4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 ].5
[C.‑) A 100 1000
qANDARD CURVE
図3 我々のシステム(図 2)によるスタン夕、ードカー
ヴ
生理的カルシウムイオン濃度範囲とおもわれる50‑1000 nMの範囲でカーブが急峻で、あり，本システムが細胞内
カルシウムイオン濃度測定に適してしる。
1
11.研究成果
血管平滑筋細胞内カルシウムイオンと高血圧 従来より高血圧と [Ca++Jiの聞の関係が論じられて研 究されてきた。高血圧は多くの原因が複雑に関係する多 因子的な病態であるが，血管の緊張，収縮性もその原因 のーっと考えられている。一般に王子j骨筋細胞においては，
[Ca++Jiが高まると，細胞の収縮緊張度も高まると考え られており，多くの研究者が [Ca++Jiと高血圧の関係を 検討してきた。しかしながら， [Ca++Jiを測定する試料と しては，血管平滑筋を対象にせず，血小板細胞を用いて 検討しているのがほとんどであった。これは，平滑筋内 の [Ca++] iを，細胞を障害しない条件下で測定する方法 がこれまでなかったために，筋細胞類似の収縮タンパク を有し生体内で浮遊状態で存在する血小板を.平滑筋の モデルとして代用したものである。これらの研究により，
ヒトの本態性高血圧患者や，その動物モデルである SHR
レーザー顕微境とコントロール部 コービューター ( 東 大 杉 山 ， 矢 崎 )
nM
金属ワクの中にレーザーがある
上の機器はレーザーコントローノレ部分とX‑ystage コ ン ト ロ ー ル 部 分 ( 東 大 杉 山 )
図4 今凶我々が開発したレーザー蛍光顕微鏡 分光測定装置
(自然発症高血圧ラット)においては，正常血圧コント ロールに比べて血小板内 [Ca+
つ
iが高値であることが示された。しかし，血小板のデータがそのまま血管平滑筋 細胞に適用きれるかについては，議論の多かった点であ
った。
77
我々は今回新たに開発したレーザー蛍光顕微鏡分光iHIJ 定法ではじめて生理的条件で，血管平滑筋内[Ca++Jiを 測定し次のような結果を得た。
SHRにおいて生後4週令ではその血圧は正常血圧コン トロールである WKY(WistarKyoto Rats)と同じレベ ルで、あるが， 8週令以降はWKYに比べて有意に高値を 示す。 SHR及ぴWKYの大動脈中膜由来の初代培養平 滑筋内の [Ca++] iを比較すると， WKYでは4，8， 12 週令でそれぞれ144:t8， 135:t 8， 146:t 7 nMと一定で あったが， SHRおいては， 8， 12週令でのみWKYに比 べ有意に高値であった。このことは4週 令 に お い て は SHRでもWEYと血圧に差がなし 8， 12週令でSHR が高血圧を発症したことと合わせると興味深いことであ る。
SHRにおける血管平滑筋内 [Ca++Jiの高値が高血圧の 影響をうけた二次的な変化によるものか明らかにする目 的で，生後4週令のWKYのー側腎を摘除し他側腎動脈 に狭窄をつくり 1腎lクリップのGoldblatt型高血圧 ラットを作成 8週令まで飼育し同様に血管平滑筋内 [Ca++Jiを測定した。ところがSHRと異なり血圧は十 分に上昇しているのにもかかわらず， [Ca++Jiは132:t3 nMであり，同週令のWKYと有意差はなかった。この こ と に よ り 我 々 はSHRに お け る 血 管 平 滑 筋 細 胞 の [Ca++Jiの上昇は，高血圧による二次性のものではな し遺伝的に規定きれた病態であることを示した。
78
IV. まとめ
以上[Ca++Ji測定法を概説し，我々の開発したレーザ ー顕微蛍光分光法の特徴と利点，およびその成果の一部 を紹介した。冒頭で述べたように，細胞内カルシウムイ オンはセカンドメッセンジャーとして注目され，研究の 進歩は著しいものがある。今後は[Ca++Jiと他の細胞活 動の指標を同時に測定することが細胞内でのCa++の役 割を解明する上で重要であると考えられる。細胞活動の 指標としては細胞内pH，膜電位，細胞の働色分泌顕粒 のような細胞内小器官の働きなどが考えられる。これら の指標と [Ca++Jiの同時測定は今後の大きな課題である が，我々の開発した装置をベースにすればその実現性は 高いものと思われる。なお本研究の一部は中谷電子計調)1
技術振興財団の研究助成を得て行った ご援助に対し厚
〈お十しをftJし上げたい、
V .
