低 分子量 イ 研究 硫 酸 生物活性 関す

764 金沢大 学 十全 医学 会 雑 誌 第9 1巻 第5 号 7 6 巨 77 6 (¹98 2)

低分 子 量 ^{コ ン} ド ^ロイ ^{チ ン ポ リ}硫酸^の生 物 活 性 ^に関 する研究

金 沢大学 医学 部病理学 第^二講 座 (主 任^: 太 田 五 六教授) 同 (指導^: 放石川 太 刀 絶丸 教授)

伊 賀 吾 ^郎

( 昭和^{5 7}年⁹ 月^{2 0}日受 付)

哺乳 動 物の軟 骨か ら抽 出した^{コ ン}ド^ロイ テ^{ン モ ノ}硫 酸を半 合 成 的に硫 酸 化し て得た^{コ ン}ド^ロイ テ^ン ポ リ硫 酸 (^cho ndr oitin polys ulf^ate, 以下C ho‑^{P S と}略) ^{に つ い}て, こ のものの生物 学 的, 薬理学的活性 を検 討し た. C bo ^‑ P S は推 定 分子量8 0,0 00 (Ⅰ), 8,0 0 0 (ⅠⅠ) お よ び 1,6 0 0(ⅠⅠⅠ) の 3種の ものを調製し 本研 究^に供し た. この う ち分_子量の最も小さ^いC bo ^‑P S III が, 抗 凝 固 活性を ほ と ん ど 示 さ な^いのに非常

に高^いリ ボ プ^ロ テイ ン^･ リ^{パ ー} ゼ活 性を有し ていた. ま た^コ ラ^ー ゲン添 加^によっ て誘発さ れ た血小板凝集

に対し て も, C hor P S III は 4 4 7_J^Lg/ ^ml の添加 濃度で対 照 債の 5 0% ま で抑制し た^. ま た C ha ndle rlo op法 を 用^いた血 栓^の生 成 時 間^でも,C ho ^‑ P S IIl は 0^.1 m g/^ml の血液添 加な ら びに 3 ^〜3 0 m g/k_{g の}静脈内 投与

によ り, これ ら血 液^から^の血 栓^の形成を有 意^に遅 延さ せ た. ま た 2 1 週 間のラ ノ リン負荷 家兎^の大動 脈粥状 硬 化 症^に対し て も C h^{o ‑} P S III は有 意の抑 制 効 果を 示 し た^. す な わ ち, 同負 荷 中^に3 0 ^〜9 0 m g/kg/day の C ho ^‑ P S III を 1 3 週 間 与え る と, 血 中お よ び大 動脈 壁の^コ レ ステ^{ロ ー} ルお よ び中性 脂 肪が有 意^に減 少し,

形 態 学 的に も大動 脈 内 膜^の粥状 硬 化が弱かった.

E ey ^{w o r}ds コ ンド^ロイ チンポ リ硫 酸, コ ン ド^ロイ チン モ ノ硫 酸^, リ^{ボ プロ}テイ ン ^･ リパ ^ー ゼ活 性

多 糖体ポ リ硫酸^エステ^ルである^ヘパリ^ンお よ び^へパ リノイ ド は, 血 液凝 固 阻止作 用, 脂 血 清澄 作用, 血 栓 形 成^およ び血 小 板粘 着の抑 制作用 な ど多く の生 物 活性 を有す ること で知ら れ て^いる¹⁾. 近 年,La n e ら²⁾お よ び Ba r r o w cliffe ら³⁾は^{ヘ パ}リン の分子量と抗 凝 固 活 性と の 関 係^について報 告し て お り, ヘパリ^ンの抗凝固作用 は 分子 量 の低 下^に伴^って減 少す る が, 抗 血 栓作 用( 抗Ⅹa

活 性) は逆^に著る し く増 強さ れ る と述^べて^いる. しか し脂 血 清澄 作用 は抗 凝 固活 性の減 少と と も^に消 失す る こと が De S w a rt ら^によ り報 告さ れ て^いる^4).

著 者ら は, 以前よ り^コ ンド^ロイ テ^{ン モ ノ}硫 酸^につい て分子量と生物 活性^の関 係を検 討し, 低 分子化^に伴っ て種々 の生 物活 性が変 化す ること を見 出し て^いる^5)6). 本 研 究で は, コンド^ロイ テ^{ン モ ノ}硫 酸を低 分子化し た

の ち ポ リ硫 酸 化し て低 分子量コ ンド^ロイ テンポ リ硫 酸 を調 製し, この も の が ど^のよ う な生物 活 性を有す る か

ヘパリ^ン, コ ンド^ロイ テ^{ン モ ノ}硫 酸お よ び デ キストラ ン硫酸な ど と 比較検 討し, 興 味あ る 知見を得たので報 告す る.

