ト神 経 幹 細 胞 、ヒ ト神 経 幹 細 胞 をACM中 で14日 間培 養 し分 化 させ た 神 経 細 胞 の そ れ ぞ れ か ら調 製 したcDNA試 料 の 供 与 を受 け て使 用 した。

2.7.遺 伝 子 発 現 解 析

遺 伝 子 発 現 解 析 は 定 量 的 リ ア ル タ イ ム 逆 転 写 ポ リ メ ラ ー ゼ 連 鎖 反 応(Reverse transcriptionpolymerasechainreaction:RT‑PCR)を 用 い て 行 っ た 。 解 析 す るcDNA サ ン プ ル は 、各 条 件 の 細 胞 を 回 収 し 、IllustraQuickPrepMicromRNAPurificationKits

(GEHealthcareBio‑AciencesCrop.)を 用 い てPoly(A)+RNAを 抽 出 、Random hexamaers(AppliedBiosystems)を 用 い てcDNAへ と 逆 転 写 し た も の を 使 用 し た 。

リ ア ル タ イ ムRT‑PCRは 、PowerSYBRGREENPCRMasterMix(Applied

biosystems)、 お よ びPrimerExpresssoftware(Version2.0,Appliedbiosystems)で 作 製 し た プ ラ イ マ ー を 用 い て 、StepOnePlusReal‑timePCRSystem(StepOneSoftwareV

2.2.2,Appliedbiosystems)を 使 用 し行 っ た 。 ま ず95℃ で10分 間 処 理 し 、そ の 後95℃ で 15秒 間 処 理 し た 後60℃ で1分 間 処 理 す る 過 程 を40サ イ ク ル 繰 り返 し 、 反 応 を 行 っ た 。 そ の 結 果 か ら 、 段 階 希 釈 し た ス タ ン ダ ー ドサ ン プ ル の グ リセ ル ア ル デ ヒ ド3‑リ ン 酸 脱 水 素 酵 素(Glyceraldehyde‑3‑phosphatedehydrogenase:GAPDH)発 現 量 を 用 い て 作 成 し

た 検 量 線 を 使 用 し て 各 遺 伝 子 の 発 現 量 を 推 定 し 、 解 析 す る 各 サ ン プ ル のGAPDHの 発 現 量 を1と し て 相 対 発 現 量 を 算 出 し た 。

使 用 し た プ ラ イ マ ー の 塩 基 配 列 は 表1お よ び2に 示 し た 。

2.8.マ ウ ス 神 経 系 細 胞 の 免 疫 蛍 光 染 色

免 疫 蛍 光 染 色 に は 、 マ ウ ス 神 経 幹 細 胞 、 お よ び 神 経 幹 細 胞 を 分 化 誘 導 条 件 培 養 液 で4 日 間 培 養 し て 分 化 誘 導 し た 細 胞 を 使 用 し た 。 マ ト リ ゲ ル で コ ー ト し た ス ラ イ ドグ ラ ス 上 で 培 養 し た 細 胞 を 、4%パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド/リ ン 酸 緩 衝 生 理 食 塩 水(Phosphate bufferedsaline:PBS)溶 液 を 用 い て 固 定 し 、0.5%TritonX‑100/PBS溶 液 で あ る 浸 透 液 で 処 理 し た 後 、10%ウ シ 血 清 ア ル ブ ミ ン(Bovineserumalbmin:BSA)/PBS溶 液 で ブ ロ

ッ キ ン グ 処 理 を 行 っ た 。 そ の 後 一 次 抗 体 と し て 、 抗Necdin抗 体 で あ るNC243(Rabbit antiserum,1:100,大 阪 大 学 蛋 白 質 研 究 所 神 経 発 生 制 御 研 究 室 の 吉 川 教 授 よ り 提 供 を

受 け た9))、 抗Nestin抗 体 で あ るRat‑401(Mouse‑IgG,1:100,Hybridomabank)、 抗 Map‑2抗 体(Mouse‑IgG,1:200,Chemicon)、 抗GFAP抗 体(Mouse‑IgG,1:400,

Chemicon)を 使 用 し た 。 二 次 抗 体 と し て は 、AlexaFluor488、AlexaFluor546で 標 識 さ れ た 抗 体(そ れ ぞ れ1:200,MolecularProbes)を 使 用 し 、 そ れ ぞ れ 記 載 し た 濃 度 に 10%BSA/PBS溶 液 で 希 釈 し て 用 い た 。 ま た 、 核 は4',6'‑diamino‑2‑phenylindole(DAPI,

MolecularProbes)をPBSで48000倍 に 希 釈 し た も の を 使 用 し 染 色 し た 。そ れ ぞ れ 染 色 後 、Fluoromount(DBS)を 用 い て ス ラ イ ド グ ラ ス 上 に 包 埋 し 、 蛍 光 位 相 差 顕 微 鏡(Axio ImagerMAT,CarlZeiss)、 デ ジ タ ルCCDカ メ ラ(DS‑5M,Nikon)で 撮 影 し た 。

2.9.研 究 安 全 倫 理

研 究 に使 用 した マ ウ ス胎 性 線 維 芽 細 胞 は 、本 学 の 動 物 実 験 に 関 す る研 究 安 全 倫 理 委 員 会 の 承 認 を 受 け た 研 究 に よ り調 製 した 。 ま た 、 解 析 した ヒ トES細 胞 、 お よ び ヒ トES 細 胞 か らの 分 化 細 胞 は 、 本 学 の ヒ トES細 胞 倫 理 審 査 員 会 の 承 認 を 受 け 、 文 部 科 学 大 臣 に よ り確 認 され た ヒ トES細 胞 の 使 用 計 画 に 基 づ い て 行 わ れ た 研 究 に よ っ て 調 製 した も の で あ る。

