平成26年度 厚生労働科学研究費補助金（食品の安心・安全確保推進研究事業）
分担研究報告書
研究課題名：食品添加物等における遺伝毒性評価のための戦略構築に関する研究 分担研究課題名：食品添加物における遺伝毒性発がん物質の評価法に関する研究
分担研究者： 續 輝久 九州大学大学院医学研究院基礎医学部門 生体制御学講座 基礎放射線医学（分子遺伝学）分野 教授
研究要旨
食品添加物等の遺伝毒性に対する閾値形成機構について検討するために、低用量臭素 酸カリウムを経口投与して発がん実験を行い、Mutyh遺伝子欠損マウスへ臭素酸カリウ ムを投与する発がん・突然変異誘発の実験系は、遺伝毒性に対する閾値形成機構につい て検討する上で、有用な評価系であることが示された。昨年度に引き続き、Mutyh遺伝 子が欠損した個体でも酸化剤の発がん性に関して「閾値」が存在することを示唆する結 果を得た。さらに「閾値」周辺の低用量臭素酸カリウムによる誘発突然変異の解析を行 った結果、酸化剤の突然変異誘発に関しても「閾値」が存在することを示唆する結果を 得た。
キーワード: 臭素酸カリウム、Mutyh遺伝子、rpsLトランスジェニックマウス
Ａ．研究目的
遺伝毒性物質の作用には一般に閾値がないと されており、どのように微量であってもヒトに対 してリスクを示すと考えられている。このため遺 伝毒性を示す発がん物質には ADI （Acceptable Daily Intake）が設定されず、食品添加物等に発 がん性が認められた場合、その発生機序に遺伝毒 性が関与するかは、行政上重要な問題になってい る。だが、ヒトにはさまざまな生体防御機能（DNA 修復、解毒代謝、損傷乗り越えDNA合成、アポ トーシスなど）が備わっており、ある限度（閾値）
以下の作用は、事実上無毒化される可能性が考え られる。
生命にとって必須の酸素は、エネルギー産生系 で利用される際に活性酸素種の生成を伴い、遺伝 情報を司るDNA、RNA並びにそれらの前駆体を
酸化する。これら内在性の酸素ストレスに加え、
環境中の放射線や遺伝毒性を示すある種の化学 物質、さらには感染に伴う炎症によっても活性酸 素種が生じている。活性酸素種は生体高分子を酸 化し、発がんや老化を引き起こす。様々な酸化的 損傷の中で、核酸のグアニン塩基の酸化体8-オキ ソグアニン（8-oxoG）は遺伝情報保持及び伝達に 異常を引き起こす点で最も重要である。8-oxoG はシトシンと同程度にアデニンとも対合できる ので、DNA中の8-oxoGは突然変異の原因となる。
8-oxoG による突然変異生成に対処するために生
物は種々の酵素系を持っている。ヒトでは、OGG1 が DNA 中の 8-oxoG を取り除き、MUTYH が
8-oxoG に対して取り込まれたアデニンを除去す
る。また MTH1 はヌクレオチドプール中に生じ た 8-oxo-dGTP を 分 解 し 、DNA 複 製 の 際 に
8-oxoGがDNAへ取り込まれるのを防いでいる。
我々はこれらの酵素の遺伝子を欠損したマウス を樹立し、これらのマウスでは自然発がんが上昇 していることを示し、酸化DNA損傷が自然発が んの要因であることを明らかにしてきた。さらに Mutyh 遺伝子欠損マウスに酸化剤である臭素酸 カリウムの 0.2%溶液を経口投与すると、野生型 マウスと比較すると突然変異および発がん頻度 が劇的に上昇することを見出し、Mutyh遺伝子が 酸化による遺伝毒性に対する閾値形成に関与し ている可能性を指摘した。一方、低用量（0.05%）
臭素酸カリウムを経口投与した場合には発がん 頻度の有意な上昇は認められず、Mutyh遺伝子が 欠損した個体でも遺伝毒性に対する閾値が形成 されている可能性を見出した。
本年度は、この実験系を用いて遺伝毒性に対す る閾値形成機構についてさらに検討するために、
比較的低用量域（0.05-0.15%）の臭素酸カリウム を経口投与して発がん実験を行うと共に、rpsL- トランスジェニック（Tg）マウスを用いて突然変 異解析を実施した。
Ｂ．研究方法
1) Mutyh遺伝子欠損マウスの飼養
