細 胞 資 源 工 学

細 胞 資 源 工 学

教 授 服 部 征 雄 （ 薬 学 博 士 ）

助教授 横 津 隆 子 （ 学 術 博 士 ） 助 手 宮 代 博 継 （ 薬 学 博 士 ） 技 官 中 村 憲 夫 （ 学 術 博 士 ）

本部門では，和漢薬資源の恒久的維持，育成を図るため，薬用生物に関する細胞工学的研究を 行なうと同時に，動植物細胞の持つ遺伝情報を解析して，その薬用資源開発への応用，あるいは 微生物および動物細胞を用いて生理活性物質の探索，和漢薬の薬効発現機構の解明を行なうこと を目指している。本年度の主な研究テーマと成果は下記の通りである。

I.腸内嫌気性菌によるバイオトランスフォーメーション

腸内細菌による

s e c o i s o l a r i c i r e s i n o ld i g l u c o s i d e

e n t e r o l a c t o n e

P e p t o s t r e p t o c o c c u s

Eubαc t e r i u m

−

B αc t e r o i d e s

C −

m a n g i f e r i n

n o r a t h y r i o l

II.薬物の代謝活性化に関与する腸内細菌遺伝子

S e n n o s i d e

s a i k o s a p o n i n

m .

C r o t o n  t i g l i u m

HIV

p r o t e i n k i n a s e  C

1 2 ‑ 0 ‑ a c e t y l p h o r b o l ‑ 1 3 ‑ d e c a n o a t e

p r o t e i nk i n a s e  C

HIV

S t e p h αn iαc e p hα r αnthα

F K ‑ 3 0 0 0

HSV

N.腎疾患における病態の解明と治療薬の開発

増悪因子のフリーラジカルの関与について，細胞，臓器レベルで、検討するとともに，

G i n s e n o ‑

s i d e ‑ R d

。 著 書

1 )   Kusumoto  I .   T .   and  H a t t o r i   M . :   S e a r c h i n g   f o r   Anti‑HIV  Agents  among t h e   T r a d i t i o n a l   M e d i c i n e s .   e d .   by Watanabe H .   and Shibuya T . ,   Harwood Academic  P u b l i s h e r s ,  Amsterdum, 1 9 9 9 ,  p p .  2 1 9 ‑ 2 3 5  

2 )   I e n a g a  

. ,  T a k e u c h i  S . ,  Nakamura K . ,  Yokozawa T . ,  Oura H . ,  Aoyagi 

Nakano 

and Endou H . :   N Z ‑ 4 1 9 ,  an i n t r i n s i c  a n t i o x i d a n t ,  a s  a  t h e a p e u t i c  a g e n t   a g a i n s t   p r o g r e s s i v e   c h r o n i c   r e n a l   f a i l u r e   and  g u a n i d i n o   compounds. Guanidino  Compound i n  B i o l o g y  and M e d i c i n e :  5

e d s .  by C l a r k  J . F . ,   Mori 

and I s h i d a  M . ,   B l a c k w e l l  S c i e n c e  Pty L t d ,  A u s t r a l i a ,  1 9 9 9 ,  p p . 1 3 1

1 3 8 .

。 原 著

1 )   Yu Y . ,  Park J . ,   Lee J . ,   Kim G . ,  Jo S . ,   Byun M . ,  Miyashiro H . ,  and H a t t o r i  M . :   Screening o f  some p l a n t  e x t r a c t s  f o r  i n h i b i t o r y  e f f e c t s  on HIV‑1 and i t s  e s s e n t i a l   enzymes. Kor. J .  Pharmacogn., 2 9 :  3 3 8 ‑ 3 4 6 ,  1 9 9 8 .  

I n  o r d e r  t o  e l u c i d a t e  t h e  r e l a t i o n s h i p  between a n t i ‑ H I V ‑ 1  enzyme a c t i v i t y  and i n h i b i t i o n  o f   HIV‑1 r e p l i c a t i o n  by n a t u r a l  s o u r c e s ,  e x t r a c t s  from some p l a n t s  u s i n g  a s  f o o d s  and o r i e n t a l   m e d i c i n e s  were t e s t e d  f o r  i n h i b i t o r y  e f f e c t s  on t h e  v i r a l  r e p l i c a t i o n ,  r e v e r s e  t r a n s c r i p t a s e   (RT) ,  p r o t e a s e  and α g l u c o s i d a s e .  

t h e  anti‑RT t e s t ,  water e x t r a c t s  o f  F i c u s  c αr i c α ( l e a f ) ,   Houttuyniαc o r d α t α

a e r i a l  p a r t )  and I x e r i s  tamα g α ω αe n s i s  ( a e r i a l  p a r t )  showed more than  79% i n h i t i b i o n  a t  a  c o n c e n t r a t i o n  o f  1 0 0   μ  g / m l .  The p r o t e a s e  and αglucosidase i n h i b i t i n g   s a m p l e s  i n  t h e  s c r e e n i n g  were water e x t r a c t  o f  S y r i n g αd i  l a tα t α ( l e a f )  and methanol e x t r a c t   o f  H i b i s c u s  s y r iαc u s  ( l e a f  and s t e m ) ,  which showed more than 40% i n h i b i t i o n  a t  a  c o n c e n t r a ‑ t i o n  o f  1 0 0  

g / m l .  I n  t h e  primary a n t i ‑ H I V ‑ 1  t e s t ,   water e x t r a c t s  o f  Equisetum αr u e n s e   ( a e r i a l  p a r t ) ,   H i b i s c u s  s y r i αc u s   C l e a f ) ,   I x e r i s   t αmα g αwαe n s i s   ( a e r i a l   p a r t )   and P u e r

r α t h u n b e r g iαnα ( l e a f )  showed t h e  p o t e n t  i n h i b i t i o n  a g a i n s t  HIV‑1 i n d u c e d  c y t o p a t h i c  e f f e c t s .  

2 )   Hussein  G . ,   Nakamura N . ,   Meselhy  M. R . ,   and H a t t o r i   M . :   P h e n o l i c s   from  Mαy t e n u s  s e n e g αl e n s i s .  Phytochemistry, 5 0 :  6 8 9 ‑ 6 9 4 ,  1 9 9 9 .  

Two new m e t h y l a t e d  f l a v a n ‑ 3 ‑ o l  g l u c o s i d e s  and a  m e t h y l a t e d  p r o a n t h o c y a n i d i n  were i s o ‑ l a t e d  from t h e  MeOH e x t r a c t  o f  t h e  stem‑bark o f  M αy t e n u s  s e n e g αl e n s i s ,  t o g e t h e r  w i t h  f i v e   known compounds.  The s t r u c t u r e s   o f   t h e   new compounds were d e t e r m i n e d   a s :  ( ) ‑ 4 ' ‑ me  t h y  l e p i g a l l o c a  t e c h i n  5‑0 − β − D ‑ g l u c o p y r a n o s i d e ,  ( + ) ‑ 4 ' ‑ m e t h y l g a l l o c a t e c h i n  3 ' ‑ 0 − β − D ‑ g l u ‑ c o p y r a n o s i d e  and (  )  ‑ e p i c a  t e c h i n   (  4 β

8 )  

4 ' ‑ m e t h y l e p i g a l l o c a t e c h i nby c h e m i c a l  and  s p e c t r o s c o p i c   m e a n s .   The MeOH and H20 e x t r a c t s   showed moderate i n h i b i t o r y   e f f e c t s   a g a i n s t  HIV‑1 p r o t e a s e .  

3 )   Matsuse I . T . ,  Lim Y . A . ,  H a t t o r i  M . ,  Cor

r e aM . ,  and Gupta M . P . A . :  Search f o r  a n t i ‑ v i r a l  p r o p e r t i e s  i n  Panamanian m e d i c i n a l  p l a n t s .  The e f f e c t s  on HIV and i t s  e s s e n ‑ t i a l  enzymes. Ethnopharmacology, 6 4 :  1 5 ‑ 2 2 ,  1 9 9 9 .  

Aqueous and m e t h a n o l i c  e x t r a c t s  o f  3 9  Panamanian m e d i c i n a l  p l a n t s  were t e s t e d  f o r  a n t i ‑

human immunodeficiency v i r u s  (HIV) e f f e c t s .  The e x t r a c t s  were t e s t e d  f o r  t h e  i n h i b i t i o n  o f   HIV i n d u c e d  c y t o p a t h i c  e f f e c t s  i n  c u l t u r e d  c e l l s

I V ‑ r e v e r s et r a n s c r i p t a s e  (RT) and HIV  p r o t e a s e   (PR)  e n z y m e s .   The  water  e x t r a c t   o f   t h e   b r a n c h e s   o f   J αt r o p h α c u r e α s  

( E u p h o r b i a c e a e )   i n h i b i t e d   s t r o n g l y   t h e   HIV i n d u c e d   c y t o p a t h i c   e f f e c t s   with  low  c y t o t o x i c i t y .   On t h e  o t h e r  h a n d ,  t h e  water e x t r a c t s  o f   t h e   whole p l a n t  o f   Chα m αe s y c e   h y s s o p i f o l i α

E u p h o r b i a c e a e ) ,  t h e  l e a v e s  o f  C o r d i αs p i n e s c e n s  ( B o r a g i n a c e a e )  and t h e  a e r i a l   p a r t s  o f  Hyptis Z a n t αn i f o l i α

L a b i a t a e ) ,  and t h e  methanol e x t r a c t  o f  t h e  a e r i a l  p a r t s  o f   T e t r α pt  e r i s  m αc r o c αr p α

M a l p i g h i a c e a e )  were p o t e n t  i n h i b i t o r s  o f  HIV‑RT  ( I C 5 0 :   6 ‑ 8   μ  g/ 

m l ) .  S e v e n  o u t  o f  3 9  p l a n  t s   were found t o  b e  moderate i n h i b i t o r s  o f  HIV PR  C I   C 5 o :   4 3 ‑ 1 0 0  

μ 

g / m l ) .  Furthermore, we r e p o r t  on t h e  r e s p e c t i v e  i n h i b i t o r y  s u b s t a n c e s  o f   J .   c u r e αs ,   c .  

h y s s o p i f o l i αand  C .   s p i n e s c e n s ,  and t h e i r  p o s s i b l e  mechanism o f  a c t i o n .  