3.結 果

3.1.マ ウ スES細 胞 か ら 神 経 系 細 胞 へ の 分 化 過 程 に お け るNecdin遺 伝 子 発 現 フ ィー ダ ー 細 胞 上 で 培 養 し た マ ウスES細 胞 の コ ロ ニ ー を非 接 着 性 の デ ィ ッシ ュ に移 し、

NSS法 に 従 い ア ス トロサ イ ト条 件 培 地(ACM)中 で 浮 遊 培 養 す る こ と に よ っ て 、神 経 系 細 胞 へ 分 化 誘 導 した1),8)。浮 遊 培 養 に よ りES細 胞 の コ ロ ニ ー は 球 状 のNeuralStemSphere (NSS)と 名 付 け られ た 神 経 系 細 胞 を含 む 細 胞 集 合 体 と な り、培 養 と共 にNSSの 直 径 は 大 き く な っ た 。NSSの 形 成 ・増 大 と共 に 、ES細 胞 は 神 経 系 細 胞 へ 一 方 向 的 に 分 化 す る こ と が 、 遺 伝 子 お よび タ ンパ ク質 発 現 解 析 の結 果 か らす で に 報 告 され て い る2)。 そ こで 、 本 実 験 に お い て もES細 胞 か ら神 経 系 細 胞 へ の 一 方 向 的 な 分 化 誘 導 が 実 際 に 起 こ っ て い る こ と を確 認 す るた め 、 培 養 に 伴 う種 々 の 細 胞 に 対 す る マ ー カ ー 遺 伝 子 発 現 の 変 化 を 、 リア ル タ イ ムRT‑PCR法 を 用 い て 調 べ た。 図1に 示 す よ うに 、ES細 胞 の マ ー カ ー で あ るOct‑4(図 1A)とNanog(図1B)は 培 養0日 のES細 胞 に お い て 発 現 が最 高 値 で あ っ た が 、培 養 と共 に 減 少 し、4日 目に は ほ とん ど発 現 が 見 られ な か っ た。 一 方 、 エ ピブ ラ ス トの マ ー カ ー で あ るFgf‑5(図1C)は 、 培 養 の2日 目に 一 過 性 に発 現 し、神 経 系 外 胚 葉 の マ ー カ ー で あ る Sox‑1(図1D)で は 培 養4日 目に 最 も発 現 が 高 くな っ た 。 さ らに 、神 経 幹 細 胞 の マ ー カ ー で あ るNestin(図1E)とMusashi‑1(図1F)、 そ して 神 経 幹 細 胞 、神 経 前 駆 細 胞 、 ア ス ト

ロサ イ ト前 駆 細 胞 お よ び ア ス トロサ イ トの マ ー カ ー で あ るPax‑6(図1G)は 培 養4日 目か ら発 現 が 明 らか に な り、6日 目に さ ら に発 現 が 増 加 した 。 これ に 対 して 、 神 経 細 胞 の マ ー カ ー で あ るNF‑M(図1H)とMAP‑2(図1I)は 培 養4日 目で は ほ とん ど発 現 して お らず 、 6日 目で は 顕 著 に な っ た 。以 上 か ら、本 実 験 に お い て も浮 遊 培 養6日 間 の 問 に 、ES細 胞 は 一 方 向 的 に エ ピブ ラス ト

、 神 経 外 胚 葉 、神 経 幹 細 胞 、神 経 前 駆 細 胞 を経 て 神 経 細 胞 へ 分 化 した こ とが 確 認 され た 。 こ の 時 、Necdin(図1J)遺 伝 子 の 発 現 は培 養4日 目か ら始 ま り、

6日 目 に さ らに 上 昇 した 。 こ の 結 果 は 、Necdinが 神 経 細 胞 とお そ ら く神 経 幹 細 胞 に発 現 す る こ と を示 唆 す る もの で あ る。

3.2.マ ウ スES細 胞 、 お よ び 神 経 系 細 胞 に お け るNecdin遺 伝 子 発 現

上 述 の よ うに 、 マ ウスES細 胞 か ら神 経 系 細 胞 へ の 分 化 過 程 に お け るNecdin遺 伝 子 発 現 解 析 の 結 果 か ら、Necdinが 神 経 系 細 胞 に発 現 す る こ とが 分 か っ た 。 そ こ で 、Necdinが マ ウ ス の ど の タ イ プ の 神 経 系 細 胞 で 多 く発 現 し て い る の か を検 討 す る た め 、 フ ィー ダ ー 細 胞 上 で 培 養 した マ ウスES細 胞 を対 照 と して 、マ ウスES細 胞 か らNSS法 で調 製 した 均 質 な神 経 幹 細 胞 、神 経 幹 細 胞 をACMを 含 むNeurobasa1培 地 で 培 養 して 分 化 させ た 神 経 細 胞 、 お よ び神 経 幹 細 胞 をG5supplementを 含 むD/F培 地 で 培 養 し分 化 させ た ア ス トロサ イ トに お け る 、 種 々 の 細 胞 の マ ー カ ー 遺 伝 子 お よ びNecdin遺 伝 子 の 発 現 を リア ル タ イ ム RT‑PCR法 で解 析 した。図2に 示 す よ うに 、ES細 胞 に最 も 多 く発 現 す るNanog(図2A)は 、 神 経 系 細 胞 に は ほ とん ど発 現 して い な か っ た 。 これ に 対 して 神 経 系 細 胞 の マ ー カ ー(図 2A‑E)は 、ES細 胞 に は ほ とん ど発 現 して い な か っ た 。神 経 幹 細 胞 の マ ー カ ー で あ るNestin (図2B)は 、 神 経 幹 細 胞 で 最 も多 く発 現 し、 分 化 した 神 経 細 胞 と ア ス トロサ イ トで は発 現 が 減 少 した 。Musashi‑1(図2C)は 、 神 経 幹 細 胞 、 神 経 細 胞 お よび ア ス トロサ イ トで発 現

