け 多 剤耐性関連蛋 白 発現

金沢 大 学 十 全 医 学 会 雑 誌 第1 0 7巻 第1 号 3 3 ^‑ 4 3 (1 99 8)

グリ オ ^{ー マ} に おけ^る多剤 耐性 関連 蛋白^の発 現

金 沢 大 学 医 学 部 医 学 科脳 神 軽 外 科 学 講 座 ( 主 任^: 山下純 宏教 授)

毛 利 ^正 直

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グ リ オ^ー マの化 学療 法^の効 果 を 規定 する因 子と し て薬 剤 耐性は重 要であ り, 現 在 ま^でに さま ざま^な薬 剤耐 性 関 連 蛋 白^が 同 定さ れ て^いる^. また, 腫 瘍 細 胞^{に み ら れ る}多剤 耐 性 機 構^{のな か で P} 糖蛋 白^の関与しない多 剤耐 性 細 胞に は･ 多剤 耐 性 関 連 蛋 白 (^{m ultid ru gr e Sista n c e‑a S S O Ciated pr otein,M R P}) が発 現^{し て}耐 性 を担^っ て^いる^こと が知^{ら れ ている･} 本研 究^{で は}･ グ リ オ^{ー マ} の薬 剤 耐性に おけ^{る M R P の}役割 を 知^{る た め に}, 手 術 標 本^{とヒト グ リ オ 岬 マ}細 胞 株にお ける その発 現と薬 剤 感 受 性^の関 係に^つ いて検 索^{し た.} 対 象は, 手 術 時に採 取さ れ た グ リ オ ^{ー マ}組 織^{2 0}例 ( 膠 芽 臆^{1 1}例, 退 形 成 星状 細 胞 腫⁶例, 星状 御 砲 艦3例)･

正常 脳 組 織3例^{お よ びヒ ト グ1) オ ー マ}細 胞 株4種 類 (^{U 8 7 M G,}U 2 5 1 M G,U 3 7 3 M G,T 9 8 G) を用^いた^･ 手 術 標 本^{で は}, M R P

m R N A ^の発 現と蛋 白^{レベル の}局 在^を逆転 写 (r e v e r s etr a n s c ri_{p t}itio n,R T)^{‑P C R と}免 疫 組 織 化 学 を 用^{い て}観 察し た^･ その結 果,

M R P m R N A の発 現^は膠 芽 濃^{1 1}例 中9 例, 退 形 成 星 状 細 胞 膿6例 中3例に み ら れ, 免 疫 組 織 化学 的に は M R P は膠芽 腫^{1 1}例 中⁹ 例, 退形 成 星 状 細 胞 腺6例 中3例に陽 性^であ り 腫 瘍 細 胞^の細 胞 質 内^に顆 粒 状に発 現し^て いた^･ 星状 細 胞 腫お よ び 正常 脳組織^に

ぉ^いて は陽 性 所 見は み ら れなか ^った^. 腫 瘍^の悪 性 度に伴^いM R P 陽 性 腫 瘍湖 胞 数が増 加 す^る傾 向^{が み ら れ た･} 細 胞 株^{で は},

M R P のm R N A と蛋 白^の発 現 量 を そ^れぞ^れ定 量 的R T P C R と ウエスタンプロ ッ ト法 を 用^いて半 定 量 化し た^. す^べて^の細 胞 殊に ぉい て M R P ^のm R N A と蛋 白^の発 現が み ら れ た^. 細 胞 株 間^{の M R P のm} R N A お よ び蛋 白^の発 現 量^はいずれ^の方 法に お^いても u 8 7 M G で^の発 現が最 も 少^なく, ついで U 2 5 1 M G,U 3 7 3 M G, 耶 8 G の順に発 現 量は増 加し て^いた^. T 9 8 G ^のM R P ^のmR N A と蛋 白^の発 現 量は ともに U 8 7 M G の発現 量^の約4^.5倍であ^っ た^. 4 種 類^の薬 剤[^{ア ド リ アマイ シン}(^{ad ria m}ycin_,A D M), V P^‑1 6 (^エ ト

ポ シ ド) , シスプラチ ^ン(^{cis‑d ia m min ed ich lo r o}p l^atin um , C D D P) , ニ ム ス テ^ン【nim u sti_{n e}