4 )   Abdel‑Hafez A.  A . ,   Meselhy M. R . ,   Nakamura N . ,   H a t t o r i   M . ,   Watanabe H . ,   Murakami Y . ,  El‑Gendy M.A., Mahfouz N. M. and Mohamed T .  A . :  Anticonvulsant  a c t i v i t y  o f  p a e o n i m e t a b o l i n ‑ 1  adducts obtained by i n c u b a t i o n  o f  p a e o n i f l o r i n  and  t h i o l  compounds with L αc t  ob αc i l l u s  b r e v i s .  B i o l .  Pharm. B u l l . ,  2 2 :  4 9 1 ‑ 4 9 7 ,  1 9 9 9 .   S e v e n t e e n  t h i o p a e o n i m e t a b o l i n ‑ I   a d d u c t s  were o b t a i n e d  a s   mixtures o f   d i a s t e r e o i s o m e r s   a f t e r  i n c u b a t i o n  o f  p a e o n i f l o r i n  with L αc t o b αc i l l u s  b r e u i s   i n  t h e  p r e s e n c e  o f  v a r i o u s  t h i o l s .   The a n t i c o n v u l s a n t  a c t i v i t y  o f  t h e  a d d u c t s  was i n v e s t i g a t e d  i n  mice u s i n g  t h e  maximal s u b ‑ c u t a n e o u s  p e n t y l e n e t e t r a z o l  s e i z u r e  t e s t  and sodium v a l p r o a t e  C l . 5  mmoljkg) a s  a  p o s i t i v e   c o n t r o l .   T h i r t e e n  a d d u c t s  showed d o s e ‑ d e p e n d e n t  p r o l o n g a t i o n  o f  l a t e n c i e s   o f  c l o n i c  and  t o n i c  c o n v u l s i o n s .  Maximal p r o t e c t i o n  a g a i n s t  c o n v u l s i o n s  was e f f e c t i v e l y  demonstrated by  8 ‑ ( n ‑ h e x y l t h i o ) p a e o n i m e t a b o l i n  I  ( 8 )   and 8  b e n z o y l t h i o p a e o n i m e t a b o l i n  I  ( 1 8 )   a t  d o s e s  o f   0 . 1 2 5   and 0 . 2 5   mmol/kg, r e s p e c t i v e l y ,   w h i l e   1 0 0 %   p r o t e c t i o n   was o n l y   a c h i e v e d   a t   0 . 5  

CH3  Glc‑0  . . . .   ／ぺて一？

~よ」，... H ‑Glc 

Bz‑o

b ; o  

1 

3 ,   R =  n  p r o p y l   4 ,   R  =  i s o  p r o p y l   5 ,   R  =  n ‑ b u t y l   6 ,   R  = s e c ‑ b u t y l  

7 ,   R =  i s o ‑ b u t y l   8 ,   R 

n ‑ h e x y l  

9 ,   R=allyl  1 0 ,   R  =  c y c l o p e n t y l  

1 1 ,   R =  c y c l o h e x y l  

1 2 ,   R  =  p h e n y l   1 3 ,   R  =  o ‑ t o l y l   1 4 ,   R  =  m ‑ t o l y l   1 5 ,   R  =  p ‑ t o l y l   1 6 ,   R =  2  n a p h t h y l   1 7 ,   R  =  b e n z y l   1 8 ,   R  =  b e n z o y l   1 9 ,   R =  a c e t y l  

： ： ； 可 − ： ： 日 。 ー ^H

写

H3

H  '  。

− − 一 一 H 

C h a r t  1 

2 

mmol/kg o f  8 ‑ c y c l o p e n t y l t h i o p a e o n i m e t a b o l i n  I  and 8 ‑ ( p ‑ t o l y l t h i o ) p a e o n i m e t a b o l i n  I

The  p r i n c i p a l  a n t i c o n v u l s a n t  a c t i v i t y  o f  t h e  d i a s t e r e o i s o m e r s  o f  8  and 1 8  was a t t r i b u t e d  t o  t h e i r   7 8 ‑ i s o m e r s  [ E D 5 o  v a l u e s  o f  0 . 0 9  and 0 . 1 2  mmoljkg, and p r o t e c t i v e  i n d i c e s  o f  5 . 0  and 4 . 0  f o r  8 

( 7 8 )  and 1 8  ( 7 8 ) ,  r e s p e c t i v e l y ] ,  w h i l e  t h e  7R c o u n t e r p a r t s  1 8  ( 7 R )  and 1 8  ( 7 R )  showed a  mus‑

c l e  r e l a x a t i o n  e f l f e c t .  

5 )   Hussein G . ,   Miyashiro H . ,   Nakamura N . ,   H a t t o r i  M . ,  Kawahata T . ,   Otake T . ,   Kakiuchi N . ,  and Shimotohno K . :  I n h i b i t o r y  e f f e c t s  o f  Sudanese p l a n t  e x t r a c t s  on 

I V ‑ r e p l i c a t i o nand HIV‑1

F o r t y ‑ e i g h t  methanol and a q u e o u s  e x t r a c t s  from Sudanese p l a n t s  were s c r e e n e d  f o r  t h e i r  i n ‑ h i b i t o r y  a c t i v i t y  on v i r a l  r e p l i c a t i o n .  N i n e t e e n  e x t r a c t s  showed i n h i b i t o r y  e f f e c t s  on HIV‑

i n d u c e d  c y t o p a t h i c  e f f e c t s  (CPE) on MT‑4 c e l l s .  The e x t r a c t s  w e r e  f u r t h e r  s c r e e n e d  a g a i n s t   HIV‑1 p r o t e a s e  (PR) u s i n g  an HPLC a s s a y  m e t h o d .  Of t h e  t e s t e d  e x t r a c t s ,  t h e  methanol e x ‑ t r a c t s   o f   Ac α c i α n i l o t i c α

b a r k   and  p o d s ) ,   Euphorbiα gr α nu  l a t α C l e a v e s ) ,   Mα y t e n u s   s e n e g α l e n s i s   ( s t e m ‑ b a r k )  and aqueous e x t r a c t s  o f  A .  n i l o t i c α

p o d s )  and  M. s e n e g α l e n s  i s   ( s t e m ‑ b a r k )  showed c o n s i d e r a b l e  i n h i b i t o r y  e f f e c t s  a g a i n s t  HIV‑1 PR. I n h i b i t o r y  p r i n c i p l e s   were i s o l a t e d  from

s e n e g α l e n s i s  and t h e i r  a c t i v i t i e s  were a l s o  d i s c u s s e d .  

6 )   Nawawi A . ,  Nakamura N . ,  H a t t o r i  M . ,  Kurokawa M . ,  S h i r a k i  K . :  I n h i b i t o r y  e f f e c t s   of I n d o n e s i a n  m e d i c i n a l  p l a n t s  on t h e  i n f e c t i o n  on h e r p e s  simplex v i r u s  type 1 .   P h y t o t h e r .  R e s . ,  1 3 :  3 7 ‑ 4 1 ,  1 9 9 9 .  

Water and methanol e x t r a c t s  o f  3 0  t r a d i t i o n a l  m e d i c i n a l  p l a n t s ,  c o l l e c t e d  i n  I n d o n e s i a ,  were  t e s t e d  f o r  t h e i r  a n t i  HSV‑1 a c t i v i t y .  The e x t r a c t s  o f  e i g h t  p l a n t  s p e c i e s  showed p o t e n t  a c t i v ‑ i t y  on t h e  p l a q u e  a s s a y  a t  a  c o n c e n t r a t i o n  o f  1 0 0  

g/mL. The t h e r a p e u t i c  e f f i c a c y  o f  s e v e n   s e l e c t e d  p l a n t s  was d e m o n s t r a t e d  by u s i n g  a  mouse HSV‑1 i n f e c t i o n  a s s a y ,  b o t h  t h e  metha‑

n o l   e x t r a c t s   o f   t h e   f r u i t   o f   M e l a l e u c α l e u c a d e n d r o n   ( M y r t a c e a e )   and t h e   p e r i c a r p   o f   Nephelium Z a p p α ceum ( S a p i n d a c e a e )  s i g n i f i c a n t l y  p r o l o n g e d  t h e  d e v e l o p m e n t  o f  s k i n  l e s i o n s   and r e d u c e d  t h e  m o r t a l i t y .  

7 )   Ma  C . ,  Nakamura N . ,  Miyashiro H . ,  H a t t o r i  M . ,  and Shimotohno K . :  I n h i b i t o r y  e f ‑ f  e c t s  o f  c o n s t i t u e n t s  from  Cynomorium songaricum and r e l a t e d  t r i t e r p e n e  d e r i v a ‑ t i v e s  on HIV‑1 p r o t e a s e .  Chem. Pharm. B u l l . ,  4 7 :  1 4 1 ‑ 1 4 5 ,  1 9 9 9 .  

From  C H 2 C l 2   and  MeOH e x t r a c t s   o f   t h e   s t e m s   o f   Cynomorium  s o n g α r i c u m   R U P R .  

( C y n o m o r i a c e a e ) ,  u r s o l i c  a c i d  and i t s   hydrogen malonate w e r e  i s o l a t e d  a s  i n h i b i t o r s  o f  

human i m m u n o d e f i c i e n c y  v i r u s  t y p e  1  ( H I V ‑ 1 )  p r o t e a s e ,  w i t h  5 0 %  i n h i b i t o r y  c o n c e n t r a t i o n s  

( I C 5 0 )  o f  8  and 6 

M, r e s p e c t i v e l y .  Amongst v a r i o u s  s y n t h e s i z e d  d i c a r b o x y l i c  a c i d  h e m i e s t e r s  

o f  r e l a t e d  t r i t e r p e n e s ,  i n h i b i t o r y  a c t i v i t y  t e n d e d  t o  i n c r e a s e  i n  t h e  o r d e r  o f  o x a l y l ,  m a l o n y l ,  

s u c c i n y l  and g l u t a r y l  h e m i e s t e r s ,  f o r  t r i t e r p e n e s  s u c h  a s  u r s o l i c  a c i d ,   o l e a n o l i c  a c i d  and 

b e t u l i n i c  a c i d .  The most p o t e n t  i n h i b i t i o n  was o b s e r v e d  f o r  t h e  g l u t a r y l  h e m i e s t e r s ,  w i t h  an 

I C 5 o  o f  4  μM. 

From t h e  w a t e r  e x t r a c t  o f  t h e  s t e m s  o f   C .   s o n g α r i c u m ,   f l a v a n ‑ 3 ‑ o l  p o l y m e r s ,  c o n s i s t i n g  o f   e p i c a t e c h i n  a s  t h e i r  e x t e n d e r  f l a v a n  u n i t s ,  were a l s o  found t o  b e  p o t e n t  i n h i b i t o r y  p r i n c i p l e s   a g a i n s t  HIV‑1 p r o t e a s e .  