が 見 られ 、神 経 細 胞 で の 発 現 が最 も 多 か っ た。 神 経 細 胞 の マ ー カ ー で あ るMAP‑2(図2D) の 発 現 は 神 経 細 胞 に お い て 、 ま た ア ス トロサ イ トの マ ー カ ー で あ るGFAP(図2E)の 発 現 は 、 ア ス トロ サ イ トに お い て 顕 著 で あ っ た 。 これ ら の 遺 伝 子 の発 現 パ タ ー ン が 、 各 細 胞 に 特 徴 的 な 傾 向 を 示 して い る こ とか ら、 そ れ ぞ れ が 目的 の 細 胞 に 分 化 誘 導 され て い る こ と を 確 か め る こ とが で き た 。 これ らの 神 経 系 細 胞 で のNecdin遺 伝 子(図2F)は 、 神 経 細 胞 で 多 く発 現 し、 神 経 細 胞 ほ どで は な い が 神 経 幹 細 胞 、 ア ス トロサ イ トに も発 現 して い る こ と が 分 か っ た 。 ま たES細 胞 で は ほ とん ど発 現 して い な か っ た。 よっ て こ こで もNecdinが 神 経 系 細 胞 に発 現 す る こ とが 確 認 で き た。

3.3.マ ウ ス 神 経 幹 細 胞 、 神 経 細 胞 、 ア ス ト ロ サ イ トに お け る 抗Necdin抗 体 を 用 い た 蛍 光 免 疫 染 色

こ こ ま で の結 果 で マ ウ ス神 経 系 細 胞 に お い てNecdin遺 伝 子 の 発 現 が確 認 され た た め 、 神 経 幹 細 胞 、 神 経 細 胞 お よ び ア ス トロサ イ トお け るNecdinタ ンパ ク質 の 発 現 を 、 蛍 光 免 疫 染 色 法 を 用 い て 調 べ た 。染 色 に は 、マ ウスES細 胞 由来 の 神 経 幹 細 胞 、神 経 幹 細 胞 をN2 supplementを 含 むD/F培 地 で4日 間 培 養 し神 経 細 胞 お よ び ア ス トロサ イ トに 分 化 させ た 細 胞 を 用 い 、DAPIに よ る核 染 色 、Necdinや そ れ ぞ れ の 細 胞 の マ ー カ ー タ ン パ ク 質 に 対 す る 抗 体 を用 い て 多 重 染 色 した(図3、 図4、 図5)。 そ の結 果 、Necdin遺 伝 子 解 析 で 発 現 が 最 も多 か っ た神 経 細 胞 だ け で な く、 神 経 幹 細 胞 お よ び ア ス トロサ イ トで もNecdinタ ン パ ク質 の 存 在 を確 認 す る こ と が で き た 。 図3の 神 経 幹 細 胞 で は 、 神 経 幹 細 胞 の マ ー カ ー で あ るNestin陽 性 の 細 胞(図3D)でNecdin(図3C)も 陽性 で あ り、 図4の 神 経 細 胞 で も 、 マ ー カ ー で あ るMAP‑2(図4D)陽 性 の 細 胞 でNecdin(図4C)が 陽性 で あ っ た 。 さ ら に 、 図5の ア ス トロ サ イ トで もマ ー カ ー で あ るGFAP陽 性 の 細 胞(図5D)で 、Necdin(図5C) が 弱 く陽 性 を 示 した 。Necdinは 核 タ ン パ ク質 で あ り、 使 用 した 抗Necdin抗 体 で あ る NC243を 用 い た 染 色 で は 、 核 周 辺 あ る い は 細 胞 質 が 染 色 され る こ とが 報 告 され て い る6)。

本 実 験 で も 、Necdin陽 性 細 胞 に お い て は 主 に核 周 辺 あ る は 細 胞 質 が 染 色 され て お り、 先 の 報 告 と一 致 す る結 果 が 得 られ た 。 よ っ て す べ て の タ イ プ の 細 胞 でNecdinタ ン パ ク 質 の 発 現 が 確 認 され 、 先 に述 べ た 神 経 系 細 胞 のNecdin遺 伝 子 発 現 解 析 結 果 を裏 付 け る こ と が で き た 。