材 料およ び方法

1 ^. コ ンド^ロイ チ^{ン モ ノ}硫 酸 (^cho ndr oitin m o n o^･ s ulfate,以下C ho‑ ^{M S と}略) ^:C ho‑ ^{M S の原末とし}

て市販のコ ンド^ロイ チ^ン硫 酸^‑ A(ミ ド リ十字製) を用 いた. こ のも^{の の}分子 量 は還元末 端基数の測定結果^か ら 3 7,5 0 0 (C ho ^‑ M S I) と推 定さ れ た. こ の50g に 0^.0 5 N 希 塩 酸1 1 を加え て 1 0 げC^にて最 高6時間ま^で 加 熱し た. こ の間, 経 時 的^に水解 処理液を サ^ンプリニ

グ し て還元末端 基 数を測 定し,分子 量⁴,0 0 0( C bo‑^れiS

II ) ^およ び 8 00 ( C h^o‑ M S III) ^の低 分子 量 C h^o‑^{M S}

を得た の ち, エタノ ^ー ル にて沈殿 さ せ, 減圧乾燥し^て 乾 燥 末を得た. これ らの分子鼠 極 限 粗 鼠 有機^イオ

B iologic al A ctivi_{t y} of Lo w M ole c ula r W eigh ^{t C ho ndr oitin P ol}y^{s u}lfate. Yo shiro I_ga,

D ep^{a r}tm e nt of Patholog y (^{I I}),Sch o ol of M edicin e

, K ana z a w a U niv e r si_{t y}.

コ ンド^ロイ チ^ンポ リ硫 酸の生物 活 性

ゥ含量^は表1 に示 す如くであ る^･

Table l. P hysic o che mi_{c a}l pr ope ^rt ie sof C ho^‑M S a nd C ho^,P S

C bo^‑M S Sulfatio n C bo^･P S

7 65

C h^o‑M S

｡㌘^{01e c ula r w} 粁 ^S 需^{e nt C ho‑P S [ か S c o n( % )te nt diS Os a c c4hga rr O uidp pe unie rt}

Ⅰ 3 7^,5(

.^{)0 0.6 5 0 6.7 I O.5 06 16.1 4}

ⅠⅠ ^4,0(^{汀) 0.1}84 4■9 ⅠI O.1 29 1 6.4 ⁴

ⅠⅠⅠ 80 (

.^{j O.0 3 3 tr a C e ⅠⅠI O.030 16.4 4}

Cho^‑M S: Cho nd^{r o}itin m o n o s ulfate

C ho^･P S: Cho nd^{r o}itin p^ol ys ulfate

Cn ‥Chainp^{u mbe r w eight} [d^{: intri}9^{S I C vis c o sit y}

S: O rga n l C S ulfu r c o nte nt

p｡ S Sible ch_{e m}ic alstr u ctu r e of s emi synthe siz ed cho ndr oitin poIys ulfate( C^ho･P S )

C O O H

H O S O:iNa

Sulfated G luc u r o ni_{c a c}id

2 ^{. コ}ンド^ロイ テ^ンポ リ硫 酸(^cho ndr oitin polys ul^‑ fate, 以下C ho ^‑P S と略)^7一: C ho ^‑ M S I , II お よ び IlIの乾燥 末を それ ぞ れ10g ずつ1 5 0 ml の ホ ル ムアミド に溶かし,次い で水 冷 下^{で クロ ロ ス ル ホ ン}酸30 ml を滴 如し,こ の のち室 温に て 10 時 間静 置して硫 酸^エステ^ル ヤヒ反応を行^った. 次^に, 炭酸 ナ ト リ ウ^ム末を加え て液

の pIl を中性にし,これに9 5% ^エタノ ^ールを約1 0倍量 添カロして粗製C ho‑ P S の沈殿を得た.沈 殿は水1 00 ml に溶^かし, これに十分 量の 1 M 塩 化^バリ ウム液を加え て 沈殿物^を除 去し たのち,H⁺型陽イ オン交換 樹 脂^{カ ラ}

ム に通して爽雑物を除 去し,1 N 水酸 化ナ ト リ ウ^{ム に} て中和し, 凍 結乾 燥してC ho‑ ^{P S I} , II, IIIの原 末 をそ れ ぞ れ得た. これ ら^の物理化 学 的性 状は表1 に み られる通りで_,C ho‑^{P S の}推 定 化 学構 造式 も併せ て表 1に掲げ た^.