参考文献1. Sugiyama， T.， Yazaki， Y. et. al. (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 14 ，1 340~345
2. Sugiyama， T.，Yazaki， Y. et. al. (1987) J. Mo. lCell. Cardiol. 19(5uppl 1)， S18
3. Tsien， R. Y. (1980)Biochemistry 19， 2396~2404
4. Grynkiewicz， G.，Poenie， M.，and Tsien， R. Y. (1985) J. Bio. lChem. 260. 2440~3450
超高感度カメラと画像処理技術を用いた細胞内 Ca イオンの動態解析システムの開発
研究責任者東京医科歯科大学難治疾患研究所自律生理学部門教授 片 共同責任者東京医科歯科大学難治疾患研究所自律生理学部門助手 平 東京医科歯科大学難治疾患研究所自律生理学部門助手 辰
丈 史 芳 恵 仁 山 井 巳
1 • まえカずき
神経機能の発現にカルシウム (Ca)が重要な役割を果 たすことが知られているが，このときのCaの作用機楠 についての詳細は解明されていない。十!神士活動に伴う細 胞内のじa イオンの動態に関しでも未だにつi~Llfl な点が多 し 細 胞 内Caの濃度を谷弘かっ迅速に測定することが 不可欠でありJIつ久しく望まれてきた九
近 年 開 発 さ れ たCaイオン蛍光指示薬であるfura‑
21)を用いる Caイオン濃度の光学的測定法は従来の測定 法に比べて多くの利点を持ち，既に，培養した神経細胞 の細胞内Caイオン濃度の測定に適用されるようになっ た日)。本研究では，体内での神経回路構成を保持した状 態の晴乳動物の神経組織において， fura‑2を用いて神 経活動に伴う細胞内Caイオンの動態を解析できるシス テムの開発を行った。従って，本研究で特に留意すべき ことは.培養なとの非生理的処置を砲さない状態にある 哨乳動物の成熟神経組織が標本として可能なこと，及び 電気生理学的解析を同時に実施できることである。
2 .研究内容
1 ) 顕微測光システム
神経細胞にfura‑2を負荷して，紫外光を照射すると，
fura‑2が励起きれ微弱な蛍光を発し，この時の励起ス ベ ク ト ル はCaイ オ ン 濃 度 に 応 じ て 変 化 す る 。 こ の fura‑2の光学的特性を利用してCaイオン濃度を知る ことができる1)c波長340nmの励起光で励起した時の蛍 光 強 度 (F340)と，波長360nm(又は380nm)の励起光 で の 蛍 光 強 度 (F360又はF380)の比を計算することに よってCaイオンの濃度を求める方法が一般に用いられ ている日ぺ本研究ではこの方法を採用して細胞内Caイ オン濃度を測定するために，図1に示す顕微測光システ ムを製作した。
紫外光対応に改造し，光源をキセノンランプに変えた 倒 立 型 落 射 蛍 光 顕 微 鏡 を 用 い た 。 波 長340，360及 ぴ 380nmの励起光を得るために，励起フィルタとして3種
の干渉フィルタ(340，360及び380nm透過)を光源と顕微 鏡の聞に置いてノりレスモータによって随時変換できるよ うにした。倒立型落射蛍光顕微鏡の架台上にfura‑2を 負荷した標本を置いて，紫外光照射しこの時発生した 蛍光を発光側フィルタ (502nm透過の干渉フィルタ)を 通して，二つの方法によって観測した。一つは超高感度 テレビカメラ (SrTカメラ)を，他は光電子増倍管を用 いるものである。前者では，励起ワイルタを変換しなが らF340蛍光像と F380(或はF360) 蛍光像を撮影し，
テレビモニタで観察し，ビデオテープに収録した。後で
Fluorescence image
TV rnonl. tor
Calciwn distribution
図1 細胞内Caイオン濃度を測定するシステムの
概要 79
を求めることができるヘ今回製作した測光システムの較 正曲線の例を同2に示す。しかしこの較正曲線を決定す
ることに関しては種々の問題点、が指摘されている日、
3 .成果
本研究で試作したシステムを用いて，モルモットの腸 管壁内在神経で得られた成果について述べる。
図3は， fura‑2を注入した単一神経細胞から得たも ので， SITカメラを用いて撮影したfura‑2蛍光像を画 像処理し，その結果を疑似カラー表示したものである。