3.4.ヒ トES細 胞 か ら神 経 系 細 胞 へ の 分 化 過 程 に お け るNecdin遺 伝 子 発 現 こ こ ま で マ ウ ス に つ い て調 べ て き た が 、 マ ウ ス と ヒ トのNecdinタ ン パ ク 質 が 多 くの 部 分 で よ く保 存 され て い る10)こ とか ら、NSS法5)を 用 い た ヒ トのES細 胞 か ら神 経 系 細 胞 へ の 分 化 過 程 に お け るNecdin遺 伝 子 発 現 変 化 に 関 して も 検 討 を行 っ た 。cDNAサ ン プ ル は 、 当研 究 室 に 所 属 した 大 津 に よ っ て 調 製 され た 、ヒ トES細 胞 をACM中 で20日 間 浮 遊 培 養 した 際 の 培 養6、12、20日 目の サ ン プル を使 用 し、Necdin遺 伝 子 の 発 現 を リア ル タ イ ム RT‑PCR法 を 用 い て 解 析 した 。 な お フ ィー ダ ー 細 胞 上 で培 養 した ヒ トES細 胞 か ら調 製 さ れ た サ ン プ ル を 、 培 養0日 目の サ ン プ ル と した 。 こ の ヒ トES細 胞 の 分 化 誘 導 過 程 に お い て も 、 す で に他 の 遺 伝 子 お よび タ ン パ ク 質 の発 現 変 化 の 実 験 か ら、 ヒ トES細 胞 か ら神 経 系 細 胞 へ の 一 方 向 的 な 分 化 が 起 こ る こ と、 ま た 培 養12日 目に は 神 経 幹 細 胞 が 、20日 目に

は神 経 細 胞 が 出 現 す る こ とを 大 津 らが 確 認 して い る。 一 方 でNecdin遺 伝 子 は 、 図6に 示 す よ うに培 養0日 目お よ び5日 目で は ほ とん ど発 現 して お らず 、神 経 幹 細 胞 の 出 現 時 期 で あ る12日 目で 発 現 が 増 加 し始 め 、神 経 細 胞 が 出 現 す る 時 期 で あ る20日 目に は さ らに 上 昇 した 。 こ の 結 果 に よ り、 ヒ トES細 胞 か ら神 経 系 細 胞 へ の 分 化 過 程 に お け るNecdin遺 伝 子 発 現 変 化 は 、 マ ウス で の遺 伝 子 発 現 変 化(図1J)と 同様 の傾 向 を 示 す こ とが 分 か っ た 。

3.5.ヒ トES細 胞 、 お よ び 神 経 系 細 胞 に お け るNecdin遺 伝 子 発 現

さ ら にNecdinが どの タ イ プ の 神 経 系 細 胞 で 多 く発 現 して い る の か を ヒ トの 神 経 系 細 胞 で 検 討 した 。 当研 究 室 に 所 属 した 大 津 に よ っ て 調 製 され た 、 ヒ トES細 胞 、 ヒ トES細 胞 か らNSS法 で 調 製 され た 均 質 な神 経 幹 細 胞 、 神 経 幹 細 胞 をACMで14日 間培 養 し分 化 さ せ た 神 経 細 胞 のcDNAサ ン プ ル を 使 用 し 、Necdin遺 伝 子 の 発 現 変 化 を リ ア ル タ イ ム RT‑PCR法 で 解 析 した。 そ の 結 果 、 図7に 示 す よ うに 、Necdinは 神 経 細 胞 に お い て 最 も 発 現 が 多 く な っ て い た が 、神 経 幹 細 胞 に お い て も発 現 が 確 認 され た。 一 方 、ES細 胞 で の 発 現 は 著 し く低 か っ た 。 これ は マ ウス 神 経 系 細 胞 用 い たNecdin遺 伝 子 の 発 現 変 化 解 析 の 結 果(図2F)と 同 様 で あ り、 ヒ トで の発 現 変 化 も似 た 傾 向 を示 す こ とが 分 か っ た 。

4.考 察

本 研 究 の マ ウ ス細 胞 を 用 い たNecdin遺 伝 子 発 現 解 析 に よ り、Necdin遺 伝 子 は マ ウ ス NSS形 成 に よ るinvitroで のES細 胞 か ら神 経 幹 細 胞 、 神 経 系 細 胞 へ の 分 化 に伴 い 発 現 が 増 加 す る こ と(図1)、 ま た 神 経 系 の そ れ ぞ れ の 培 養 細 胞 で は 、 神 経 細 胞 で 最 も多 く発 現 し、 神 経 幹 細 胞 お よ び ア ス トロ サ イ トに お い て も発 現 して い る こ と(図2)が 分 か っ た 。 さ らに 神 経 系 の 各 細 胞 に お け るNecdinタ ンパ ク 質 の発 現 を 、 蛍 光 免 疫 染 色 法 を 用 い て 調 べ た 結 果 、神 経 幹細 胞 、神経 細胞 、 ア ス トロサイ トでNecdinタ ン パ ク 質 の 発 現 が 確 認 さ れ(図3、 図4、 図5)、 遺 伝 子 解 析 の 結 果 を裏 付 け る こ と が で き た 。

さ ら に ヒ ト細 胞 で のNecdin遺 伝 子 発 現 解 析 に よ り、ヒ トで もマ ウ ス と同様 にNSS形 成 に 伴 いNecdin遺 伝 子 の 発 現 量 が 増 加 した た め(図6)、invitroで のES細 胞 か ら神 経 幹 細 胞 、 神 経 系 細 胞 へ の 分 化 に 伴 い 遺 伝 子 の 発 現 が 増 加 す る こ とが 示 唆 され た 。 ま た ヒ トの 培 養 細 胞 で も神 経 細 胞 に 最 も多 く発 現 し、 神 経 幹 細 胞 に お い て も発 現 す る こ とが 分 か っ た (図7)。

Necdinは 、神 経 細 胞 等 の 分 裂 を 終 了 した 細 胞 に 存 在 し7)、増 殖 中 の 神 経 幹 細 胞 や グ リア に は発 現 して お らず7)、 増 殖 を抑 え る機 能 が あ る11),12)と言 わ れ て き た 。 しか し近 年 、神 経 系 細 胞 に分 化 させ る こ と の で き るマ ウ スEC細 胞 のP19細 胞 株 で の 遺 伝 子 発 現 解 析 に よ り、