3 ^{･ ヘパ}リ^{ン :} ブ タ腸 粘 膜^から 調製さ れ た局方^{ヘ パ} リン ナト リウ ム (^ミド リ十 字) を 用^いた.

4 ･ デ キ^スト ラン硫 酸^: M D S一^{往 (コ ー ワ) を用い}

た.

5 ･ 抗血液 凝 固作用^の測 定

1) ト^ロ ンポ プ ラステン凝 固阻止作用 ( ^ヘパリ^ンカ

価)^: 目局 標 準^{ヘ パ}リンナ ト リ ウムを対 照^に,検体の^ヘ パリンカ価を 2 単位/^mlおよ び 1^.6 単 位/ml^に調 製し たのち,各標 準 液^およ び試料 液1 mlにウシ の脳^からの トロンボ キ ナ^ー ゼ抽 出 液0.2 ml, 硫 酸ナ ト リ ウ^ム加ウ シ全血 1 ml を加え て 血液 凝 固時 間を測 定し, 2 用 量法

にて^{ヘ パ}リ^ン単 位を求め た.

2) 全血 凝固時 間^:体重約2 kg の家 兎^にC ho‑ ^{P S}

I , ⅠⅠ, ⅠⅠⅠ, C bo‑ ^{M S I およ び デ キスト ラン硫 酸を}

そ れ ぞ れ 3 ^〜3 0 m g/kg,ヘ パ^l) ^ンは 0^･1 ^〜10 mg/k_g を 静脈 内^に投 与し, 投 与 後2 0 分^の血液^{につ い て} Le e‑

W hite 法町こ従って投 与血液^の全血 凝固時 間を測 定し た.

6 . リ ボ プ^ロ テイ ン^･リ^{パ ー}ゼ(lipopr oteinlipa s e,

以 下 L L と略)活 性^の測 定^: 体重約2 kg の家 兎^にC ho

‑^{P S I , ⅠⅠ, III, C ho}r ^{M S I , デ キスト ラン硫 酸ま}

た は^ヘパリ^ンを 3 ^〜3 0 mg/kg 投 与し, 投 与後2 0 分^に 3.8%ク^エ ン酸ナ ト リ ウ^ム液を含む注 射簡^{に て}採血 し,

2 0 00 回転, 10 分 間 遠心 し て投 与 後血 祭を得た. 対照^に は生理食 塩 液^{1 m}l/kg を投 与し た^. 各 投 与後血祭の L L 活性^を以 下の方 法^で測 定し た^.

1) 濁 度法^{9) 1 0):}投 与 後血祭0^.5 ml, 2% ^{コ コ}ナッツ

7 6 6 伊

油 乳 液 (¹ⁱpo str ate ^‑C B,E d iol,Calb io che m ,U S A) 0^.1 ml, 1 0% ウ^シア^ルブミ ン(pH 8^.4)0^.5 ml^, 0^.5 M ギ酸アン モニ ウム0^.1 2 5 ml を混 和し,37⁰C ^にて 2 時間 温 浴中^で加温し た.反応 混 液^{について 6 4 0 n m の 吸}光 度 を加 温 前と加温2時 間 後^にそ れ ぞ れ測 定し,L L 活性( 脂 血 清澄 活 性) を吸光 度^の差^△ 0^.D^.に て示 し た.

2) 遊 離 脂 肪酸 測 定 法^{1 1)1 2)}:L L 活 性を基 質乳 液^の分 解 能^つま り遊 離 脂肪 酸の生成 速 度(fr e efat t y ^{a c}id l O^‑9

eq/hr/^mlofpla s m a) と して測 定し た. 測 定試 薬は,

N E F A ^‑te St キッ ト( 和 光) を 用^いた. 方 法は投 与後 血 紫0.2 ml, 2 % コ コナッ ツ油 乳液0^.2 ml, 10% ウ^シ アルブミ ン0^.2 ml,0^.5 M ギ 酸アン モ^ニウム0^.0 5 ml を 順 次試 験 管に加え て 混和し, 直ちに3 7⁰C,20 分間正確

に温浴 中で加温し た^. 次^{い でヘ}プ タ

.^{ン ･ クロ ロ ホル ム}

混液(1 ^: 3) 6 ml を加え て 反応を停止 さ せ, 網 試液 2 ml を加え て 2 分間以 上強く 振と う抽 出を行った. こ の の ち 3,0 0 0 回転, 5 分 間遠心分 離し, 上清^の抽 出 液 2 mi を と り, これに発 色試 液2 ml を加えて 4 8 0 n m の 吸光度で測 定し た. 既知 濃 度の標 準脂 肪 酸か ら作 成し た検量 線よ り投 与後血衆¹ mlおよ び1時 間 当た り^の遊 離 脂肪 酸の生成 量を算 出し た^.