8 )   Nawawi A . ,  Ma  C . ,  Nakamura N . ,  H a t t o r i  M . ,  Kurokawa M . ,  S h i r

d K . ,  Kashiwaba  N . ,   and Ono M . :  A n t i ‑ h e r p e s  simplex v i r u s  a c t i v i t y  o f  a l k a l o i d s  i s o l a t e d   from  S t e p h α n i a  c e p h a r α

n t h a .   B i o l .  Pharm. B u l l . ,  2 2 :  2 6 8 ‑ 2 7 4 ,  1 9 9 9 .  

By s c r e e n i n g  w a t e r  and MeOH e x t r a c t s  o f  3 0  C h i n e s e  m e d i c i n a l  p l a n t s  f o r  t h e i r  a n t i ‑ h e r p e s   s i m p l e x  v i r u s  (HSV)‑1 a c t i v i t y ,  a  MeOH  e x t r a c t  o f  t h e  r o o t  t u b e r s  o f   S t e p h α n i α c e p h α r α n t h α  HAYATA showed t h e  most p o t e n t  a c t i v i t y  on t h e  p l a q u e  r e d u c t i o n  a s s a y  with an I C s o  v a l u e  o f   1 8 . 0  

g / m l .  Of 4 9  a l k a l o i d s  i s o l a t e d  from t h e  MeOH e x t r a c t ,  1 7  a l k a l o i d s  were found t o  b e   a c t i v e  a g a i n s t  HSV‑1, i n c l u d i n g  1 3  b i s b e n z y l i s o q u i n o l i n e ,  1  p r o t o b e r b e r i n e ,  2  morphinane  and 1  p r o a p o r p h i n e  a l k a l o i d s ,  w h i l e  b e n z y l i s o q u i n o l i n e  and hasubanane a l k a l o i d s  were i n a c ‑ t i v e .  Although N ‑ m e t h y l c r o t s p a r i n e  was a c t i v e  a g a i n s t  HSV‑1, a s  w e l l  a s  HSV‑1 thymidine  k i n a s e  d e f i c i e n t  ( a c y c l o v i r  r e s i s t a n t  t y p e ,  HSV‑1 TK )  and HSV‑2 C I C s o  v a l u e s  o f  8 . 3 ,  7 . 7  and  6 . 7  μg/ml, r e s p e c t i v e l y ) ,  i t   was c y t o t o x i c .  FK‑3000 was found t o  b e  t h e  most a c t i v e  a g a i n s t   HSV‑1, HSV‑1 TK and HSV‑2 C I C s o  v a l u e s  o f  7 . 8 ,  9 . 9  and 8 . 7  μg/ml) with  i n  v i t r o   t h e r a p e u ‑ t i c  i n d i c e s  o f  9 0 ,   7 1  and 8 1 ,  r e s p e c t i v e l y .  FK‑3000 was found t o  b e  a  promising c a n d i d a t e  a s   an anti‑HSV a g e n t  a g a i n s t  HSV‑1, a c y c l o v i r  (ACV) r e s i s t a n t ‑ t y p e  HSV‑1 and HSV‑2. 

9 )   Min B . ,  H a t t o r i  M . ,  Lee H . ,  and Kim Y . :   I n h i b i t o r y  c o n s t i t u e n t s  a g a i n s t  HIV‑1 pro

t e a s e  from  Ag α s t α c h e  r u g o s α .   A r c h .  Pharm. R e s . ,  2 2 :  7 5 ‑ 7 7 ,  1 9 9 9 .  

Two d i t e r p e n o i d  compounds, a g a s t a n o l  ( 1 )   and a g a s t a q u i n o n e  ( 2 ) ,  were i s o l a t e d  from t h e   r o o t s  o f   Ag α s t α c h e  r u g o s α

L a b i a t a e ) .  Compounds 1  and 2  showed s i g n i f i c a n t  i n h i b i t o r y  e f ‑ f e c t s  a g a i n s t  human i m m u n o d e f i c i e n c y  v i r u s  t y p e  1  ( H I V ‑ 1 )  p r o t e a s e  a c t i v i t y  w i t h  I C 5 0  v a l ‑ u e s  o f  3 6 0  and 8 7  

M, r e s p e c t i v e l y .  

1 0 )   Tezuka Y . ,  Terazono M . ,  Kusumoto T .   I . ,   Kawashima Y . ,  Hatanaka Y . ,  Kadota S . ,   H a t t o r i  M . ,  Namba T . ,  Kikuchi T . ,  Tanaka K . ,  and Supriyatna S . :  H e l i s t e r c u l i n s  A  and B ,   two new ( 7  . 5

8 . 2

n e o l i g n a n s ,and h e l i s o r i n ,   t h e  f i r s t   ( 6 . 4

7 . 5

8 . 2

n e o l i g n a n ,  from t h e  I n d o n e s i a n  m e d i c i n a l  p l a n t   H e l i c t e r e s  i s o r α .  H e l v .  Chim. A c t a ,   8 2 :  4 0 8 ‑ 4 1 7 ,  1 9 9 9 .  

During a  c h e m i c a l  s t u d y  o f  I n d o n e s i a n  m e d i c i n a l  p l a n t s ,  we examined t h e  c o n s t i t u e n t s  o f   f r u i t s  o f   H e l i c t e r e s  i s o r α L .   ( S t e r c u l i a c c a e )   o n e  o f  t h e  famoms Jamu m e d i c i n e s .  From a  water e x t r a c t  o f  t h e  f r u i t s ,  we i s o l a t e d  t h r e e  new n e o l i g n a n s ,  h e l i s t e r c u l i n s  A ( 1 )  and B ( 2 )   and h e l i s o r i n  ( 3 ) ,  and e l u c i d a t e d  t h e i r  s t r u c t u r e s  by s p e c t r a l  a n a l y s e s .  H e l i s t e r c u l i n s  A 

and B ( 2 )  a r e  ( 7 . 5

8 . 2 ' ) ‑ n e o l i g n a n s  w i t h  a  b i c y c l o [ 2 . 2 . 2 ] o c t e n e  C‑framework, w h i l e  h e l i s o r i n  

( 3 )   i s   a ( 6 . 4 ' ,   7 . 5

8 . 2 ' ) ‑ n e o l i g n a n  w i t h  a  v e r y  r a r e  4 , 4 a , 9 , 9 a ‑ t e t r a h y d r o ‑ 3 , 9 ‑ m e t h a n o ‑ 3 H ‑

f l u o r e n e  C ‑ f r a m e w o r k .  The n a t u r a l  p r o d u c t  w i t h  t h e  l a t t e r  C‑framework h a s  no l i t e r a t u r e  

p r e c e d e n t .  The n e o l i g n a n s  1 〜 3  showed weak i n h i b i t o r y  a c t i v i t y  a g a i n s t  r e v e r s e  t r a n s c r i p t a s e  

from a v i a n  m y e l o b l a s t o s i s  v i r u s .  

1 1 )  Kawata Y . ,  Ma  C . ,  Meselhy M. R . ,  Nakamura N . ,  Wang H . ,  H a t t o r i  M., Namba T . ,   Satoh K . ,  and K u r a i s h i  Y . :  Conversion o f  a c o n i t i n e  t o  l i p o a c o n i t i n e  by human i n ‑ t e s t i n a l  b a c t e r i a  and t h e i r  a n t i n o c i c e p t i v e  e f f e c t s  i n  m i c e .   J .   T r a d .  M e d . ,  1 6 :  1 5 ‑ 2 3 ,   1 9 9 9 .  

A c o n i t i n e  was s u b s t a n t i a l l y  c o n v e r t e d  t o  l i p o a c o n i t i n e  (LA) a f t e r  i n c u b a t i o n  w i t h  human i n ‑ t e s t i n a l  b a c t e r i a .  The F r i t  FAB LC/MS and GC/MS i n d i c a t e d  t h a t  t h e  f a t t y  a c i d  c o m p o s i ‑ t i o n  o f  LA  was s i m i l a r  t o  c e l l u l a r  f a t t y  a c i d s  o f  t h e  b a c t e r i a l  s t r a i n  u s e d ;  major f a t t y  a c i d s   i n  LA p r o d u c e d  by B α c t e r o i d e s  f r α g i l i s   were a n t e i s o  C 1 5 : 0 ,  n ‑ C l 5 : 0  and 

レ C 1 6 : 0 ,w h i l e  LA  p r o d u c e d  by  K l e b s i e l l α pneumoni αe o r  by f e c a l  f l o r a  c o n t a i n e d  n ‑ C 1 6 : 0  a s  t h e  major f a t t y   a c i d .  LA from  C l o s t r i d i u m  b u t y r i c u m   c o n t a i n e d  C 1 8 : 1 ,  C 1 8 : 0 ,  C 1 6 : 1 ,  C 1 6 : 0 .  LA  was a l s o  o b ‑ t a i n e d  a f t e r  i n c u b a t i o n  o f  a c o n i t i n e  w i t h  s t e r i l e  b a c t e r i a l  c e l l s  o r  a  p r e c i p i t a t e  o f  d i s r u p t e d   b a c t e r i a l  c e l l s  i n  p h o s p h a t e  b u f f e r .  A c o n i t i n e  a t  a  d o s e  o f  0 . 1  mg/kg, s i g n i f i c a n t l y  i n c r e a s e d   t h e   n o c i c e p t i v e   t h r e s h o l d   i n   m i c e   w i t h   n o c i c e p t i v e   h y p e r s e n s i t i v i t y ,   w h i l e   8 ‑ 0 ‑ o l e o y l b e n z o y l a c o n i n e  (OBA) was a c t i v e  b u t  t o x i c  a t  a  h i g h e r  d o s e  o f  3 . 0  mg/kg, and 8 ‑ 0 ‑ p a l m i t o y l b e n z o y l a c o n i n e  (PBA) was o n l y  a c t i v e  a t  a  d o s e  o f  3 0  mg/kg. T h e s e  f i n d i n g s  s u g ‑ g e s t  t h a t  OBA  and PBA do n o t  p l a y  an i m p o r t a n t  r o l e  i n  t h e  a n t i n o c i c e p t i v e  a c t i o n  o f  a c o n i t e   t u b e r  and t h e  a l k a l o i d  a c o n i t i n e .  