, 1^‑(^{4‑a min o‑2‑m et}h y ト5^‑ p yrimi dinyl)m eth_yl^‑3^一(2^‑Chlo r o ethyl)^‑3^‑nitr o s o u r e a,A C N U]] ^に対 す^る薬 剤 感 受 性 試 験^{で は, い}ずれ^の薬 剤に対し てもU 8 7 M G の5 0 % 増 殖 抑 制 濃 度 (^{50 % inh ibito r}y c o n c e ntr atio n ofc ell _gr o wth,I C5 ｡) が最 も 低か^っ た^･ T 9 8 G は耐性 度^が最 も 高 くU 8 7 M G に 比^べて A D M に対し て 2 8 胤 V P^‑1 6 に 4 9 倍, C D D P に 8.3 倍, A C N U に 1 7倍^の相 対 耐 性 度 を 有し て^いた^･ A D M , V P^‑1 6 と c D D P に村 する薬 剤 耐性 度は, U 8 7 M G, U 2 5 1 M G, U 3 7 3 M G,T 9 8 G ^の順に増 加し^てお り各細 胞 株 間^{のM R Pの m} R N A お よ び蛋白

の発 現 量と よく 相 関し て^いた. し か し, A C N U に対 する薬 剤 耐 性 度と M R P ^の発 現 量^の間に は明ら か な関連 性は認め ら れ な か

っ た. M R P ^の発 現 量が最 も 多^いT 9 8 G を 使 用し て M R P に特 異 的な^{ア ン}チ セン スオ リゴ ヌク^レオ チ ドを 投 与し, M R P の党 規 抑 制に伴 う 薬 剤 感 受 性^の変 化 を^{ア ンチ セン スオ リゴ}法^{に て}検 討し た^{･ ア ン}チ セン スオ リゴ ヌク レ オ チ ド投 与に よ る M R P 蛋 白^の 発 現 量はコ ント^{ロ ー ル の}発 現 量に 比 し て約2 5 % に減 少し て^いた. ア ンチ セン スオ リ^{ゴ ヌ}クレオ チ ド投 与 彼^のA D M , V P^‑1 6 と C D D P に対 す^{るI C}5 ｡情^{はコ ントロ ー ル のI C}5 ｡値に比し て有 意に低下 し^ており, そ れ ぞ れ^の薬 剤に対す る感 受 性^{はコ ントロ ー ル} に比し て 6^.2倍, 6^.6倍, 4^.3倍に増 加し て^いた^. A C N U に対 す^る感^l受性^{に は}変 化は み ら れ な かっ た^･ 以 ヒの結 果か ら･ グ¹) オ

ー マ組 織^{に お}ける M R P の発 現は そ^の悪 性 度と薬 剤 白 然耐 性に関 連し て^いるも^のと推 定さ れ た^･‑‑ ^･ノノ, ヒト グ リ オ ^ー マ細 胞 株 に お^いて は M R P が多剤 耐 性に関 与し て^いること が示 唆^{さ れ た.}

K ey ^{w o r}ds m ulti dr u g ^{r e s}ista n c e^‑a S S O Ciated _pr otein_･ glio m a_, Ch e m othe r ap y^{, a n}tis e n c e Oli_go n u cle otide

グ リ オ ^ー マは

, 原 発 性 悪 性 脳 腫 瘍^であ り 浸潤 性^に発 育 する た め外 科 的 治療に よ る仝 摘 出は困難であり, 放 射 線 療 法, 化 学療 法お よ び免疫 療 法^の併 用^{に よ る}集 学 的 治 療^が行わ れ て^いる. し か し, これ らの治療に対 する反 応性^が低^いた め現 在^の治 療 成績 は必 ずしも 満 足^できるレ ベ ルに達^{し ていない.} 中でもグ リ オ^ー

マの化 学 療 法 剤^に対 する感 受 性はきわ め て低 く, 血 液 脳 関 門^の

存 在^{に よ る}薬 剤 到 達 性^の問題¹⁾や腫 瘍 細 胞 白 身が薬 剤 耐 性 を 有 し^{て い}ること が臨 床上^の大 き な 問題 点^{と なっている.}

其 剤 耐 性^に関 与する機 序と し て腫 瘍 細 胞^のP 糖 蛋白^の発 現^が 知ら れ て^いる が, P糖 蛋 白^{は A T P をエ}ネ^ルギ ^ー 源と し て薬 剤 を 細 胞 外^に排 出し て耐 性を獲 得し て^いる^こと が知ら れ ている^2):与)