神 経 幹 細 胞 と考 え られ る よ り未 分 化 な 細 胞 で もNecdinが 発 現 して い る こ と を示 唆 す る結 果 が 得 られ て い る13)。本 研 究 に お い て も 、 マ ウス お よ び ヒ トES細 胞 由 来 の 分 化 ・増 殖 能 を 有 す る神 経 幹 細 胞 でNecdinの 発 現 が 確 認 され た(図2、 図3)。 本 研 究 で 用 い たES細 胞 か ら神 経 系 細 胞 へ の 分 化 誘 導 法 で あ るNSS法 は 、ES細 胞 か ら神 経 幹 細 胞 の み を調 製 す る こ と も 可 能 で あ るた め4)、均 質 な 神 経 幹 細 胞 を用 い て 検 討 を行 っ て神 経 幹 細 胞 にNecdin が発 現 す る こ とを 示 す こ と が で き た 。 よ っ て これ らの 結 果 は 神 経 幹 細 胞 にお け るNecdin 発 現 の 可 能 性 を確 実 に した も の で あ り、 これ に よ り新 た な 知 見 が 得 られ た と言 え る。 一 方 で 、 本 研 究 の結 果 で は グ リア の 一 種 で あ る ア ス トロサ イ トにお い て もNecdinの 発 現 が 確 認 され た(図2、 図5)。 グ リア で の発 現 に つ い て は 、 過 去 の 報 告 で ア ス トロサ イ トの 前 駆 細 胞 に お い てNecdin存 在 が 示 唆 され た 例6)も あ り、 本 研 究 に よ っ て ア ス トロサ イ トで のNecdin発 現 に 関 して も そ の 可 能 性 は 十 分 に あ る こ と が 示 され た 。Necdinに つ い て は 、 そ の 生 理 学 的 な 役 割 は ま だ よ く分 か っ て お らず14)、今 後 の さ らな る検 討 が 必 要 で あ る と考 え る。

本 研 究 に お い て は 、Necdinが 神 経 系 細 胞 の新 しい マ ー カ ー とな り うる か ど うか 検 討 を 行 っ た 。 マ ウ スES細 胞 か ら神 経 系 細 胞 へ の 分 化 過 程 に お け るNecdin遺 伝 子 の 発 現 変 化 (図1J)を み る と 、ES細 胞 のACM中 で の 浮 遊 培 養1、2日 目に は ほ とん ど発 現 が 見 られ な か っ た 。 こ の 期 間 はES細 胞 か らエ ピブ ラ ス ト、 神 経 外 胚 葉 へ の 分 化 が 起 こ っ て い る 時 期 と考 え られ る。そ の 時 期 の 細 胞 に はNecdin遺 伝 子 が ほ とん ど発 現 して い な い こ とか ら、

ES細 胞 か ら神 経 系 へ の 分 化 の 過 程 で は 、Necdinは 神 経 系 細 胞 に 分 化 す る こ と で発 現 す る と言 え る。ま た 、マ ウ スES細 胞 か ら神 経 系 細 胞 へ の 分 化 過 程 にお け るNecdinお よび 種 々 の神 経 系 細 胞 に 対 す る マ ー カ ー 遺 伝 子 の発 現 変 化 を 図8に ま と め た 。 これ に よ る と、 本 実 験 に お い てNecdinは 浮 遊 培 養2日 目か ら4日 目に か け て の 発 現 変 化 パ ター ン に 関 して 、

神 経 幹 細 胞 の マ ー カ ー で あ るNestin、Musashi‑1の 発 現 変 化 パ ター ン と神 経 細 胞 の マ ー カ ー で あ るMAP‑2 、NF‑Mの 発 現 変 化 パ タ ー ン と の 中 間 の よ うな 変 化 を見 せ る こ とが 分 か る 。

これ は 、Necdinが 既 知 の マ ー カ ー 遺 伝 子 と は 異 な る段 階 の 細 胞 を 検 出 で き る 可 能 性 示 す 結 果 で あ り、Necdinは これ ま で 明確 に 区別 す る こ との で き な か っ た 神 経 幹 細 胞 か ら神 経 細 胞 へ の 分 化 過 程 に あ る細 胞 を検 知 で き る可 能 性 が あ る と考 え られ る。 ま た 、 ヒ ト細 胞 を 用 い た 解 析 の結 果 で も マ ウ ス と同 様 の 傾 向 が み られ た こ とか ら(図6、 図7)、Necdinは 種 の 違 い に よ らず 用 い る こ と が で き 、 神 経 幹 細 胞 か ら神 経 細 胞 へ の 分 化 過 程 を解 析 で き る 新 た な 神 経 系 細 胞 の マ ー カ ー と して 利 用 で き る可 能 性 が あ る と考 え られ る。

今 後 の課 題 と して 、マ ウ ス お よ び ヒ トNSSの 凍 結 切 片 を用 い たNecdinタ ンパ ク質 の 蛍 光 免 疫 染 色 を行 い 、ES細 胞 か ら神 経 系 細 胞 へ の 分 化 過 程 に お け る遺 伝 子 発 現 変 化 を確 か め る必 要 が あ る。 ま た 、 神 経 幹 細 胞 が 神 経 細 胞 へ 分 化 して い く過 程 、 同様 に ア ス トロサ イ トへ 分 化 して い く過 程 の そ れ ぞ れ に お い て もNecdin遺 伝 子 発 現 の 変 化 が あ る と考 え られ る た め 、 さ らな る詳 しい 検 討 が必 要 で あ る と考 え る。