C57BL6/Jの遺伝的背景を持つMutyh遺伝子 欠損マウスのへテロ接合体同士の掛け合わせに よりMutyh遺伝子欠損マウスと対照群の野生型 マウスを得た。また、rpsL-Tgマウスとの交配を 行い、Mutyh遺伝子欠損／rpsL-Tgマウスと対照 群の野生型／rpsL-Tgマウスを得た。マウスの飼 養については、九州大学遺伝子組換え実験安全管 理規則並びに動物実験規則に従って実施した。
2) 臭素酸カリウム溶液の投与
臭素酸カリウム（Sigma-Aldrich）を純水に溶 解し、0.05〜0.15%溶液を調製後に濾過滅菌し、
マウスの飲料水とした。投与法としては、発がん 解析には１６週間、突然変異の解析には４週間自 由飲水で行い、消費量については週一回モニター した。
3) 発がん実験
６週齢の野生型およびMutyh遺伝子欠損マウス に臭素酸カリウムを１６週間投与した後、安楽死 させたマウスから腸管を摘出して4%パラフォル ムアルデヒドを用いて固定した。その後、固定液
を70%エタノールに置換えて、腸粘膜を実体顕微
鏡下で観察し、腫瘍の形成を確認した。
4) 突然変異解析
４週齢のrpsL-Tgを持つ野生型およびMutyh遺 伝子欠損マウスに臭素酸カリウムを４週間投与 後、通常の飲み水に切り替えてさらに２週間飼養 した後、安楽死させたマウスから摘出した腸管か らDNAを抽出し、rpsL遺伝子突然変異解析法に 従い、誘発突然変異の解析を行った。
5) 統計的手法
すべての測定値について平均値と標準偏差を求 めた。
Ｃ．研究結果
１）臭素酸カリウム誘発消化管発がん
これまでの Mutyh 遺伝子欠損マウスを用いた 0.2%臭素酸カリウム溶液を１６週間連続飲水投 与した誘発消化管発がん実験では、Mutyh遺伝子 遺伝子欠損マウスの十二指腸・空腸で多数の上皮 性腫瘍の発生を認めた。一方、低用量の0.05%臭 素酸カリウムを経口投与して発がん実験を行っ た結果、0.05%臭素酸カリウムの投与ではMutyh 遺伝子欠損マウスの十二指腸・空腸には上皮性腫 瘍を発生させなかった。
昨年度に引き続き、遺伝毒性に対する閾値形成 について詳細に検討するため、マウスを追加して 0.05〜0.15%臭素酸カリウムを経口投与して発が ん実験を行った。これまでと同様に、0.10〜0.20%
臭素酸カリウム溶液の用量では、Mutyh遺伝子遺 伝子欠損マウスの十二指腸・空腸でそれぞれ、用 量依存的に上皮性腫瘍の発生を認めが、0.05%投 与群では発がんは認められなかった。
2）臭素酸カリウム誘発突然変異
上述のように Mutyh 遺伝子が欠損した個体で も酸化剤臭素酸カリウムによる発がん性に関し て「閾値」が存在することを示唆する結果を得た。
この実験系における遺伝毒性に対する閾値形成 機構についてさらに検討するために、「閾値」周 辺の低用量臭素酸カリウムによる誘発突然変異 の解析を行った。0.10%および 0.15%投与群を用 いた突然変異解析の結果では、野生型マウスに比 べて Mutyh 遺伝子欠損マウスでは全体の突然変 異頻度がそれぞれ約1.5倍および1.8倍上昇して いた。一方、0.05%投与群のMutyh遺伝子欠損マ ウスの突然変異は、野生型マウスの突然変異頻度 とほぼ同程度（0.94 倍）であった。8-oxoG に起 因すると考えられる G:C→T:A 型の変異頻度を Mutyh 遺伝子欠損マウスと野生型マウスで比較 すると、0.10%投与群では約 5.2 倍、0.15%投与 群では約 9.1 倍上昇していたが、0.05%投与群で は非投与群における比率（約3.3倍）と同程度の 約3.7倍しか上昇していなかった（図１）。
図１ 野生型および Mutyh 遺伝子欠損マウスの 小腸における KBrO3誘発突然変異のスペクトル 別の比
Ｄ．考 察
遺伝毒性物質の作用には閾値がないとされる ため、遺伝毒性に基づく発がん作用が検出された 場合には、食品添加物等にはADIが設定されない。
しかし、遺伝毒性発がん物質であっても「事実上 の閾値」（それ以下では有意な発がん頻度の上昇 が見られない用量）のあることが示唆されている