現 在 まで に グ リ オ ^ー マに おける P糖 蛋 白^の発 現に^ついて は ^一部

平 成⁹ 年^{1 1}月1 2 日受付, 平 成^{1 0}年¹月^{1 6} 日受理

A b br e viatio n s : A C N U , 1^‑(^{4‑a r nin o‑2‑m eth}yl^‑5^‑_{p y}rimi dinyl) ^{m eth}yl^‑3^‑(^{2‑Ch lo r o eth}yl)^‑3‑nitr o s o u r e a; A D M ,

ad ria m y^cin;b_p,ba s e p^air s; C D D P, Cis^‑dia m mi_{n e}dichlo r opl^atin u m;F B S,f6tal b^ovi n e s e ru m; G A P D H, gl_yc e r aldeh_yde^‑

3^‑_ph o sphate deh ydr og^{e n a s e};I C_{5 0}

,5 0 % inh ibito ry c o n c e ntr atio n of c ell _gr o w 恥 ^{M D R l, m ultid ru} g ^{r e S}istan C el_;M R P,

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の腫 瘍湖 胞お よ び腫 瘍と 正常^の境 界に存 在 する 血管 内皮に陽性 であ^{る とい}う 報 告があ^{る4)5 ). し か し}なが ら, P 糖 蛋 白^は腫 瘍 内

の血管 内皮に は発 現 を 認め ない こと や P 糖 蛋 白 陽 性 腫 瘍 細 胞^の 割 合が少 な^{い こ と よ}り^{グ リ オ ー マ に お}け^る薬 剤 耐 性^{に は}他^の耐 性 国 子^の存 在が考 えら れ る^. グ リ オ ^{ー マ} に おけるその他^の薬 剤 耐 性 因 子と し て, 細 胞 内^での薬 剤 不 活 性 化 物 質^{と し て}作 用^し薬 剤 耐 性に関 与し て^いるメタ^ロチ オネ イ^ン6)や グ^ルタ チ オ^ンS^‑ト ラン ス フエラ ^ー ゼ⁷⁾の発 現, 薬 剤の標 的物質^{である 1､ ポ イソ メ}

ラ ^ー ゼの遺 伝 子 変 化^や遺 伝 子 増 幅に よ る ト ポ イ^{ソ メ}ラ ^ー ゼ阻 害 剤^に対 す^る耐 性⁸⁾, D N A 修 復 酵 素^である 0 ^6‑メチ^ル グ ア ニ ン^ー D N A ^メチ^ルト ラ^{ン ス フ ェ ファ ー} ゼ活 性^の上 昇に伴 うア^ルキ^ル 化 剤耐 性⁹⁾など が報告さ れ て おり 様^々な 方 面か ら研 究が進め ら れ て^いる^.

最近, P糖 蛋 白が関 与し て^いな^い多剤 耐 性 細 胞株^の細 胞 膜や 小 胞体 膜に分 子 量^{1 9 0 k D aの}膜 蛋 白^が発 現^{し ている こ と が}報 告 さ れ多剤 耐 性 関 連 蛋 白 (m ultidru g ^{r e S}ista n c e^‑a S S O Ciated pr otein,

M R P) ^と命名 さ^{れ た10). M R P は P}糖 蛋白 と同^{じ A T P} 結 合膜 輸 送 蛋白^{の ス ー パ ー フ}ァ ミ リ ^ー に属 する が M R P のア ミノ酸 配列は P 糖 蛋白^{の アミノ}酸 配 列^と相 同 性^は低 く, 正常 組 織^{に お}ける分 布 も 異 な^{っ ていること が}知ら れ て^いる^. M R P は比 較 的 新^しくそ の存在^が知^{ら れ る よ}う^にな^っ た蛋 白^で様^々な細 胞 株^や臨 床 材 料 での M R Pの発 現と薬 剤 耐 性^への関与^の研 究^{1 1)12)} が進め ら れ て いる が, グ リ オ^ー マに おけるそ^の発 現や薬 剤 耐 性に関する機 序 は十分 解 明さ れ て^いな^い. そ^{こ で}本 研 究で は, グ リ オ ^{ー マ}組 織 標 本に おける M R P ^の発 現を逆 転 写 (r e v e r s e tr a rl S C ri_{p t}io n_, R T)^‑ P C R と免疫 組 織 化 学 的 手 法^を用^いて検 索^{し た.} また, M R P の

発 現とそ^の薬 剤 耐 性^への 関与を検 討 する た め に M R P に特 異 的 なア^ンチ^{セ ン ス}オ リ ゴ^ヌク レ オ チ ド投 与に よ る M R P 発 現 抑 制 と そ れ に伴う 薬 剤 感 受 性^の変 化 を^ヒト グ リ オ ^{ー マ}細 胞 株 を 用^い て検 索^{し た.}

材料^{お よ}び方 法

Ⅰ^. 材 料

1 9 9 6年か ら 1 9 9 7年 ま^での間に手 術 標 本が採 取さ れ た 2 0例^の グ リ オ ^{ー マ}を 用^いた^. その痛理組 織 学 的 分 類に^ついて は, 世 界 保 健 機 構 (^{Wo rl d He alth Or}ga niz atio n) 脳 腫 瘍 分 類^に従っ た¹³⁾.

