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Title
骨芽細胞において通常時と炎症時とでは活性型ビタミン
Ｄによる細胞内シグナルは変化する : Chronic
bradykinin treatment alters vitamin D-induced
calcium current modulation in pre-osteoblasts
Author(s)
内田, 悠志
Journal
歯科学報, 113(2): 141-144
URL
http://hdl.handle.net/10130/3057
Right
はじめに
ブラジキニンは慢性関節リウマチ，歯周炎，歯髄
炎などの慢性炎症によって生じる骨の吸収に関与し
ている炎症メディエーターのひとつで，主に発痛物
質として知られている
１−３）。
活性型ビタミンＤ
４）は骨芽細胞において，Ⅰ型コ
ラーゲン
５，６），オステオカルシン
７，８），オステオポン
チン
９，１０）などの骨基質の形成に重要な働きをする。
さらに活性型ビタミンＤはカルシウムイオンの恒常
性にも関与し，様々なカルシウムシグナルを用いて
細胞機能を調節することが知られている。
古典的には活性型ビタミンＤは，核内のビタミン
Ｄ受容体と結合し，遺伝子を介したタンパク質合
成を行うとされてきた。このタンパク質合成には
genomic 作用により数日間を要するはずである。し
かしながら近年，活性型ビタミンＤが骨芽細胞にお
いて数分オーダーの急速な応答を発現することが報
告され，膜にその受容体があることが明らかになっ
ている
１１−１５）。
電位依存型カルシウムチャネルは，細胞内カルシ
ウムイオンの濃度およびカルシウムシグナルを調節
する膜タンパク質である
１６）。さらに電位依存型カル
シウムチャネルは，細胞内カルシウムイオン濃度だ
けではなく，細胞の興奮性，細胞の生存，細胞の分
化・増 殖
１７），酵 素 活 性 の 調 節
１８），遺 伝 子 発 現 の 調
節
１９）などをも司ることが知られている。しかしなが
ら活性型ビタミンＤの電位依存型カルシウムチャネ
ルに対する働きの詳細は明らかになってはいない。
本研究では，骨芽細胞において活性型ビタミンＤ
受容体が電位依存型カルシウムチャネルを調節する
かどう か，お よ び そ の 細 胞 内 セ カ ン ド メ ッ セ ン
ジャーを調べることとした。
さらに臨床的な観点から，骨の炎症時の細胞内セ
カンドメッセンジャーおよびイオンチャネルが，通
常時と比較した際に，効果の変化が生じるかどうか
についても検討した。
研究方法
１．細胞培養
培養骨芽細胞である MC3T3-E1 を培養液
α-MEM
を使用し，３７℃，二酸化炭素５％の環境下にて培養
した。培養液は２∼３日おきに交換した。細胞は直
径３５mm の培養用ディッシュ上に敷き詰めた状態ま
解説（学位論文 解説）
骨芽細胞において通常時と炎症時とでは
活性型ビタミンＤによる細胞内シグナルは変化する
Chronic bradykinin treatment alters vitamin D-induced calcium current
modulation in pre-osteoblasts
内田 悠志
東京歯科大学口腔健康臨床科学講座歯科矯正学分野 助教 略歴 ２００４年明海大学歯学部卒業，２０１０年東京歯科大学大学院歯学研究科（歯科 矯正学専攻）修了（博士（歯学）），２０１１年より現職。研究テーマ：細胞内シグナル 解析Yushi Uchida
キーワード：骨芽細胞，ビタミンＤ，電位依存型カルシウムチャネル，MAPK，ブラジキニン長期投与
Key words：Pre-osteoblasts, 1
α,25-Dihydroxyvitamin D3, L-type Ca
2+channel, MAPK, Chronic
bradykinin treatment
（２０１２年１１月７日受付，２０１２年１１月１９日受理，歯科学報
１１３：１４１−１４４，２０１３．）
１４１
で培養し，実験の際には EDTA という薬剤を用い
ディッシュから剥がし集めた後，再度ディッシュ上
に細胞同士が離れて実験しやすい距離になるように
撒き直した。
２．使用薬剤
今回使用した薬剤は，細胞に与える刺激薬として
活性型ビタミンＤを使用した。また慢性炎症状態を
再現するためにブラジキニンを使用した。そして細
胞内のシグナル伝達を担っている酵素を調べるため
に，その酵素の阻害薬を用いることで特定すること
にした。阻害薬はアデニル酸シクラーゼ阻害薬であ
る SQ22536，ホスホリパーゼ阻害薬である U-73122，
MAPK 阻 害 薬 で あ る PD98,059，グ ア ニ ル 酸 シ ク
ラーゼ阻害薬である GC，ホスホリパーゼ A2 阻害
薬である quinacrine をそれぞれ使用した。