（Carcinogenesis, 26, 1835-1845, 2005）。ヒトに はさまざまな生体防御機構（DNA修復、解毒代 謝、誤りのない損傷乗り越えDNA合成、アポト ーシス等）が存在し、これらが遺伝毒性発がん物 質の作用を抑制し「事実上の閾値」を形成する可 能性が考えられる。本研究では、酸化DNA損傷 に起因する突然変異を抑制するMutyh遺伝子を 欠損したマウスを用い、パンの製造過程でも使用 され酸化ストレスを負荷することが知られてい る食品添加物の臭素酸カリウムを投与する実験 を行い、DNA修復が遺伝毒性に関する「事実上 の閾値」形成に貢献する可能性について検討する ための試験系の樹立をめざした。
Mutyh遺伝子欠損マウスを用いた臭素酸カリ ウム溶液投与による誘発消化管発がん実験の結 果、0.1%〜0.2%臭素酸カリウムを投与された Mutyh遺伝子欠損マウス群では1個体当たりの 小腸発がんの発生数は投与された臭素酸カリウ ムの濃度に相関して増加したが、0.05%臭素酸カ リウム投与群のMutyh遺伝子欠損マウスでは追 加実験分も含めて全く腫瘍の発生が認められな かった。これらの結果は、臭素酸カリウムによる 消化管発がんには閾値が存在し、その形成に Mutyh遺伝子が関与していることを示している。
また、Mutyh遺伝子が欠損した個体においても臭 素酸カリウムの発がん性に関して「閾値」が存在 することを示している。
臭素酸カリウムによる誘発突然変異解析の結 果、Mutyh遺伝子欠損マウスでは酸化DNA損傷 に起因するG:C→T:A型の変異頻度が野生型マウ スと比較して、非投与群では3.3倍、0.05%では 3.7倍、0.10%では5.2倍、0.15%では9.1倍、0.20%
では11.8倍上昇する。このG:C→T:A型変異の誘 発頻度の上昇は、臭素酸カリウムによる小腸発が ん頻度の上昇と良く一致していることから、臭素 酸カリウムによる消化管発がんにみられる閾値 の形成には、酸化DNA損傷に起因する突然変異 の発生を効率良く抑制するMutyh遺伝子がコー ドするアデニンDNAグリコシラーゼの機能が関 与していることを示唆している。
酸化ストレスによって自然発がんが生じるこ とは既に複数のDNA修復系の遺伝子改変マウス を用いて明らかになっている。Mutyh遺伝子欠損 マウスはヒトの遺伝性大腸がん（MAP:
MUTYH-associated polyposis）の疾患モデルで あり、消化管における自然発がんの発生頻度が野 生型マウスに比して有意に上昇している。このよ うにMutyh遺伝子の欠損という酸化ストレス誘 発発がんに最も感受性が高いマウス個体を用い て発がん感受性や遺伝毒性に関する研究を行う ことで、遺伝毒性に対するMutyh遺伝子産物以 外の多重の防御機構の寄与を明らかにすること が可能となる。すなわち、食品添加物として使用 されている化学物質臭素酸カリウムの低用量に 起因する酸化ストレスによる消化管発がんを、他 の修復系やDNA損傷応答系等でどの程度まで抑 制できるのかを明らかにできると考えられる。今 回の低用量（0.05%）臭素酸カリウム投与群にお ける発がん性および突然変異誘発に関する研究 成果は、このことを強く示唆している。
Ｅ．結 論
Mutyh 遺伝子マウスへ臭素酸カリウムを投与 する発がん実験系は、遺伝毒性に対する閾値形成 機構について検討する上で有用な試験系である と考えられる。また、Mutyh遺伝子産物は酸化剤 の遺伝毒性に関する「事実上の閾値」形成に貢献 していると示唆される。
F．健康危機情報 特になし
G. 研究発表
論文発表 〔学術雑誌〕
1. Piao, J., Nakatsu, Y., Ohno, M., Taguchi, K.
and Tsuzuki, T., Mismatch repair deficient mice show susceptibility to oxidative stress-induced intestinal carcinogenesis.