1 2 )   Kakiuchi N . ,  Nishikawa S . ,   H a t t o r i  M . ,  and Shimotohno K . :  A high throughput  assay o f  t h e  h e p a t i t i s  C v i r u s  n o n s t r u c t u r a l  p r o t e i n  3  s e r i n e  p r o t e i n a s e .   J .   V i o l .   Methods, 8 0  :  7 7 ‑ 8 4 ,  1 9 9 9 .  

A s i m p l e  a s s a y  was d e v e l o p e d  b a s e d  on i n t r a m o l e c u l a r  f l u o r e s c e n c e  r e s o n a n c e  e n e r g y  t r a n s ‑ f e r  f o r  d e t e c t i o n  o f  t h e  a c t i v i t y  o f  h e p a t i t i s  C  v i r u s  (HCV) s e r i n e  p r o t e i n a s e .  Two q u e n c h e d ‑ f l u o r o g e n i c  s u b s t r a t e s ,   ( 7 ‑ m e t h o x y c o u m a r i n ‑ 4 ‑ y   1 )   a c e t y  1  (Mea)  A s p ‑ A s p ‑ I l e ‑V  a l ‑ P r o ‑ C y s ‑ S e r ‑ M e t ‑ S e r ‑ ( 2 , 4 ‑ d i n i t r o p h e n y l ,   Dnp)  Lys  ( M e a ‑ A s p ‑ A s p ‑ I l e ‑ V a l ‑ P r o ‑ C y s ‑ S e r ‑ M e t ‑ S e r ‑ Lys[Dn  p  ] ,   QF  ‑ 1 )   and Mea‑Asp‑Asp‑I l e ‑ V a l ‑P r o ‑ C y s ‑ S e r ‑Met‑Lys (Dn  p )  ‑Arg

Arg (QF

2 ) , which d e r i v e d  from t h e  NSSA/5B j u n c t i o n  o f  t h e  HCV p o l y p r o t e i n ,  w e r e  d e s i g n e d .  K i n e t i c   s t u d i e s  r e v e a l e d  t h a t  QF‑1 and QF‑2 had h i g h  a f f i n i t y  f o r  a  r e c o m b i n a n t  e n z y m e ,  which i s   a  f u s i o n  p r o t e i n  o f  m a l t o s e  b i n d i n g  p r o t e i n  and a l m o s t  e n t i r e  n o n s t r u c t u r a l  p r o t e i n  (MBP‑

N S 3 ) ,  w i t h   Km  v a l u e s  c o m p a r a b l e  t o  t h a t  o f  l o n g e r  s u b s t r a t e  b a s e d  on t h e  same c l e a v a g e  s i t e .  

QF‑1 and QF‑2 were c l e a v e d  by MBP‑NS3 e f f i c i e n t l y  w i t h  k c a t  v a l u e s  o f  7 . 5  and 4 . 2  m i n ' ‑ ‑ 1 ,  r e ‑

s p e c t i v e l y .  QF‑2 was a l s o  found t o  b e  a  good s u b s t r a t e  o f  ANS3,  which c o n t a i n e d  s e r i n e  

p r o t e i n a s e  p a r t  o f  NS3 w i t h  k c a t  v a l u e  o f  4 . 3  min 1   The c . l e a v a g e  r e a c t i o n  i s   d e t e c t e d  c o n t i n u ‑

o u s l y  by t h e  e l e v a t i o n  o f  t h e  f l u o r e s c e n c e  due t o  r e l e a s e  from q u e n c h i n g .  The f l u o r e s c e n c e  o f  

t h e  s u b s t r a t e s  i n c r e a s e s  i n  p r o p o r t i o n  t o  p r o g r e s s  o f  t h e  c l e a v a g e  r e a c t i o n  under t h e  s t a n ‑

d a r d  c o n d i t i o n s .  T h i s  method was a p p l i e d  f o r  s c r e e n i n g  o f  HCV s e r i n e  p r o t e a s e  i n h i b i t o r s  

u s i n g  a f l u o r e s c e n c e   m u l t i w e l l   p l a t e   r e a d e r .   A group o f   n a t u r a l l y  o c c u r r i n g  p r o d u c t s ,  

f l a v o n o i d s ,  was s u b j e c t e d  t o  b e  s c r e e n e d .  Two f l a v o n o i d s  o u t  o f  2 5  were f o u n d  t o  i n h i b i t  t h e  

enzyme m o d e r a t e l y  a t  a  c o n c e n t r a t i o n  o f  1 0 0  

M. The d a t a  a g r e e d  w i t h  t h o s e  o b t a i n e d  by  h i g h ‑ p e r f o r m a n c e   l i q u i d   chromatography  (HPLC).  T h i s   method i s   s u i t e d   t o   s e n s i t i v e   q u a n t i t a t i o n  o f  t h e  enzyme r e a c t i o n  a s  w e l l  a s  t h e  h i g h  throughput a n a l y s i s  o f  t h e  i n h i b i ‑ t o r s .  

1 3 )  Tanikawa K . ,  Goto H . ,  Nakamura N . ,  Tanaka N . ,  H a t t o r i  M . ,  I t o h  T . ,  and Terasawa  K . :   Endotherium‑dependent  v a s o d i l a t o r   e f f e c t   o f   t a n n i n   e x t r a c t   from  Cinnamonomi Cortex on i s o l a t e d  r a t  a o r t a .   J .   T r a d .  M e d . ,  1 6 :  4 5 ‑ 5 0 ,  1 9 9 9 .  

Cinnamonomi C o r t e x   ( t h e  bark o f   C i n nαmom  um c αs s i a  BLUME) i s   a  c r u d e  drug t h a t  i s   w i d e l y  u s e d  i n  s p i c e s  and m e d i c a l  p r o d u c t s .  Although improvement o f  b l o o d  f l o w  by t h i s   p l a n t  component h a s  l o n g  b e e n  known, t h e r e  h a v e  b e e n  no r e p o r t s  c o n c e r n i n g  t h e  mechanism  i n v o l v e d .  We  s t u d i e d  t h e  v a s o d i l a t o r  a c t i o n s  o f  t h i s  drug e s p e c i a l l y  f o c u s i n g  on t h e  r o l e  o f  e n ‑ d o t h e l i u m  i n   t h e  i s o l a t e d  v a s c u l a r  b e d .  Tannin from Cinnamonomi C o r t e x  (TCC) r e l a x e d   p r o s t a g l a n d i n  F z α − p r e c o n t r a c t e d  r i n g  p r e p a r a t i o n s  o f  r a t  a o r t a  w i t h  i n t a c t  e n d o t h e l i u m .   TCC d i d  n o t  c a u s e  r e l a x a t i o n  o f  s p e c i m e n s  w i t h o u t  e n d o t h e l i u m ,  and TCC‑induced r e l a x a t i o n   was i n h i b i t e d  by p r e t r e a t m e n t  w i t h  1 0   4  M ̲ N C T ‑ n i t r o ‑ l ‑ a r g i n i n e  methyl e s t e r .  D i m e r ,  t r i m e r ,   t e t r a m e r ,   and  pentamer  components  o f   TCC  a l s o   p r o d u c e d   e n d o t h e l i u m ‑ d e p e n d e n t   v a s o d i l a t i o n .  S t r o n g e r  r e l a x a t i o n  was c a u s e d  by h i g h e r  m o l e c u l a r  w e i g h t  t a n n i n s ,  and e n d o ‑ t h e l i u m ‑ d e p e n d e n t  v a s o d i l a t i o n  e v e n  a p p e a r e d  a t  low c o n c e n t r a t i o n s .  I n  c o n c l u s i o n ,  we found  t h a t  TCC e x h i b i t s  an e n d o t h e l i u m ‑ d e p e n d e n t  v a s o d i l a t i o n  i n  t h e  i s o l a t e d  r a t  a o r t a  mainly  v i α e n d o t h e l i u m ‑ d e r i v e d  NO. NO‑mediated e n d o t h e l i u m ‑ d e p e n d e n t  r e l a x a t i o n  seems t o  b e   more p o t e n t  f o r  TCC w i t h  h i g h e r  m o l e c u l a r  w e i g h t  than t h a t  w i t h  l o w e r  m o l e c u l a r  w e i g h t .  

1 4 )  Tohda C . ,  Nakamura N . ,  Komatsu K . ,  and H a t t o r i  M . :  T r i g o n e l l i n e ‑ i n d u c e d  n e u r i t e   outgrowth i n  human neuroblastoma SK‑N‑:SH c e l l s .  B i o l .  Pharm. B u l l . ,  2 2 :  6 7 9 ‑ 6 8 2 ,   1 9 9 9 .  

E x t e n s i o n  o f  d e n d r i t e s  and axons i n  n e u r o n s  may compensate and r e s c u e  damaged n e u r o n a l  

networks i n   t h e  d e m e n t i a  b r a i n .  Our aim i s   t o  i s o l a t e  and i d e n t i f y  c o n s t i t u e n t s  o f  c o f f e e  

b e a n s  e x h i b i t i n g  n e u r i t e  outgrowth a c t i v i t y .  Among t h e  e x t r a c t s  o f  raw and r o a s t e d  c o f f e e  

b e a n s ,  a  methanol f r a c t i o n  o f  t h e  e t h a n o l  e x t r a c t   ( 1   μ  g/ml) o f  raw b e a n s  i n c r e a s e d  s i g n i f i ‑

c a n t l y  t h e  p e r c e n t a g e  o f  c e l l s  w i t h  n e u r i t e s  i n  human neuroblastoma SK‑N‑SH c e l l s .  Among 

s u b f r a c t i o n s  o f  t h i s  methanol f r a c t i o n  was a  b a s i c  f r a c t i o n  ( 5   μ  g/ml) which e x h i b i t e d  s i g ‑

n i f i c a n t  n e u r i t e  outgrowth a c t i v i t y .  F i n a l l y ,  t r i g o n e l l i n e  i n  t h e  b a s i c  f r a c t i o n  was i d e n t i f i e d  

t o  b e  a c t i v e  a s  f a r  n e u r i t e  e x t e n s i o n  was c o n c e r n e d .  Treatment w i t h  t r i g o n e l l i n e  ( 3 0   μ  M) i n ‑

c r e a s e d  t h e  p e r c e n t a g e  o f  c e l l s  w i t h  n e u r i t e s  a t  3  and 6  d  a f t e r  t r e a t m e n t .  I

d d i t i o n ,  t h e  

number o f  n e u r i t e s  r e a c t i n g  p o s i t i v e l y  t o  p h o s p h o r y l a t e d  n e u r o f i l a m e n t ‑ H  was i n c r e a s e d  by 

t r e a t m e n t  w i t h  3 0   μ  M t r i g o n e l l i n e  f o r  6  d ,   s u g g e s t i n g  enhancement o f  a x o n a l  e x t e n s i o n .  