5.謝 辞

ま ず 、本 研 究 に使 用 した 抗Necdin抗 体NC243を 快 く提 供 して くだ さっ た 、大 阪 大 学 蛋 白質 研 究 所 神 経 発 生 制 御 研 究 室 の 吉 川 和 明 教 授 に 心 よ り御 礼 を 申 し上 げ ます 。

そ して 、 入 学 以 来 終 始 温 か く ご指 導 くだ さっ た 井 上 順 雄 先 生 、 井 上 先 生 の こ退 官 に 伴 い 研 究 の機 会 を 与 え て くだ さっ た木 下 正 信 教 授 に 心 よ り感 謝 を 申 し上 げ ま す 。

ま た 笠 井 久 隆 名 誉 教 授 、杏 林 大 学 医 学 部 大 津 昌 弘 助 教 、 客 員 研 究 員 の村 島 善 也 先 生 に も 熱 心 な ご指 導 を い た だ き 、 心 よ り感 謝 申 し上 げ ま す 。

さ ら に研 究 室 で共 に過 ご し様 々 な こ とを 学 ば せ て い た だ い た 、 磯 野 真 由 さん 、 上 田理 沙 さん 、 大 森 啓 之 さ ん 、 小 野 瀬 敦 子 さん 、筧 慎 吾 さん 、 久 米 信 恵 さ ん 、 小 松 城 光 さん 、柴 田 雅 祥 さん 、 新 屋 冬 美 さん 、 西 尾 里 志 さ ん 、 村 上 拡 治 さん 、 吉 江 拓 也 さ ん に 、 こ の 場 を借 り て感 謝 を 申 し上 げ ま す 。

参考文献

1) Nakayama T, Momoki-Soga T, Inoue N: Astrocyte-derived factors instruct differentiation of embryonic stem cells into neurons. Neurosci. Res. 46: 241-249,

2003.

2) Otsu M, Sai T, Nakayama T, Murakami K, Inoue N: Uni-directional differentiation

of mouse embryonic stem cells into neurons by the neural stem sphere method.

Neuroscience Res. 69: 314-321, 2011.

3) Nakayama T, Sai T, Otsu M, Momoki-Soga T, Inoue N: Astrocytogenesis of embryonic stem-cell-derived neural stem cells: default differentiation. Neuroreport

17: 1519-1523, 2006.

4) Nakayama T, Momoki-Soga T, Yamaguchi, K, Inoue N: Efficient production of neural stem cells and neurons from embryonic stem cells. Neuroreport 15: 487-491,

2004.

5) Okuno T, Nakayama T, Konishi N, Michibata H, Wakimoto K, Suzuki Y, Nito S, Inaba T, Nakano I, Muramatsu S, Takano M, Kondo Y, Inoue N: Selfcontained

induction of neurons from human embryonic stem cells. PLoS ONE 4: e6318.

doi:10.1371/journal.pone.0006318, 2009.

6) Maruyama K, Usami M, Aizawa T, Yoshikawa K: A novel brain-specific mRNA encoding nuclear protein (necdin) expressed in neurally differentiated embryonal

carcinoma cells. Biochem Biophys Res Commun 178: 291-296, 1991.

7) Uetsuki T, Takagi K, Sugiura H, Yoshikawa K: Structure and expression of the mouse necdin gene. Identification of a postmitotic neuron-restrictive core promoter.

J Biol Chem 271: 918-924, 1996.

8) Nakayama T, Inoue N: Neural stem sphere method induction of neural stem cells and neurons by astrocyte-derived factors in embryonic stem cells in vitro. Methods

Mol. Biol. 330: 1-13, 2006.

9) Niinobe M, Koyama K, Yoshikawa K: Cellular and Subcellular Localization of Necdin in Fetal and Adult Mouse Brain. Dev Neurosci 22: 310-319, 2000.

10) Nakada Y, Taniura H, Uetsuki T, Inazawa J, Yoshikawa K: The human chromosomal gene for necdin, a neuronal growth suppressor, in the Prader—Willi

syndrome deletion region. Gene 213: 65-72, 1998.

11) Hayashi Y, Matsuyama K, Takagi K, Sugiura H, Yoshikawa K: Arrest of cell growth by necdin, a nuclear protein expressed in postmitotic neurons. Biochem Biophys

Res Commun 213: 317-324, 1995.

12) Taniura H, Taniguchi N, Hara M, Yoshikawa K: Necdin, a postmitotic

neuron-specific growth suppressor, interacts with viral transforming proteins and cellular transcription factor E2F1. J Biol Chem 273: 720-728, 1998.

13) Liu Y, Yang S, Yang J, Que H, Liu S: Relative Expression of Type II MAGE Genes

During Retinoic Acid-Induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic

Carcinoma P19 Cells: A Comparative Real-Time PCR Analysis. Cell Mol Neurobiol:

DOI 10.1007/s10571-012-9826-2, 2012.

14) Xiao J, Chen HS: Biological functions of melanoma-associated antigens. World J Gastroenterol. 10 (13): 1849-1853, 2004.

表1マ ウス 細 胞 の リア ル タ イ ムRT‑PCRに 使 用 した プ ラ イ マ ー の塩 基 配 列

Gene names

GenBank accession nos.