内 訳は膠芽 腫短^{1iobla sto ma},gr ade Ⅳ)¹¹ 例, 退 形 成 星 状 細 胞腫 (^{a n a}pla stic a str o cy to m a, gr ade Ⅲ) ⁶ 例, 星 状 細 胞 腫 (a str o cy to ma,gr ade Ⅱ) 3例^であ^{っ た.} 対 照と し て は, 3例^の脳 腫 瘍以外^の手 術で得ら れ た正 常 脳 組 織を用^い た^. R N A と蛋 白

の抽 出 用 標 本^は手 術 摘 出 後 速^{や か に}液 体 窒 素^で凍 結^し, ‑

1 3 5 ℃で保存^{し た.} 免 疫 組 織 化 学 用に は, 4 % ^パラ ホル ムアル デヒド に て標 本 を 固 定後^{パラフ ィ ンに て}包埋^{し た. ヒト グ リ オ}

ー マ 由来^の細 胞 株と し て U 8 7 M G,U 2 5 1 M G,U 3 7 3 M G,T 9 8 G ^の4 種 類 を使用^{し た.} 各 細 胞株^の培 養^{に は}, 1 0 % 牛 胎 児^血清 (^fetal bovin e s e ru m, F B S) (G ibc o,Gr a nd Is r a nd,U S A), 0^.3 mg/ ml グ ルタ ミ^ン(^日水 製 薬, 東京), 1 0 0 U/mlペ ニ シ リ^ン (和 光 純 薬,

大 阪), 1 0 0 m g/ml ^スト レ プト^マイ^シン (和 光 純 薬) を 含^{ん だ} R P M I 1 6 4 0(^日水 製 薬) 培 地^{に て}湿潤3 7℃, 5 % C O2の条 件 下で 培 養し た^.

Ⅰ. 手 術 摘 出 標 本に お け る実 験

1^. R トP C R l)^{P C R} 用^{プ ラ イマ ー}

ヒト M R P の塩 基 配 列^{10 )1 4)15)よ}り, M R P に特 異 的な セン ス プ ラ イ マ ^ー として 5^,‑A G A A C C T C A G T G T C G G G C A G C G^‑3^, (4 4 7 9 ^‑4 4 9 9) , ア ^ンチ セ ン ス プ ラ イ ^{マ ー} と し て 5 ^'‑ T C G C A T C T C T G T C T C T C C T G G G^‑3^'(^{4 9 8 5‑5 0 0 5}) を 設 計^し, 合 成

は 日本^バイ オ サ ^ー ビス( 埼 玉) に依 託し た^. 内 部^{コ ン}ト^{ロ ー} ル に は グ リ セ^ルア^ルデ^ヒト 3^‑リ^ン酸 脱 水 素 酵 素 短¹yc e r aldehyde^‑

3^‑Ph o sphate dehydr oge n a s e, G A P D H) を用^い, プ ラ イ^{マ ー} と し て は既 製 品 (^{Str ata}ge n e, LaJ^olla, U S A) を 使 用^{し た.} そ ^の 塩 基 配 列 は , セ ン ス プ ラ イ ^{マ ー} は 5 ^,‑ C C A C C C A T G G C A A A T r C C A T G G C A^‑3^'(^{2 1 3‑2 3 6})^{, アンチ セン}

スプ ラ イマ ^ー は 5^'T C T A G A C G G C A G G T C A G G T C C A C C^‑3^'(^{7 8 7‑} 8 10)であった^.