T h e s e  r e s u l t s  show t h a t  t r i g o n e l l i n e  promotes f u n c t i o n a l  n e u r i t e  o u t g r o w t h .  

1 5 )   Fan W . ,  Tezuka Y . ,  Xiong Q . ,  Hattori M . ,  Namba T . ,  and Kadota S . :  Apocynins A‑

D: New phenylpropanoid‑substituted f l a v a n ‑ 3 ‑ o l  i s o l a t e d  from l e a v e s  o f   Apocynum  venetum  (Luobuma‑Ye). Chem. Pharm. B u l l . ,  4 7 :  1 0 4 9 ‑ 1 0 5 0 ,  1 9 9 9 .  

Four new p h e n y l p r o p a n o i d

i b s t i t u t e df l a v a n ‑ 3 ‑ o l s  c a l l e d  a p o c y n i n s  A‑D  ( 1 〜 4 )   have b e e n   i s o l a t e d  from t h e  l e a v e s  o f   Apocynum venetum  ( A p o c y n a c e a e ) ,  t o g e t h e r  with two known  p h e n y l p r o p a n o i d ‑ s u b s t i t u t e d  f l a v a n ‑ 3 ‑ o l s ,   c a t e c h i n ‑ [ 8 ,  7 ‑ e ] ‑ 4 α

3 , 4 ‑ d i h y d r o x y p h e n y l ) ‑ d i h y dro‑2(3H)‑pyranone ( 5 )  and c i n c h o n a i n   I a   ( 6 ) ,  and f o u r  known f l a v a n ‑ 3 ‑ o l s ,   （~）－epicatechin,

（＋）司

c a t e c h i n ,

e p i g a l l o c a t e c h i n ,and ( + ) ‑ g a l l o c a t e c h i n .  T h e i r  s t r u c t u r e s  were e l u c i d a t e d   on  t h e   b a s i s   o f   s p e c t r a l   a n a l y s i s ,   i n c l u d i n g   2D NMR and CD s p e c t r a .   They showed  h e p a t o p r o t e c t i v e  a c t i v i t y  a g a i n s t  D ‑ g a l a c t o s a m i n e  (D‑GalN) /tumor n e c r o s i s  f a c t o r − α

TN  F

α

i n d u c e d  c e l l  d e a t h  i n  primary c u l t u r e d  mouse h e p a t o c y t e s .  

1 6 )   Min  B . ,  Jung H . ,  Lee J . ,  Kim Y . ,  Bok S . ,  Ma  C . ,  Nakamura N . ,  H a t t o r i  M . ,  and Bae  K . :   I n h i b i t o r y  e f f e c t  o f  t r i t e r p e n e s  from  Cr α t a e g u s  p i n α t i f i d αon H I V ‑ p r o t e a s e .   Planta Medica, 6 5 :  3 7 4 ‑ 3 7 5 ,  1 9 9 9 .  

The methanol e x t r a c t s  o f  t h e  l e a v e s  o f   Cr α t α e g u s  p i n α t i f i d αshowed p o t e n t  i n h i b i t o r y  a c t i v i ‑ t i e s  a g a i n s t  HIV  ‑ 1   p r o t e a s e  a t  a  c o n c e n t r a t i o n  o f  1 0 0   μ  g  / m l .  The s u  b s e q  uen  t  f r a c t i o n a t i o n   and i s o l a t i o n  o f  t h e  e x t r a c t  g a v e  two a c t i v e  compounds. T h e i r  s t r u c t u r e s  were i d e n t i f i e d  a s   u v a o l   ( 1 )   and u r s o l i c  a c i d  ( 2 )  by s p e c t r a l  d a t a .  These a c t i v e  compounds i n h i b i t  HIV‑1 p r o t e ‑ a s e  with I C " n  v a l u e s  o f  5 . 5  and 8 . 0   μ  M, r e s p e c t i v e l y .  

1 7 )   E l

1ekkawyS . ,  Meselhy M. R . ,  Nakamura N . ,  H a t t o r i  M . ,  Kawahata T . ,  and Otake  T . :  12‑0

A c e t y l p h o r b o l ‑ 1 3 ‑ d e c a n o a t ep o t e n t l y  i n h i b i t s  c y t o p a t h i c  e f f e c t s  o f  human  immunodeficiency v i r u s  type 1  ( H I V ‑ 1 ) ,  without a c t i v a t i o n  o f  p r o t e i n  k i n a s e  C .   Chem. Pharm. B u l l . ,  4 7 :  1 3 4 6 ‑ 1 3 4 7 ,  1 9 9 9 .  

H3C

Bz‑0 

Ch 紅 t2 

1 

2 

3 ,   R = n ‑ p r o p y l  

4 ,   R =  i s o

p r o p y l

5 ,   R =  n ‑ b u t y l  

6 ,   R = s e c ‑ b u t y l  

7 ,   R =  iSO b u t y l  

8 ,   R =  n ‑ h e x y l  

9 ,   R =  a l l y l  

1 0 ,   R =  c y c l o p e n t y l  

1 1 ,   R =  c y c l o h e x y l  

1 2 ,   R =  p h e n y l  

1 3 ,   R =  o ‑ t o l y l  

1 4 ,   R  =  m ‑ t o l y l  

1 5 ,   R =  p ‑ t o l y l  

1 6 ,   R =  2 ‑ n a p h t h y l  

1 7 ,   R =  b e n z y l  

1 8 ,   R =  b e n z o y l  

1 9 ,   R =  a c e t y l  

Through b i o a c t i v i t y  g u i d e d  f r a c t i o n a t i o n ,  e i g h t  p h o r b o l  d i e s t e r s ,   i n c l u d i n g  f i v e  new o n e s   ( 1 〜 5 ) ,   were  i s o l a t e d   from  t h e   s e e d s   o f   C r o t o n   t i g l i u m   c o l l e c t e d   i n   E g y p t .   1 2 ‑ 0 ‑ A c e t y l p h o r b o l ‑ 1 3 ‑ d e c a n o a t e   ( 6 )   and  1 2  0 ‑ d e c a n o y l p h o r b o l  1 3  ( 2  m e t h y l b u t y r a t e )   ( 4 )   p o t e n t l y  i n h i b i t e d  t h e  H l V ‑ 1 ‑ i n d u c e d  c y t o p a t h i c  e f f e c t  on MT‑4 c e l l s   C I C 1 0 0  v a l u e s  o f  7 . 6   μ  g  /ml and 7 . 8 1   μ  g / m l ,  and CCo v a l u e s  o f  6 2 . 5   μ  g/ml and 3 1 . 3   μ  g / m l ,  r e s p e c t i v e l y )  w i t h o u t  a c

t i v a t i n g  p r o t e i n  k i n a s e  C .  

1 8 )  Yang X . ,  Zhao  J . ,   Cui Y . ,  Liu X . ,  Ma  C . ,  H a t t o r i  M . ,  and Zhang L . :  Anti‑HIV‑1 p r o ‑ t e a s e   t r i t e r p e n o i d   saponins  from t h e   s e e d s   o f  A e s c u l u s   c h i n e n s i s .   J .   Natural  P r o d u c t s ,  6 2 :  1 5 1 0 ‑ 1 5 1 3 ,  1 9 9 9 .  

E i g h t   b i o a c t i v e   t r i t e r p e n o i d   s a p o n i n s   ( 1 〜 ^{8 )   were  i s o l a t e d   from t h e   s e e d s   o f}   A e s c u l u s   c h i n e n s i s ,  f o u r  o f  which a r e  n o v e l  compounds. The major s a p o n i n s  were i d e n t i f i e d  a s  e s c i n  

( 1 ) ,  I b  ( 2 ) ,  i s o e s c i n  

( 3 )  and I b  ( 4 ) ,  w h i l e  t h e  new compounds were i d e n t i f i e d  a s  2 2 α − t i g ‑ l o y  1 ‑ 2 8 ‑ a c e t y  1  p r o t o a e s c i g e n i n ‑ 3 β

0

β

D ‑ g l u c o p y r a n o s y l  C l ‑ 2 )  

β

D ‑ g l u c o p y r a n o s y l  C l ‑ 4

β

D ‑ g l u c o p y r a n o s i d u r o n i c  a c i d   ( e s c i n  IV  c ,   5 ) ,   2 2 α

a n g e l o y l  2 8  a c e t y l p r o t o a e s c i g e n i n ‑ 3 β

0

β

D ‑ g l u c o p y r a n o s y l  C l ‑ 2

β

D g  1 u c o p y r a n o s y 1  C l ‑ 4

β

D ‑ g l u c o p y r a n o s i d u r o n i c  a c i d   ( e s c i n  IV  d ,   6 ) ,   2 8  t i g l o y l p r o t o a e s c i g e n i n ‑ 3 β

0

β

D ‑ g l u c o p y r a n o s y l  C l ‑ 2

β

D ‑ g l u c o p y ‑ r a n o s y l  ( 1 ‑ 4

β

D ‑ g l u c o p y r a n o s i d u r o n i c  a c i d  ( e s c i n  I V e ,  7 ) ,   and 2 8 ‑ a n g e l o y l p r o t o a e s c i g e ‑ n i n ‑ 3 β

0 ‑ [  / 3 ‑ D ‑ g l u c o p y r a n o s y l  ( 1 ‑ 2

β D   g l u c o p y r a n o s y l  C l ‑ 4

β

D ‑ g l  u c o p y r a n o s i d  uro  n i c  a c i d  ( e s c i n  I V f ,  8 ) .  The s t r u c t u r e s  were d e t e r m i n e d  by c h e m i c a l  and s p e c t r o s c o p i c  meth‑

o d s .  A l l  t h e  a b o v e  compounds were e v a l u a t e d  f o r  t h e i r  i n h i b i t o r y  a c t i v i t y  a g a i n s t  HIV‑1 p r o ‑ t e a s e .  

1 9 )  Min  B . ,  Bae K . ,  Kim Y . ,  Miyashiro H . ,  H a t t o r i  M. and Shimotohno K . :  S c r e e n i n g  o f   Korean p l a n t s  a g a i n s t  human immunodeficiency v i r u s  t y p e  1  p r o t e a s e .  P h y t o t h e r .   R e s . ,  1 3 :  6 8 0 ‑ 6 8 2 ,  1 9 9 9 .  