5' Primer sequence 3' primer sequence

Product size (bp)

GAPDH Oct-4 Nanog Fgf-5 Sox-1 Nestin Musashi-1 Pax-6 NF-M MAP-2 GFAP MBP Necdin

NM 008084 X52437 AY278951 NM 010203 NM 009233 NM 16701 NM 8629 NM 013627 NM 8691 NM 8632 NM 10277 NM 10777 NM 010882

CTGCACCACCAACTGCTTAGC GTCTGGAGACCATGTTTCTGAAGT AGTGGAGTATCCCAGCATCCATT GAACTTTCCTTCACCGTCACTGT GGCCGAGTGGAAGGTCAT AGTGCCCAGTTCTACTGGTGTCC

CACGGTGGAAGATGTGAAACA ACCAACACGTACAGTGCTTTGC GCATCACCGGGCCTCTGTA AAAGGCCCGCGTAGATCAC

CGTTAAGCTAGCCCTGGACATC CCACAATAACGTGAGGGTAAGAGA GGCAGCTACAAGAAATGGTGC

CAGTCTTCTGGGTGGCAGTGA AGAACCATACTCGAACCACATCCT CTGCCCCACATGGAAAGG GTACTTCACTGGGCTGGGACTT ACTTGTAATCCGGGTGTTCCT CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTGA TCGCTCTCAAACGTGACAAATC ATAACTCCGCCCATTCACTGA GGGCCTCGACTTTGGTCTTC GGGATTCGAGCAGGTTGATG GGATCTGGAGGTTGGAGAAAGTC CAAGGTCGTTCAGTCAGTCACACT ATGGTGTGGAGATTGGTCAGC

110 105 81

102 101 125 120 141 81

122 107 113 101

略 語:GAPDH,glyceraldehyde‑3‑phosphatedehydrogenase;Oct‑4,0ctamer transcriptionfactor‑4;Fgf‑5,fibroblastgrowthfactor5;Sox‑1,SRY‑boxcontaininggene 1;Pax‑6,PairedBoxGene‑6;NF‑M,neurofilament,mediumpolypeptide;MAP‑2,

microtubule‑associatedprotein2;GFAP,glialfibrillaryacidicprotein;MBP,myelin basicprotein

表2ヒ ト細 胞 の リ ア ル タ イ ムRT‑PCRに 使 用 し た フ゜ラ イ マ ー の 塩 基 配 列

Gene names

GenBank accession nos.

5' Primer sequence 3' primer sequence

Product size (bp)

GAPDH Necdin

BC083511 AB007828

CAGGTGGTCTCCTCTCTGACTTCAA CGCCCGAATACGAGTTCTTTT

CCCTGTTGCTGTAGCCAAATTC TCCTCCAGAGCTTCTCTGTATCG

133 136 略 語:GAPDH,glyceraldehyde‑3‑phosphatedehydrogenase

図1マ ウスES細 胞 か ら神 経 系 細 胞 へ の 分 化 過 程 に お け る遺 伝 子 発 現 変 化

マ ウスES細 胞 を ア ス トロ サ イ ト条 件 培 地 中 で6日 間 浮 遊 培 養 す る こ と で神 経 系 細 胞 へ の 分 化 誘 導 を行 い 、 細 胞 を 回 収 してmRNAを 抽 出 し、 種 々 の 細 胞 の マ ー カ ー 遺 伝 子 お よ

びNecdin遺 伝 子 の 発 現 を リ ア ル タ イ ムRT‑PCR法 で 解 析 した 。 横 軸 に 浮 遊 培 養 日数 を 表 し 、 縦 軸 に 各 遺 伝 子 発 現 量 のGAPDH遺 伝 子 発 現 量 に 対 す る 相 対 値 を 表 し た(平 均 値 ± SD)。Oct‑4(A)とNanog(B)はES細 胞 の マ ー カ ー 遺 伝 子 で あ り 、Fgf‑5(C)は エ ピ ブ ラ ス ト、Sox‑1(D)は 神 経 外 胚 葉 、Nestin(E)、Musashi‑1(F)は 神 経 幹 細 胞 、Pax‑6(G) は 神 経 幹 細 胞 、神 経 前 駆 細 胞 、ア ス ト ロ サ イ ト前 駆 細 胞 お よ び ア ス ト ロ サ イ ト、NF‑M(H)

とMAP‑2(1)は 神 経 細 胞 の マ ー カ ー 遺 伝 子 で あ る 。(*P<0.05培 養0日 目 と 比 較 、**P

<0.05培 養4日 目 と 比 較)

図2マ ウ スES細 胞 、 お よ び 神 経 系 細 胞 に お け るNecdin遺 伝 子 発 現 変 化

フ ィ ー ダ ー 細 胞 上 で 培 養 し た マ ウ スES細 胞(ESC)、 マ ウ スES細 胞 か らNSS法 で 調 製 し た 神 経 幹 細 胞(NSC)、 さ ら に 神 経 幹 細 胞 を そ れ ぞ れ 適 切 な 条 件 で 培 養 し分 化 さ せ た 神 経 細 胞(Neuron)お よ び ア ス ト ロ サ イ ト(Astrocyte)に お い て 、種 々 の 細 胞 の マ ー カ ー 遺 伝 子 お よ びNecdin遺 伝 子 の 発 現 を リア ル タ イ ムRT‑PCR法 で 解 析 し た 。 横 軸 に そ れ ぞ れ の 細 胞 種 を 表 し 、縦 軸 に 各 遺 伝 子 発 現 量 のGAPDH遺 伝 子 発 現 量 に 対 す る 相 対 値 を 表 し た(平 均 値 ±SD)。Nanog(A)はES細 胞 の マ ー カ ー 遺 伝 子 で あ り 、Nestin(B)、