7 ^. 血 小 板 凝 集 阻止作用 の測 定^{1 3):}体重 2^.5^〜3^.O kg の家 兎を用^い,頸 動脈よ り ク^{エ ン}酸 塩を 用^いて血 液 を採取し^{, こ}れ を 1,0 0 0 回転, 1 0分 間遠心 し て多血小 坂 血 祭(P R fりを得た.P R P O^.5 ml を と り,3 7⁰C,1,2 0 0 回転で約3分 間渡 拝し, 液温を 3 7⁰Cにし たのち種々の

濃 度の C ho‑ P S 溶 液5 0/バ お よ び 0^.1% コ ラ^ー ゲ^ン溶 液 (H olm) 6_JJl を加え, 血 小 板 凝集^によ る透 過 率の 変 化を測定し た. この凝 集を 5 0% 抑制す る薬物^の添 加 濃 度I C ^‑5 0(〃g/ml) ^で表わ し阻止効 果の指標と し た^.

餌^■ , 12rp^m

8 ^･ 血栓 生 成 抑 制作用(in vitr o) の測 定‥C ho ^‑P S 添 加ま た は投 与^の家 兎血液を 用^い,生理食 塩液添加 囁 与)血液を対 照に,Co n n o r らの報 告^{1 4 )に}従って C ha ndl^.

e rlo op 法^{1 5 )に}よ り 血栓生成 抑 制作用 を そ れ ぞれ測定し

た･ す な わ ち 血栓を 生成さ せ る た めの回転 装置は, 図 1 に示 す如く,回転盤が水 平 面よ り 8 0 度^に立ち,12rpm の速 度で 回転す る も^のを 用^いた̀ 薬 物^{のC b}o ^‑P S nl,

デ キスト ラ^ン硫 酸,C ho ^‑ M S I を家 兎血液1 mi 当た り 0^･1 ^mg 添 加し, ヘパリ^ンを臨 床常用 血中 減摩^の1^.25 u/^皿1 およ び半量^の0^･6 2 5 u/^ml の濃 度に添加し た血液 を 用^いた･ ま た投 与 実験^{で は}, C ho‑P S III l ^〜30mg/ k_g, C ho¶^{M S I l O mg/kg, ヘパリン1 0 0}u/kgをそ れ ぞ れ家 兎^に静脈 内投 与し, 投 与後1 時 間およ ぴ3時 間後^に採 取し た ク^エン酸塩 加 血 液を実験^に供し た. こ れ ら 血液を 1 ^ml ずつ内径3 m m ,長さ 2 7c m の プラ ス チック^･チ^{ュ ー} ブに入 れ,0^･2 5 M 塩 化カル シウム液0^.1

ml を加え たのち,これ よ り ^一姫 り大きい内径5 m 恥

長さ 1^･5c m の シリ^コン･チ^{ュ ー} ブにて チ^{ュ ー}ブの両端 を接 合して ル^ー プ と し, 回転盤^に懸 架し て^{ル ー}プを回 転さ せ た. この と きの回転^{ル ー プの}血液^の尖端レ ベ ル

の位 置を分 度 器^にて測 定し, こ の値よ り 血液レ ベルが 4 度以 上低 下し た と きの時 間を 血栓生成 終点とした.

血栓 生成 時 間は, 塩 化カル シウム液^の添 加時点か ら生 成 終 点ま で を^ストップ ウ オッチ で測 定し た^. なお, 反 応は 24 ^〜2 6⁰Cの室 温で行^った.

9 ^. 実験 的家 兎 粥状 硬 化 症に及ぼ す抑 制効果(経口

投与 実験)

1) 実験 方法^: 体重約2 kg の雄 性 家兎を 用 巧 ^これ にカロ水ラノリ^ン( 局 方) を 10% 量飼 育用固形飼料帽 本ク^レア C R ^‑2)^に添 加し た も^のを 21 週^にわ たって自

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B E F O R E A F T E R

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