With t h e  aim o f  f i n d i n g  n o v e l  anti‑human i m m u n o d e f i c i e n c y  v i r u s  a g e n t s  from n a t u r a l   p r o d u c t s ,  9 3  MeOH e x t r a c t s  o f  Korean p l a n t s  were s c r e e n e d  f o r  t h e i r  i n h i b i t o r y  a c t i v i t i e s   a g a i n s t  HIV‑1 p r o t e a s e .  The most p o t e n t  i n h i b i t i o n  was shown by t h e  r o o t  o f   R o d i o l α r o s e α  w i t h  7 0 . 4 %  i n h i b i t i o n  a t  a  c o n c e n t r a t i o n  o f  1 0 0   μ  g/mL. 

2 0 )   Yokozawa T .  and Owada S . :   E f f e c t  o f  g i n s e n o s i d e ‑ R d  i n  c e p h a l o r i d i n e ‑ i n d u c e d   r e n a l  d i s o r d e r .  Nephron, 8 1 :  2 0 0

2 0 7 ,1 9 9 9 .  

To d e t e r m i n e  whether g i n s e n o s i d e ‑ R d  a m e l i o r a t e s  t h e  r e n a l  i n j u r y  i n d u c e d  by c e p h a l o r i d i n e ,  

t h e   e f f e c t   o f   c e p h a l o r i d i n e   was  i n v e s t i g a t e d   i n   r a t s   g i v e n   g i n s e n o s i d e ‑ R d   p r e c e d i n g  

c e p h a l o r i d i n e  a d m i n i s t r a t i o n  and i n  c o n t r o l  r a t s  g i v e n  no g i n s e n o s i d e ‑ R d .   I n  c o n t r o l  r a t s ,  

b l o o d ,  r e n a l  and u r i n a r y  p a r a m e t e r s  and t h e  a c t i v i t i e s  o f  a n t i o x i d a t i v e  enzymes i n  r e n a l  t i s ‑

s u e  d e v i a t e d  from t h e  normal r a n g e ,  i n d i c a t i n g  d y s f u n c t i o n  o f  t h e  k i d n e y s .   I n  c o n t r a s t ,  

when g i n s e n o s i d e ‑ R d  was g i v e n  o r a l l y  f o r  3 0  c o n s e c u t i v e  d a y s  p r i o r  t o  c e p h a l o r i d i n e  i n j e c ‑

t i o n ,   t h e  a c t i v i t i e s  o f  t h e  a n t i o x i d a t i o n  enzymes s u p e r o x i d e  d i s m u t a s e  and c a t a l a s e  were 

h i g h e r ,  w h i l e  malondialdehyde l e v e l s  i n  serum and r e n a l  t i s s u e  were l o w e r  i n  t h e  t r e a t e d  r a t s   than i n  t h e  c o n t r o l s .   The urea n i t r o g e n  and c r e a t i n i n e  l e v e l s  i n  serum were d e c r e a s e d  i n  r a t s   g i v e n  g i n s e n o s i d e ‑ R d .   D e c r e a s e d  u r i n e  v o l u m e ,  i n c r e a s e d  u r i n a r y  o s m o t i c  p r e s s u r e ,  and d e   c r e a s e d  u r i n a r y  l e v e l s  o f  g l u c o s e ,  p r o t e i n ,  sodium and potassium demonstrated a  p r o t e c t i v e   a c t i o n  a g a i n s t  t h e  r e n a l  d y s f u n c t i o n  c a u s e d  by c e p h a l o r i d i n e .   I n  a d d i t i o n ,  i t   was demon  s t r a t e d  t h a t  g i n s e n o s i d e ‑ R d  a f f e c t e d  c u l t u r e d  proximal t u b u l e  c e l l s  e x p o s e d  t o  c e p h a l o r i d i n e .  

2 1 )  Yokozawa T . ,  Dong  E . ,   Kawai Y . ,  Gemba M. and Shimizu M . :  P r o t e c t i v e  e f f e c t s  o f   some f l a v o n o i d s  on t h e  r e n a l  c e l l u l a r  membrane. Exp. T o x i c .  P a t h o l . ,  5 1

1 4 ,1 9 9 9 .   By a s s a y i n g  l a c t a t e  dehydrogenase and malondialdehyde l e a k a g e  from LLC‑PK1 c e l l s  i n  c u l ‑ t u r e ,  a  s t u d y  was c o n d u c t e d  t o  c l a r i f y  whether f l a v o n o i d  compounds a m e l i o r a t e  r e n a l  c e l l u   l a r  i n j u r y   The c e l l s   were c u l t u r e d  with v a r i o u s  c o n c e n t r a t i o n s  o f  s a m p l e s  under r o u t i n e   c o n d i t i o n s .   The  r e s u l t s   demonstrated  t h a t   b a i c a l i n ,   c i r s i m a r i t i n ,   6 ‑ h y d r o x y l u t e o l i n ,   l u t e o l i n ,   p l a n t a g i n i n ,   r h o i f o l i n ,   s o r b a r i n ,   a f z e l i n ,   h y p e r i n ,   i s o q u e r c i t r i n ,   i s o r h a m n e t i n ,   k a e m p f e r i t r i n ,  kaempferol 7 ‑ g l u c o s i d e ,  oxyayanin A ,  q u e r c e t i n ,  q u e r c i t r i n ,  rhamnetin and  r u t i n   e x e r t e d   marked p r o t e c t i v e   e f f e c t s   on t h e   c e l l s ,   whereas  a c a c e t i n ,   a p i g e n i n ,   a p i i n ,   c i r s i l i n e o l ,  genkwanin, p e c t o l i n a r i n  and t e t r a m e t h y l q u e r c i t i n  had v i r t u a l l y  no e f f e c t .  

t h e   l i g h t  o f  t h e s e  f i n d i n g s ,  we p r o p o s e  t h a t  t h e  g e n e r a l  c a p a b i l i t y  o f  t h e s e  compounds i s   l a r g e l y   d e c i d e d  by t h e  number and p o s i t i o n  o f  p h e n o l i c  hydroxyl groups l i n k e d  t o   t h e  s t r u c t u r a l   b a c k b o n e .  

2 2 )   Yokozawa T . ,  Liu Z . W . ,  Chen C . P .  and Tanaka T . :  Evaluation o f  c a f f e i c  a c i d  ana‑

l o g u e s  using a c u l t u r e d  r e n a l  e p i t h e l i a l   c e l l   l i n e ,   LLC‑PK1

Pharm.Pharmacol. 

Commun., 5  :  3 6 5 ‑ 3 7 0 ,  1 9 9 9 .  

The e f f e c t s   o f   s e v e r a l   c a f f e i c   a c i d   a n a l o g u e s  i s o l a t e d   from S a l v i a e   M i l t i o r r h i z a e   Radix  c s αl v iαm i l t i o r r h i zαBunge) on t h e  c u l t u r e d  r e n a l  e p i t h e l i a l  c e l l  l i n e ,  LLC P K 1 ,  were s t u d i e d .   I n c u b a t i o n  o f  t h e  c e l l s  with d i f f e r e n t  c o n c e n t r a t i o n s  o f  t h e s e  compounds f o r  4 8  h  markedly  s u p p r e s s e d  l a c t a t e  dehydrogenase l e a k a g e ,  which was e l i c i t e d  when t h e  c e l l s  were e x p o s e d  t o   hypoxia/reoxygenation o r   c e p h a l o r i d i n e .   The most a c t i v e   compounds were magnesium  l i t h o s p e r m a t e   B and  l i t h o s p e r m i c   a c i d   B ,   two t e t r a m e r s   o f   c a f f e i c   a c i d ,   f o l l o w e d   by  l i t h o s p e r m i c  a c i d  ( t r i m e r )  and r o s m a r i n i c  a c i d  ( d i m e r ) .   C a f f e i c  a c i d  showed poor a c t i v i t y .   These r e s u l t s  i n d i c a t e  t h a t  c a f f e i c  a c i d  a n a l o g u e s ,  i n  p a r t i c u l a r  magnesium l i t h o s p e r m a t e  B  and l i t h o s p e r m i c  a c i d  B ,  e x e r t  a  d i r e c t  p r o t e c t i v e  e f f e c t  on r e n a l  c e l l s .  

2 3 )   Yokozawa T . ,  Lee K . I . ,  Kashiwagi H . ,  Cho  E . J .   and Chung H . Y . :  Antioxidant a c t i v ‑

i t y  o f  h e r b a l  t e a s  a v a i l a b l e  on t h e  Korean market.  J .   Food S c i .  N u t r . ,  4 :  9 2 ‑ 9 6 ,  1 9 9 9 .  

The e f f e c t s  o f  aqueous e x t r a c t s  o f  Korean commercial t e a s  on e x c e s s i v e  f r e e  r a d i c a l s  were e x ‑

amined  u t i l i z i n g   s p i n   t r a p p i n g ,   1 , 1 ‑ d i p h e n y l ‑ 2 ‑ p i c r y l h y d r a z y l ( D P P H )   r a d i c a l   and  l i p i d  

p e r o x i d a t i o n .   A p o t e n t  s c a v e n g i n g  e f f e c t  o f  green t e a  and o r i e n t a l  senna t e a  was found 

using s p i n   t r a p p i n g .   The most e f f e c t i v e   t e a   a g a i n s t  t h e  DPPH r a d i c a l   was g r e e n  t e a ,  

f o l l o w e d  i n  o r d e r  by p i n e  l e a f  t e a ,  C h i n e s e  g u t t a  p e r c h a  t e a  and o r i e n t a l  senna t e a .   S i m i l a r l y   t o  t h e  e f f e c t s  o f  DPPH r a d i c a l ,  g r e e n  t e a ,  p i n e  l e a f  t e a ,  C h i n e s e  g u t t a  p e r c h a  t e a  and o r i e n t a l   senna t e a  had an i n h i b i t o r y  e f f e c t  on l i p i d  p e r o x i d a t i o n .   These f i n d i n g s  p r e d i c t  t h a t  Korean  t e a  i s   a  promising m a t e r i a l  f o r  s c a v e n g i n g  f r e e  r a d i c a l s ,  and f o r  c u r i n g  d i s e a s e s  r e l a t e d  t o   f r e e ‑ r a d i c a l  r e a c t i o n s .  