Musashi‑1(C)は 神 経 幹 細 胞 、MAP‑2(D)は 神 経 細 胞 、GEAP(E)は ア ス ト ロ サ イ トの マ ー カ ー 遺 伝 子 で あ る。(*P<0.05ESCと 比 較 、**P<0.05NSCと 比 較)

図3マ ウス 神 経 幹 細 胞 に お け るNecdin抗 体 を 用 い た 蛍 光 免 疫 染 色

NSS法 に よ りマ ウ スES細 胞 か ら調 製 した 神 経 幹 細 胞 を 、DAPIに よ る核 染 色(B)を 青 で 、 ま たNecdin(C)と 神 経 幹 細 胞 の マ ー カ ー で あ るNestin(D)に 対 す る抗 体 を 用 い て 、 そ れ ぞ れ 緑 と赤 に 多 重 染 色 し た。Aは 位 相 差 顕 微 鏡 画 像 を示 し、 白い バ ー は100μmを 表 す 。

図4マ ウス 神 経 細 胞 に お け るNecdin抗 体 を用 い た 蛍 光 免 疫 染 色

NSS法 に よ りマ ウ スES細 胞 か ら調 製 した 神 経 幹 細 胞 を 、N2supplementを 含 むD/F 培 地(分 化 誘 導 条 件 培 養 液)で4日 間 培 養 す る こ とで 分 化 させ た 神 経 細 胞 を 、DAPIに よ る 核 染 色(B)を 青 で 、Necdin(C)と 神 経 細 胞 の マ ー カ ー で あ るMAP‑2(D)対 す る抗 体 を 用 い て 、 そ れ ぞ れ 緑 と赤 に 多 重 染 色 した。Aは 位 相 差 顕 微 鏡 画 像 を 示 し、 白い バ ー は100

μｍ を表 す 。

図5マ ウ ス の ア ス ト ロ サ イ トに お け るNecdin抗 体 を 用 い た 蛍 光 免 疫 染 色

NSS法 に よ り マ ウ スES細 胞 か 調 製 し た 神 経 幹 細 胞 を 、N2supplementを 含 むD/F培 地(分 化 誘 導 条 件 培 地)で4日 間 培 養 す る こ と で 分 化 さ せ た ア ス ト ロ サ イ ト を 、DAPIに よ る 核 染 色(B)で 青 に 、Necdin(C)と ア ス ト ロ サ イ トの マ ー カ ー で あ るGFAP(D)に 対 す る 抗 体 を 用 い て 、 そ れ ぞ れ 緑 と赤 に 多 重 染 色 し た 。Aは 位 相 差 顕 微 鏡 画 像 を 示 し 、 白 い バ ー は100μ ｍ を 表 す。

培 養 日数

図6ヒ トES細 胞 か ら神 経 系 細 胞 へ の 分 化 過 程 に お け るNecdin遺 伝 子 発 現 変 化

ヒ トES細 胞 を ア ス トロ サ イ ト条 件 培 地 中 で20日 間 浮 遊 培 養 す る こ とで 神 経 系 細 胞 へ の 分 化 誘 導 を 行 い 、 細 胞 を 回 収 してmRNAを 抽 出 し、Necdin遺 伝 子 の 発 現 を リア ル タ イ ム RT‑PCR法 で 解 析 した 。 横 軸 に浮 遊 培 養 日数 を 表 し、 縦 軸 にNecdin遺 伝 子 発 現 量 の GAPDH遺 伝 子 発 現 量 に対 す る 相 対 値 を 表 した(平 均 値 ±SD)。(*P<0.05培 養0日 目

と比 較)

図7ヒ トES細 胞 、 お よび 神 経 系 細 胞 に お け るNecdin遺 伝 子 発 現 変 化

ヒ トES細 胞(ESC)、 ヒ トES細 胞 か らNSS法 に よ り調 製 した神 経 幹 細 胞(NSC)、

そ して 神 経 幹 細 胞 を ア ス トロサ イ ト条 件 培 地 で14日 間 培 養 し分 化 させ た 神 経 細 胞 (Neuron)に お け るNecdin遺 伝 子 の発 現 を リア ル タイ ムRT‑PCR法 で解 析 した 。 横 軸 に そ れ ぞ れ の 細 胞 種 を 表 し、 縦 軸 にNecdin遺 伝 子 発 現 量 のGAPDH遺 伝 子 発 現 量 に 対 す る 相 対 値 を表 した(平 均 値 ±SD)。(*P<0.05ESCと 比 較 、**P<0.05NSCと 比 較)

図8マ ウ スES細 胞 か ら神 経 系 細 胞 へ の 分 化 過 程 に お け るNecdinお よ び 神 経 系 細 胞 の マ ー カ ー 遺 伝 子 の 発 現 変 化

図1E‑Jの 縦 軸 で 示 され た 相 対 発 現 量 の 結 果 か ら 、 培 養6日 目 に お け る そ れ ぞ れ の 最 大 値 を1と し た と き の 相 対 値 を 縦 軸 に 表 し 、 横 軸 に 浮 遊 培 養 日数 を 表 し て 図 示 し た 。Pax‑6 (◆)、Musashi‑1(■)、Nestin(▲)は 神 経 幹 細 胞 の マ ー カ ー 遺 伝 子 で あ り 、MAP‑2(*)と NF‑M(×)は 神 経 細 胞 の マ ー カ ー 遺 伝 子 で あ り、Necdin(●)の 発 現 変 化 パ タ ー ン と 比 較 し た 。