2) 総^{帥 A の}分 離と R T ゼC R

総R N A ^の抽 出 精 製^は, C ho mc zyn sk i ら^{1 6)の}方 法に基^づいて,

Is oge n ( ^{ニ ッ ポンジ ー ン}, 東 京) を 用^{いた. R T‑P C R}反 応は_, R N A P C R キッ ト(^Pe rk in^‑E l^m e r_, Br a n ch bu rg^,U S A) を 用^いた. す なわち, 0^.6 pg の総R N A を鋳 型と し,ランダム ヘ キ サマ ^ー を プ ラ イマ ^ー と し て逆 転 写 酵 素^{に てcD N A} を 合 成し た^. 次^に各

m R N A に特 異 的な プ ラ イマ ^ー を 用^いて, Taq ポ リメラ ^ー ゼ に て

cD N A 断 片^の増 幅^を行^{った. P C R} 反応に は D N A T he r m al Cycle r

4 8 0 (Pe rkin^‑Elm e r) を使 用し た^. 反応は, 9 4 ℃ で 3 分 間^の熱 変 性 後, 9 4 ℃で 1 分 間, 6 0 ℃ で 1分 間, 7 2℃で 1分 間^の3 ^ステ ッ

プを1 サイク^ルと し て 3 0 回 増 幅し た^. 増 幅 後^のP C R 反 応 産 物 は 2 % ア ガロ ^ー スゲ^ルに て電 気 泳 動し, エ ナ ジ ウ^ムブロ マイ ド に て染色 後, 紫 外 線 照 射 装 置Fa s^‑Ⅱ 汀oyol) 0, 大 阪) を 用^いて 検 出し た.

2. 免 疫 組 織 化 学

4 % ^パラ ホル ムアルデヒ ドで固 定後, パラフ ィ ンに包 捜し た 標 本^より厚さ 4 ^{m m の}切 片 を 作 製^し, ポ リ^ーし リ ジ^ン(和 光 純 薬) 処理^スライド グ ラス上 に張 り付 け 乾 燥さ せ た^. キ シ レ^ンを 用^い

て脱^{パラフ ィ ンし},

1) ^ン醸 積 衛 生 理 食 塩 水 (pho sphate^‑bufEe r ed

s alin e,P B S) で洗 浄 後, マ イ ク^ロ ウ^{エ ー} ブ処理を 行^{っ た. 0.3 %} 過 酸 化 水 素 加^{メタノ ー ルで}内 因 性^{ペ ル}オ キ シ ダ^ー ゼを 失 活さ せ, P B S で洗 浄 後, 非 特 異 的 反 応 抑 制^のた め, ブロ ッキ^ング抗 体 (^正常ウ サ ギ 血清) を 宅 温^{で 2 0}分 間 作 用さ せ た. 次に, 一^→次 抗 体と し て 4 0 倍に希 釈し た ラ^ッ ト抗^ヒト M R P ^{モ ノ}クロ ^ー ナル

抗 体 M R Prl^{1 7)}(^{ニチ レ イ,} 東 京) を室 温^{で 1} 時 間 反 応さ せ た後,

二次 抗 体^の ビ オ テ ン化^{ウ サ ギ}抗^{ラ ッ ト I}gG抗 体 (^{Ve cto r} bv o r at_orie sIn c^._,Bu rling^{a m e},U S A) を室 温で 3 0分 反 応さ せ た^. アピ ジン^ービ オ ナ ン^ーヾルオ キ シ ダ ^ー ゼ複 合 体 (^{a vi din e‑b iotin}‑

pe r o xida s e c omple x) 法と 0^.0 0 5 % 過酸 化 水 素 加0^.0 2 % ジアミ^ノ ベ ンチ ジン(^{3‑3'‑dia min obe n zidin e}) (^{S i}gm a,St.Lo uis,U S A) 処 理 に より 発 色^{さ せ},

ヘ マ ト キ シ リ^ンで核 染 色 を 行^っ た^. 朋【. ヒ トグリ オ ^{ー マ}細 胞 様に お け る実 験 1^. 定 量 的K ｢ P C R

M R P m R N A ^の細 胞 株に おける発 現 を 定 量 化 する た め定 量 的 R T P C R を 行^った^. 前 述^と同 様^のプ ラ イマ ^ー を 用^{いて M R P と} G A P D H につ いて反 応サ イ ク^ル数が 2 0 ^〜 3 6回^のR T^‑P C R を 行

い

, 検 定 曲 線^を作 成^{し た1即 9 ).} 増 幅彼^{のP C R}反 応 産 物^{は 2 % ア}

m ultidr ug ^{r e s}ista n c e^‑a S S O Ciated _pr otein; M ^′I T ,3 ^‑(⁴,5^‑dim eth_ylth ia z ol^‑2^‑yl)^p2,5^‑d i_ph e nyltetr a z oliu m br o m ide; P B S ,Pho sp h^ate‑b ufftr ed sal in e; R T,r e V e r S etr an S Cri p^tio n