2 4 )   Chen C . P . ,   Yokozawa T .   and Chung H . Y . :   I n h i b i t o r y   e f f e c t   o f   c a f f e i c   a c i d   analogues  i s o l a t e d   from  S a l v i a e   M i l t i o r ・ r h i z a e Radix  a g a i n s t   1 , 1

d iphenyl

2

p i c r y l h y d r a z y l  r a d i c a l .  Exp. T o x i c .  P a t h o l . ,  5 1  :  5 9 ‑ 6 3 ,  1 9 9 9 .  

C a f f e i c  a c i d  and i t s  f o u r  polymers i s o l a t e d  from S a l v i a e  M i l t i o r r h i z a e  Radix were examined  f o r  t h e i r  a c t i v i t y  o f  s c a v e n g i n g  f r e e  r a d i c a l s  i n  a  1 , 1 ‑ d i p h e n y l ‑ 2 ‑ p i c r y l h y d r a z y l  (DPPH) r a d i ‑ c a l  g e n e r a t i n g  s y s t e m .   The r e s u l t s  showed t h a t  t h e  polymers o f  c a f f e i c  a c i d  i n h i b i t e d  t h e   DPPH r a d i c a l  more s t r o n g l y  than c a f f e i c  a c i d .   The s t r o n g e s t  a c t i v i t y  was d i s p l a y e d  by two  t e t r a m e r s ,  l i t h o s p e r m i c  a c i d  Band i t s  Mg2+ s a l t .   The t r i m e r  O i t h o s p e r m i c  a c i d )  and dimer  ( r o s m a r i n i c  a c i d )  showed s i m i l a r  e f f i c i e n c y .  

c o m p a r i s o n ,  c a f f e i c  a c i d  was l e s s  e f f i c i e n t  i n   s c a v e n g i n g  f r e e  r a d i c a l s .   D e t e r m i n a t i o n  o f  t h e  a c t i v i t y  o f  c a f f e i c  a c i d  d e r i v a t i v e s  o f  s m a l l   m o l e c u l e s  r e v e a l e d  t h a t  t h e  o ‑ d i h y d r o x y l  group was t h e  most i m p o r t a n t  a c t i v e  s t r u c t u r e  o f   c a f f e i c  a c i d  d e r i v a t i v e s  f o r  s c a v e n g i n g  o f  f r e e  r a d i c a l s .   Lack o r  s u b s t i t u t i o n  o f  t h i s  s t r u c t u r e   r e s u l t e d  i n  marked r e d u c t i o n  o r  e v e n  l o s s  o f  t h e  a c t i v i t y .   S t r u c t u r a l  m o d i f i c a t i o n  o f  t h e  s i d e   c h a i n  o f  c a f f e i c  a c i d  p r o d u c e d  s l i g h t  c h a n g e s  i n  a c t i v i t y .   The p r e s e n t  r e s u l t s  demonstrate  t h a t  a  s a t u r a t e d  group c o n n e c t e d  t o  t h e  a r o m a t i c  r i n g  has s l i g h t l y  h i g h e r  i n h i b i t o r y  a c t i v i t y   a g a i n s t  t h e  DPPH r a d i c a l  than an u n s a t u r a t e d  g r o u p .  

2 5 )  Kye L S . ,  Jeon Y . S . ,  No  J . K . ,  Kim Y . J . ,  Lee K . H . ,  Shim K . H . ,  Kim J . ,  Yokozawa T .   and Chung H . Y . :  R e a c t i v e  oxygen scavenging a c t i v i t y  o f  g r e e n  t e a  p o l y p h e n o l s .   K o r .  J .  G e r o n t o l . ,  9 :  1 0 ‑ 1 7 ,  1 9 9 9 .  

R e a c t i v e  oxygen s p e c i e s  (ROS), s u c h  a s  0 2 ,  H 2 0 2 ,  and  ・ ^{OH,m e d i a t e  r e a c t i o n s  which c a n  r e ‑}

s u l t  i n  t h e  damage o f  c r i t i c a l  b i o l o g i c a l  m o l e c u l e s  i n c l u d i n g  DNA  and c e l l u l a r  p r o t e i n .   I n  t h e   p r e v i o u s  s t u d i e s ,  g r e e n  t e a  p o l y p h e n o l s  were found t o  c o n t a i n  b i o l o g i c a l  and p h a r m a c o l o g i ‑ c a l  a c t i v i t i e s  t h a t  many c o n t r i b u t e  t o  c h e m o p r e v e n t i v e  e f f e c t s .   However, a l m o s t  no i n f o r m a ‑ t i o n  was known on e f f e c t s  o f  g r e e n  t e a  components a g a i n s t  e a c h  s p e c i f i c  ROS s u c h  a s ・ OH, 02 and H 2 0 2 .   The p u r p o s e  o f  t h i s  p r e s e n t  study was t o  i n v e s t i g a t e  t h e  ROS s c a v e n g i n g  e f ‑ f e c t s  o f  g r e e n  t e a  p o l y p h e n o l s  a g a i n s t  e a c h  s p e c i e s  o f  ROS u s i n g  DCFDA a s s a y .   Green t e a   p o l y p h e n o l s ,  (  ) ‑ e p i c a t e c h i n  3 ‑ 0 ‑ g a l l a t e  (ECG), (  ) ‑ g a l l o c a t e c h i n  3 ‑ 0 ‑ g a l l a t e  (GCG), 

e p i g a l l o c a t e c h i n  3 ‑ 0 ‑ g a l l a t e  (EGCG), 

e p i g a l l o c a t e c h i n(EGC), ( ‑ ) ‑ e p i c a t e c h i n  (EC) and  ( + ) ‑ c a t e c h i n  ( C )  s i g n i f i c a n t l y  showed ROS s c a v e n g i n g  a c t i v i t y  i n  l i v e r  and k i d n e y  homogen‑

a t e .   E s p e c i a l l y ,  ECG, GCG  and EGCG showed t h e  p o t e n t  ROS s c a v e n g i n g  a c t i v i t y ,  which i n

d i c a t e s  t h a t  t h e  g a l l o y l  group may b e  a c t i v e  c h e m i c a l  moiety t h a t  i s   r e s p o n s i b l e  f o r  t h i s  

s c a v e n g i n g  a c t i v i t y .   We  a l s o  examined t h e  e f f e c t s  o f  ECG, GCG  and EGCG on ROS t o  e l u c i ‑

d a t e  t h e  s c a v e n g i n g  a c t i v i t y  a g a i n s t  02 ， ・ OHand/or H 2 0 2 .   As t h e  r e s u l t s ,  ECG, GCG, and 

EGCG remarkably s c a v e n g e d  t h e  ROS.  These r e s u l t s  s u g g e s t  t h a t  g r e e n  t e a  p o l y p h e n o l s ,   ECG,  GCG, and  EGCG h a v i n g   m u l t i p l e   g a l l o y l   groups  and  f l a v a n ‑ 3 ‑ o l ,   show p o t e n t   a n t i o x i d a t i v e  a c t i o n  through ROS s c a v e n g i n g  a c t i v i t y .  

2 6 )  Kye L S . ,  Jeon Y . S . ,  Soung D . Y . ,  Rhee S . H . ,  Kim J . ,  Yokozawa T . ,  Chung H.Y. and  Lee K . H . :  C y t o p r o t e c t i v e  mechanisms o f  g r e e n  t e a  p o l y p h e n o l s  i n  c u l t u r e d  l i v e r   c e l l s .  J .  K o r .  A s s o c .  Cancer P r e v . ,  4

1 6 ,1 9 9 9 .  

Oxygen i s  e s s e n t i a l  f o r  human l i f e ,  y e t  i t   i s   dangerous t o  a l l  a e r o b i c  o r g a n i s m s .   T h i s  i s  b e ‑ c a u s e  some oxygen i s  m e t a b o l i z e d  t o  o x y g e n ‑ d e r i v e d  f r e e  r a d i c a l s  and o t h e r  f r e e  r a d i c a l  s p e ‑ c i e s   w h i c h ,  i n   e x c e s s ,   c a n  c a u s e  t h e   c e l l   i n j u r y  and b e  o p p o s e d  by a n t i o x i d a n t  d e f e n c e   s y s t e m s .   N i t r i c  o x i d e  (NO

i s   known t o  t h e  o x i d a n t  i n j u r y  v i a  p r o d u c t i o n  o f  t h e  p o t e n t   o x i d a n t  p e r o x y n i t r i t e   (ONOO )  . I n  t h i s   s t u d y ,   3 ‑ m o r p h o l i n o s y d n o n i m i n e  ( S I N ‑ 1 ) ,   2 , 2 ‑ a z o b i s [ 2 , 4 ‑ d i m e t h y l v a l e r o n i t r i l e ]   (AMVN), sodium n i t r o p r u s s i d e   ( S N P ) ,   H202 and  t e r t ‑ b u t y l  h y d r o p e r o x i d e  C t

BHP)which c a n  p r o d u c e  i n t r a c e l l u l a r  f r e e  r a d i c a l s ,  t h e  c a u s e  o f  t i s ‑ s u e  damage and l i p i d  p e r o x i d a t i o n ,  were u s e d  f o r  e l u c i d a t i n g  c y t o p r o t e c t i v e  mechanisms o f  

（一）−

e p i c a t e c h i n 3 ‑ 0 ‑ g a l l a t e   (ECG),  (  ‑) ‑ g a l l o c a t e c h i n   3 ‑ 0 ‑ g a l l a t e   (GCG),  and 

e p i g a l l o c a t e c h i n  3 ‑ 0 ‑ g a l l a t e  (EGCG) e x t r a c t e d  from g r e e n  t e a  a g a i n s t  f r e e  r a d i c a l s .   The  t r e a t m e n t  w i t h  ECG, GCG and EGCG markedly r e d u c e d  c e l l   damage i n d u c e d  by S I N ‑ 1 ,   AMVN, H 2 0 2  and t‑BHP i n  c u l t u r e d  AcF2 l i v e r  c e l l s .   On t h e  o t h e r  h a n d ,  i n  c a s e  o f  SNP, c e l l   v i a b i l i t y   was n o t  d e p e n d e n t  on t h e   c o n c e n t r a t i o n  and k i n d s  o f   g r e e n  t e a   p o l y p h e n o l s .   T h e r e f o r e ,   we c a n  p o s t u l a t e   t h a t   g r e e n   t e a   p o l y p h e n o l s   i n h i b i t p e r o x y n i t r i t e   f o r m a t i o n   through t h e i r  02 s c a v e n g i n g  a s  w e l l  a s  d i r e c t p e r o x y n i t r i t e  s c a v e n g i n g .  