Int. J. Biol. Sci., 10 (1): 73-79 （2014） ［査 読有］
2. Takahashi-Yanaga, F., Yoshihara, T., Jingushi, K., Igawa, K., Tomooka, K., Watanabe, Y., Morimoto, S., Nakatsu, Y., Tsuzuki, T., Nakabeppu, Y. and Sasaguri, T., DIF-1 inhibits tumor growth in vivo reducing phosphorylation of GSK-3b and expressions of cyclin D1 and TCF7L2 in cancer model mice, Biochem. Pharmacol., 89, 340-348 (2014) ［査読有］
3. Ohno, M., Sakumi, K., Fukumura, R., Furuichi, M., Iwasaki, Y., Hokama, M., Ikemura, T., Tsuzuki, T., Gondo, Y. and Nakabeppu, Y., 8-Oxoguanine causes spontaneous de novo germline mutations in mice, Scientific Reports, 4:4689 DOI:
10.1038/srep04689 (2014) ［査読有］
4. Isoda, T., Nakatsu, Y., Yamauchi, K., Piao, J., Yao, T., Honda, H., Nakabeppu, Y., Tsuzuki, T., Abnormality in Wnt signaling is causatively associated with oxidative stress-induced intestinal tumorigenesis in MUTYH-null mice, Int. J. Biol. Sci., 10 (8), 940-947 (2014) ［査読有］
5. Kyuragi, R., Matsumoto, T., Harada, Y., Saito, S., Onimaru, M., Nakatsu, Y., Tsuzuki, T., Nomura, M., Yonemitsu, Y., Maehara, Y., BubR1 insufficiency inhibits neointimal hyperplasia through impaired vascular smooth muscle cell proliferation in mice, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 35, 341-347 (2015) ［査読有］
6. Kanao, R., Yokoi, M., Ohkumo, T., Sakurai, Y., Dotsu, K., Kura, S., Nakatsu, Y.,
Tsuzuki, T., Masutani, C., Hanaoka, F., UV-induced mutations in epidermal cells of mice defective in DNA polymerase and/or DNA Repair, in press (2015)［査 読有］
学会発表
1. 2014 年 12 月 10 日 Teruhisa Tsuzuki, Mizuki Ohno, Noriko Takano, Kenichi Taguchi, Yusaku Nakabeppu, Yasunobu Aoki, Takehiko Nohmi, Yoshimichi Nakatsu ［ Oxidative stress-induced intestinal tumors in Mutyh-deficient mice treated with low doses of potassium bromate ］ 4th Asian Conference on Environmental Mutagen, Kolkata, India
［12月10 日〜12日］ 招待講演（旅費等 は新学術領域研究の方から支出）
2. 2014年12月5日、Mutyh遺伝子欠損マウ スにおける酸化ストレス誘発突然変異の解 析、鷹野典子、大野みずき、稲葉洋平、志村 勉、欅田尚樹、中別府雄作、中津可道、續輝 久 ［ Oxidative DNA damage-induced mutagenesis in Mutyh-deficient mice, Noriko Takano, Mizuki Ohno, Yohei Inaba, Tsutomu Shimura, Naoki Kunugida, Yusaku Nakabeppu, Yoshimichi Nakatsu, Teruhisa Tsuzuki］日本環境変異原学会第 43回大会、東京［12月4日〜5日］
3. 2014年12月5日、Mutyh遺伝子欠損マウ スを用いた酸化ストレス誘発消化管がんの 解析、大野みずき、鷹野典子、佐々木史子、
田口健一、中別府雄作、青木康展、能美健彦、
中津可道、續輝久［Oxidative stress-induced intestinal tumors in Mutyh deficient mice, Mizuki Ohno, Noriko Takano, Fumiko Sasaki, Kenichi Taguchi, Yusaku Nakabeppu, Yasunobu Aoki, Takehiko Nohmi, Yoshimichi Nakatsu, Teruhisa Tsuzuki］日本環境変異原学会第43回大会、