３．実験方法
実験にはパッチクランプ法を適用した
２０）。パッチ
クランプ法とは先端が微細なガラス電極を細胞に差
し込み，細胞膜上に存在する電位依存型イオンチャ
ネルの変化を記録する方法である。
今回の実験におけるパッチクランプ法は，電位固
定法を適用した。細胞内電位を−４０mV に保持し，
−１０mV への脱分極刺激を与えることにより，カル
シウムイオン電流を計測した。また，電流−電圧関
係を調べるために，細胞内電位を−４０mV に保持
し，＋１０mV ずつのステップ電圧刺激を加えていく
ことにより，電流−電圧を記録した。
結 果
活性型ビタミンＤは培養骨芽細胞においてカルシ
ウムイオン電流を７３．
３±４９．
４％促進させた（図１）。
アデニル酸シクラーゼ阻害薬である SQ22536 を
前投与した細胞では，この促進作用が９．
６±３．
２％ま
で減少し，有意な変化を認めた。その他の阻害薬を
細胞に前投与した場合では有意な変化は認められな
かった。
また炎症状態を再現すべく培養骨芽細胞にブラジ
キニンの長期投与を行ない，同様の実験を行なっ
た。
ブラジキニン長期投与（７日間）をした細胞では，
活性型ビタミンＤはカルシウムイオン電流が生理的
状 態 下 と は 反 対 に，４８．
０±１０．
９％減 少 さ せ た（図
２）。この細胞にアデニル酸シクラーゼ阻害薬である
SQ22536 を前投与した時の作用は４．
７±８．
４％促進
と，有意な変化が認められた（図３）。
さらに慢性炎症を再現した培養骨芽細胞にMAPK
阻害薬である PD98,059 を前投与した細胞では，炎
症時に認められるはずの減少が発現せず，逆に６６．
７
±３３．
５％促進作用へと転換した。
まとめ
今回の研究では培養骨芽細胞における活性型ビタ
ミンＤの効果を調べた。
結果として通常時では活性型ビタミンＤを骨芽細
胞に投与した際，アデニル酸シクラーゼ阻害薬を前
投与した場合には，その他阻害薬を前投与した場合
図１ 活性型ビタミンＤの投与によりカルシウムイオン電 流の増加を認めた。 図２ 活性型ビタミンＤの投与によりカルシウムイオン電 流の減少を認めた。 内田：通常時と炎症時とでは VD の細胞内シグナルは変化する １４２ ― ２６ ―と比べ，有意に変化が認められた。
これによって通常時，活性型ビタミンＤが細胞膜
上に存在するビタミンＤ受容体と結合すると，その
刺激はアデニル酸シクラーゼを介して電位依存型カ
ルシウムチャネルに作用し，カルシウムイオン電流
を促進させることが分かった。
また炎症時ではアデニル酸シクラーゼ阻害薬を前
投与した場合以外にも，MAPK 阻害薬を前投与し
た場合において，その他阻害薬を前投与した場合と
比べ，有意に変化が認められた。
これによって炎症時，活性型ビタミンＤが電位依
存型カルシウムチャネルに作用するアデニル酸シク
ラーゼを介した経路に対してブラジキニン受容体が
MAPK を介してその経路に作用し，カルシウムイ
オン電流を減少させることが分かった（図４）。
この MAPK は外界からの刺激を伝達する酵素の
一つで，細胞の分化，増殖，癌化，遺伝子発現，ア
ポトーシスなど様々な機能発現に関与している酵素
であり，近年では抗癌剤の新しい標的としても注目
されている。
今回の実験結果で得られた通常時，炎症時でカル
シウムイオン電流が変化する結果は，同様の応答が
海馬ニューロンにおける加齢変化の実験で報告され
ている。その実験では若いラットにおいて活性型ビ
タミンＤはカルシウムイオン電流を増加させ，老齢
のラットでは逆に減少を示すことが報告されてい
る
２１）。これは加齢変化と炎症との関連性を示唆して
いると思われる。
今回の実験結果により，骨芽細胞における細胞内
シグナルの詳細が分かった。また通常時，炎症時で
細胞内シグナルに変化が生じることも分かった。こ
れらの結果は慢性関節リウマチ，歯周炎，歯髄炎な
どの骨疾患の治療に際し，薬理学的な価値があると
思われる。また新たに炎症と加齢変化の関連性につ
いても検討していきたいと思う。
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本論文は，下記学位論文の内容を解説した。
Chronic bradykinin treatment alters 1α,25-dihydroxyvita-min D3-induced calcium current modulation in pre-osteo-blasts, Uchida Y, Endoh T, Tazaki M, Sueishi K., Cell Calcium, ５１；３８３−３９２：２０１２． 別刷請求先：〒１０１‐００６１ 東京都千代田区三崎町２−９−１８ 東京歯科大学口腔健康臨床科学講座 歯科矯正学分野 内田悠志 内田：通常時と炎症時とでは VD の細胞内シグナルは変化する １４４ ― ２８ ―