2 7 )   Chen C . P . ,  Yokozawa T .  and Tanaka T . :  P r o t e c t i v e  e f f e c t  o f  Sanguisorbae Radix  a g a i n s t  a p o p t o s i s  and f u n c t i o n  o f  r e n a l  t i s s u e s  s u b j e c t e d  t o  i s c h e m i a ‑ r e p e r f u s i o n .   J .  T r a d .  M e d . ,  1 6 :  9 7 ‑ 1 0 1 ,  1 9 9 9 .  

DNA  l a d d e r s  were d e t e c t e d  by g e l  e l e c t r o p h o r e s i s  o f  DNA  o b t a i n e d  from r a t  k i d n e y  s u b j e c t e d   t o  6 0  min o f  i s c h e m i a  f o l l o w e d  by 2 4  h  o f  r e p e r f u s i o n ,  i n d i c a t i n g  t h e  i n v o l v e m e n t  o f  a p o p t o s i s   i n  i s c h e m i a ‑ r e p e r f u s i o n  i n j u r y .   T h i s  l a d d e r  f o r m a t i o n  was s i g n i f i c a n t l y  i n h i b i t e d  by o r a l  a d ‑ m i n i s t r a t i o n   o f   S a n g u i s o r b a e   Radix  e x t r a c t   t o   r a t s   f o r   3 0   d a y s   p r i o r   t o   i s c h e m i a ‑ r e p e r f u s i o n .   I n  a d d i t i o n ,  b l o o d  l e v e l s  o f  u r e a  n i t r o g e n  and c r e a t i n i n e ,  two p a r a m e t e r s  o f   r e n a l  f u n c t i o n ,  were markedly l o w e r  i n  t h e  S a n g u i s o r b a e  R a d i x ‑ t r e a t e d  a n i m a l s  t h a n  i n  t h e   u n t r e a t e d  c o n t r o l s .   These r e s u l t s  s u g g e s t  t h a t  S a n g u i s o r b a e  Radix h a s  p o t e n t i a l  f o r  a t t e n u ‑ a t i n g  r e n a l  i n j u r y  and a c c e l e r a t i n g  t h e  r e c o v e r y  o f  r e n a l  f u n c t i o n  a f t e r  i s c h e m i a ‑ r e p e r f u s i o n   i n j u r y ,  which might i n v o l v e  i n h i b i t i o n  o f  a p o p t o s i s .  

2 8 )   Yokozawa T . ,  Kim D . W . ,  H a t t o r i  M. and K a j i  T :  E f f e c t  o f  Luobuma l e a v e s  a g a i n s t   o x i d a t i o n  o f  l o w ‑ d e n s i t y  l i p o p r o t e i n :  a  c e l l  c u l t u r e  a s s a y .  J .  T r a d .  M e d . ,  1 6 :  1 4 1 ‑ 1 4 7 ,  1 9 9 9 .  

I n  a  p r e v i o u s  s t u d y ,  we o b s e r v e d  an improvement i n  t h e  a t h e r o s c l e r o s i s  i n d e x ,  t o g e t h e r  w i t h  

a d e c r e a s e   i n   b l o o d  c h o l e s t e r o l ,   i n   r a t s   g i v e n  Luobuma e x t r a c t   o r a l l y   and f e d   a h i g h ‑ c h o l e s t e r o l  d i e t .   The p r e s e n t  s t u d y  was d e s i g n e d  t o  examine t h e  f u n c t i o n  o f  o x i d i z e d  l o w ‑ d e n s i t y  l i p o p r o t e i n  (LDL) i n  a t h e r o s c l e r o t i c  l e s i o n s ,  u s i n g  c u l t u r e d  c e l l s .   When e n d o t h e l i a l   c e l l s   were c u l t u r e d  w i t h  LDL i n   t h e  p r e s e n c e  o f  C u 2 + ,   t h e  r e l e a s e   o f   t h i o b a r b i t u r i c  a c i d   ( T B A ) ‑ r e a c t i v e  s u b s t a n c e  and l a c t i c  d e h y d r o g e n a s e  i n t o  t h e  c u l t u r e  medium was i n c r e a s e d ,   w i t h  a  d e c r e a s e  i n  c e l l  v i a b i l i t y .   However, when Luobuma e x t r a c t  was a l s o  p r e s e n t  i n  t h e  c u l ‑ t u r e  medium, c h a n g e s  i n  t h e s e  p a r a m e t e r s  were more f a v o r a b l e .   I n  a n o t h e r   i n  v i t r o   system  u s i n g  m a c r o p h a g e s ,  t h e  l e v e l s  o f  T B A ‑ r e a c t i v e  s u b s t a n c e ,  t o t a l  c h o l e s t e r o l  and e s t e r i f i e d  c h a ‑ l e s t e r o l  w e r e  a l l  s i g n i f i c a n t l y  l o w e r  i n  t h e  p r e s e n c e  o f  Luobuma e x t r a c t  than i n  i t s  a b s e n c e .   There was a l s o  m o r p h o l o g i c a l  e v i d e n c e  t h a t  foam c e l l   f o r m a t i o n  through i n c o r p o r a t i o n  o f   o x i d i z e d  LDL was s u p p r e s s e d .   These f i n d i n g s  i n d i c a t e  t h a t  Luobuma s u p p r e s s e s  t h e  p r o ‑ g r e s s i o n  o f  a t h e r o s c l e r o s i s ,  i n  which o x i d i z e d  LDL i s   i n v o l v e d .  

2 9 )  No J . K . ,  Soung D . Y . ,  Kim Y . J . ,  Shim K . H . ,  Jun Y . S . ,  Rhee S . H . ,  Yokozawa T .  and  Chung H . Y . :  I n h i b i t i o n  o f  t y r o s i n a s e  by green t e a  components. L i f e  S c i e n c e s ,  6 5 :   PL241‑PL246, 1 9 9 9 .  

The pigment melanin i n  human s k i n  i s   a  major d e f e n s e  mechanism a g a i n s t  u l t r a v i o l e t  l i g h t   o f  t h e  s u n ,  b u t  darkened s k i n  c o l o r ,  which i s   t h e  r e s u l t  o f  i n c r e a s e d  and r e d i s t r i b u t e d  e p i d e r ‑ mal m e l a n i n ,  c o u l d  b e  a  s e r i o u s  a e s t h e t i c  p r o b l e m .   E p i d e m i o l o g i c a l l y ,  i t   i s   w e l l  known t h a t   t h e  consumption o f  g r e e n  t e a  may h e l p  p r e v e n t  c a n c e r s  i n  humans and a l s o  r e d u c e  s e v e r a l   f r e e  r a d i c a l s  i n c l u d i n g  p e r o x y n i t r i t e .   I n  t h e  p r e s e n t  s t u d y ,  t o  a s s e s s  t h e  e f f i c a c y  o f  t h e  i n h i ‑ b i t i o n  o f  mushroom t y r o s i n a s e   (monophenol monooxygenase EC 1 . 1 4 . 1 8 . 1 ) ,   t e n  k i n d s  o f   Korean t r a d i t i o n a l  t e a s  were s c r e e n e d  f o r  t h e i r  t y r o s i n a s e  i n h i b i t o r y  a c t i v i t y .   Green t e a  was  t h e  s t r o n g e s t  i n h i b i t o r ,  and t h e  major a c t i v e  c o n s t i t u e n t s  i n  t h e  t e a  a r e  (  ) ‑ e p i c a t e c h i n  3  0 ‑ g a l l a t e   (ECG), (  ) ‑ g a l l o c a t e c h i n  3 ‑ 0 ‑ g a l l a t e   (GCG), and 

e p i g a l l o c a t e c h i n3  0 ‑ g a l l a t e   (EGCG).  A l l  a r e  c a t e c h i n s  w i t h  g a l l i c  a c i d  group a s  an a c t i v e  s i t e .   The k i n e t i c  a n a l y s i s  f o r   i n h i b i t i o n  o f  t y r o s i n a s e  r e v e a l e d  a  c o m p e t i t i v e  n a t u r e  o f  GCG w i t h  t h i s  enzyme f o r  t h e  L ‑ t y r o s i n e  b i n d i n g  a t  t h e  a c t i v e  s i t e  o f  t y r o s i n a s e .  

3 0 )   Yokozawa T . ,   Nakagawa T . ,   Lee K . I . ,   Cho E . J . ,   Terasawa K. and Takeuchi S . :   E f f e c t s  o f  green t e a  t a n n i n  on c i s p l a t i n ‑ i n d u c e d  nephropathy i n  LLC‑PK1 c e l l s  and  r a t s .  J .  Pharm. P h a r m a c o l . ,  5 1 :  1 3 2 5 ‑ 1 3 3 1 ,  1 9 9 9 .  

A s t u d y  was c o n d u c t e d  t o  c l a r i f y  whether g r e e n  t e a  t a n n i n  a m e l i o r a t e s  c i s p l a t i n ‑ i n d u c e d   r e n a l  i n j u r y  i n   terms o f  l a c t a t e  d e h y d r o g e n a s e  and m a l o n d i a l d e h y d e  l e a k a g e  from LLC‑

PK1 c e l l s  i n  c u l t u r e .   Green t e a  t a n n i n  was shown t o  s u p p r e s s  t h e  c y t o t o x i c i t y  o f  c i s p l a t i n ,  

t h e  s u p p r e s s i v e  e f f e c t  i n c r e a s i n g  w i t h  t h e  d o s e  o f  g r e e n  t e a  t a n n i n .   The e f f e c t  o f  c i s p l a t i n  

was t h e n  i n v e s t i g a t e d  i n  r a t s  g i v e n  g r e e n  t e a  t a n n i n  f o r  4 0  days b e f o r e  c i s p l a t i n  a d m i n i s t r a ‑

t i o n  and i n  c o n t r o l  r a t s  g i v e n  no g r e e n  t e a  t a n n i n .  

c o n t r o l  r a t s ,  b l o o d ,  u r i n a r y  and r e n a l  

p a r a m e t e r s  and t h e  a c t i v i t i e s  o f  a n t i o x i d a t i v e  enzymes i n  r e n a l  t i s s u e  d e v i a t e d  from t h e  n o r ‑

mal r a n g e ,  i n d i c a t i n g  d y s f u n c t i o n  o f  t h e  k i d n e y s .   I n  c o n t r a s t ,  r a t s  g i v e n  g r e e n  t e a  t a n n i n