東京［12月4日〜5日］
4. 2014年11月26日、非標的部位におけるミ スマッチの配列変換（遺伝子修復）への影響、
西垣奈津希、池田彰弘、湯川誠也、守田由子、
中津可道、續輝久、原島秀吉、紙谷浩之、日
本分子生物学会第 37 回年会，横浜［11 月 25日〜27日］
5. 2014年11月25日、Mutyh遺伝子欠損マウス
における酸化ストレス誘発突然変異の解析、
鷹野典子、大野みずき、稲葉洋平、志村勉、
欅田尚樹、中別府雄作、中津可道、續輝久、
日本分子生物学会第37回年会、横浜［11月 25日〜27日］
6. 2014年11月25日、8-oxoguanine に起因する de novo germline mutation の解析、作見邦 彦、大野みずき、福村龍太郎、権藤洋一、岩 﨑裕貴、池村淑道、續輝久、中別府作、日本 分子生物学会第37回年会、ワークショップ：
生命の起源・進化・本質、横浜［11月25日
〜27日］
7. 2014 年 10 月 29 日 、 Oxidative stress-induced intestinal tumors in Mutyh-deficient mice treated with low doses of potassium bromate、Teruhisa Tsuzuki, Mizuki Ohno, Noriko Takan1, Kenichi Taguchi, Yusaku Nakabeppu, Yasunobu Aoki, Takehiko Nohmi, Yoshimichi Nakatsu, 5th US-Japan DNA Repair Meeting, Grand XIV Naruto, Tokushima［10月28日〜31日］招待講演 8. 2014年10月2日、酸化ストレス誘発突然変 異と消化管がん解析、大野みずき、鷹野典子、
佐々木史子、橋詰拓弥、李賛、田口健一、中 別府雄作、中津可道、續輝久、日本放射線影 響学会第57回大会，鹿児島［10月1日〜3 日］
9. 2014年10月2日、ミスマッチ修復欠損マウ スにおける酸化ストレス誘発突然変異の解 析、橋詰拓弥、中津可道、大野みずき、佐々 木史子、鷹野典子、續輝久、日本放射線影響 学会第57回大会，鹿児島［10月1日〜3日］
10. 2014年10月1日、DNA修復欠損マウスを 用いた発がん研究：低用量化学物質投与研究 から見えること、續輝久、シンポジウム：低 線量・低線量率放射線による発がんを考える、
日本放射線影響学会第57回大会，鹿児島［10 月1日〜3日］
11. 2014年9月27日、Oxidative stress-induced mutagenesis and tumorigenesis in the small intestine of Mutyh-deficient mice treated with low doses of potassium bromate、Mizuki Ohno, Noriko Takano, Yoshimichi Nakatsu, Yusaku Nakabeppu, Teruhisa Tsuzuki［低用量臭素酸カリウムの 飲水投与によりMutyh遺伝子欠損マウスの 消化管で誘発された突然変異並びに発がん の解析 、大野みずき、鷹野典子、中津可道、
中別府雄作、續輝久］、日本癌学会第73回学 術総会、横浜［9月25日〜27日］
12. 2014年9月27日、Microsatellite instability is induced by DNA replication stress in association with massive induction of mutations、Yuko Atsumi, Kotoe Katayama, Teppei Shimamura, Yoshimichi Nakats5, Mitsuko Masutani, Satoru Miyano, Hitoshi Nakagama, Teruhisa Tsuzuki, Ken-ichi Yoshioka［マイクロサテライト不 安定性は変異導入を伴ってDNA 複製スト レス下で誘導される、熱海悠子、片山琴絵、
島村徹平、中津可道、益谷美都子、宮野悟、
中釜斉、續輝久、吉岡研一］、日本癌学会第 73回学術総会、横浜［9月25日〜27日］
13. 2014年9月26日、DIF-1 inhibits tumor growth in vivo reducing phosphorylation of GSK-3b and expressions of cyclin D1 and TCF7L2、Fumi Takahashi, Yoshimichi Nakatsu, Teruhisa Tsuzuki, Yusaku Nakabeppu, Toshiyuki Sasaguri ［DIF-1 はGSK-3βのリン酸化抑制と cyclin D1 お よび TCF7L2の発現低下により抗腫瘍効果 を発揮する、高橋富美、中津可道、續輝久、
中別府雄作、笹栗俊之］、日本癌学会第 73 回学術総会、横浜［9月25日〜27日］
14. 2014年9月17日、DNA酸化損傷修復欠損 マウスの継代実験で捉えられた遺伝現象、作
見邦彦, 大野みずき, 福村龍太郎, 権藤洋一, 岩﨑裕貴, 池村淑道, 續輝久, 中別府雄作、
日本遺伝学会第86回大会、長浜市 ［9月 17〜19日］
15. 2014年9月17日、Mutyh欠損マウスにお ける酸化ストレス誘発発がんおよび突然変 異の解析、鷹野典子, 大野みずき, 中別府雄 作, 中津可道, 續輝久、日本遺伝学会第86 回大会、長浜市 ［9月17〜19日］
Ｇ．知的所有権の取得状況 特になし