上段，左図はコントロール条件(正常クレブス液で潅流) での細胞内Caイオン濃度を示し，右図は潅流液を無Ca /高濃度 (6mM)マグネシウム (Mg)の試験液に変換
した後の，同一細胞内のCaイオン濃度を示ヤ。上段左右 の差，即ちコントロールと試験液での細胞内Caイオン 濃度の差をとって，下段左に試験液で濃度が低下した部 分，右に上昇した部分について，それぞれ変化分を疑似 カラーで表示した。この図から，神経細胞を無Ca/高濃 度Mgの環境に置くと細胞内Caは 減 少 し 特 に 細 胞 の 周辺部て1成少が顕著であることが分かる~燃本におけ るある種の神絞細胞では静11:時にも Caが細胞外から流 人しており無Ca条件一卜ではCaの流入が減少し細胞内 Caイオン濃度が低iごすると示唆されてきたc今回得られ たテ タはこのことを
H
寺するものと思われるヘ他にも幾つかの坑象にCaイオンが関与することが電 気生理学的に示唆きれているし例えば司活動電
¥ i
i:i走過分 憎むまCa依存性のカリウム(K)千ャンネ/しの活性化によ ると考えられているJ 今￨口]，活動電位と後過分極の予告生 にfî'.コて細胞内の Ca イオン濃度が増大することを ~lERJJ した、{主流液のKイオン濃度を上げると膜を脱分隠させ Caイオンの細胞内流入を起こすと考えられている。本実 験で，高濃度Kイオンによって玄起きれる脱分悔は細胞 内Caイオシの増加をn
うことが確認されたが，この11，) 1吋向電流を与えて脱分慨を相殺すると Caイオンは殆と 増加しなかったο このように細胞内Caイオン濃度が膜 電併に依存して変化することを明らかにした 更に.細 胞内Caイオンの濃度の変化に1
下って起こる現象に関す る解析を進めているご本研究で用いている腸管壁内在神経には p物質やエ ンケファリンなど脳と共通の数多くの神経ペプチドが存 夜
L
，これらは「脳ー腸ペプチド」の名でよは、れ，神経 伝達物質或は神経修飾物質として機能していると考えら れてきた。これらのペプチドの作用にCaが関与すると 示唆されており，ペプチドの作用に伴う細胞内Caイオ ン濃度の変化を本システムで解析した。P物質(1μM)をガラス管に詰めて記録している細胞 の近傍に置いて空気圧で正出すると，図 4J二段 (Vm)に 示すような約15mVの脱分極を発生する。下段にはこの 再生しながら順次画像入力装置に取り込み，画像各点に
おけるF340とF380(又はF360)の比の計算の他，必要 な画像処理を適宜施しその解析結果を疑似カラーで表示 した。後者では，励起光照射領域を大体単一のニューロ ン の 細 胞 体 に 相 当 す る 範 囲 に 絞 り ， そ の 部 分 全 域 の fura ‑2蛍 光 の 強 度 (F340とF380又はF360)を 測 光 し，その出力をI.Vコンパータを介してベンレコーダで 表記した。
神経細胞の電気的活動を細胞内記録するために，細胞 内微小電極を操作するマニフ。レータを顕微鏡に付加設置 した。電気生理学的実験には通常の市販のブリアンプ，
オシロスコープ，刺激装置，ぺンレコーダなどを用いた。
2 ) 細胞内Caイオン濃度の測定
まえがきで述べたように，本研究の目的は成熟神経組 織の神経活動に伴う細胞内Caイオンの動態を解析でき
るシステムを作ることにある。従って，最適の標本を選 択することが重要である。我々がこれまで，用いてきた モルモソトの腸管壁内在神経系は生体内での神経団路を 保持したままで非常に薄い標本(厚き 100μm以下)とす ることができ，伺j立型顕微鏡を用いた電気生理学的実験 も可能で、あるので，本研究に適していると思われる。
腸管壁内在神経の標本をfura‑2/AM(20μM)を含ん だクレブス液 (37'C)で約30分間インキユベー卜した。
この方法は広く用いられているが，多数の神経細胞を染 めてしまうため，細胞が重層すると信号の
S/N
が低下す る可能性が考えられる。そこで，単一細胞を染めるため に， 300μMのfura‑2と1 MのKCIを封入したカ、、ラス 微小電極を細胞に刺入して，内向電流を通電してfura‑2を細胞内に注入した。
蛍光測光て、、得られたF340とF380(或はF3601の比 と，事前に作成した較」ト;曲線を用いて， Caイオンの濃度
2
。 。
1
O∞
の比
¥ 寸め比O