分野主任 教授 中辻 憲夫
【研 究 概 要】
個体を構成する細胞系譜は全て一つの受精卵から多能性幹細胞、組織幹細胞等を経て成熟分化を行う。各種の体 細胞はそれぞれ特異的な機能発現を行い生体の恒常性を維持する一方、生殖細胞は発生初期に多能性幹細胞から体 細胞とは系譜が分かれ、配偶子形成プロセスを通じてゲノム情報の維持と再編、エピゲノム修飾の再構成等を行い、
次の個体発生の為の遺伝プログラムを継承する。これら幹細胞 - 生殖細胞サイクルにおけるゲノム、エピゲノムプ ログラムは個体及び種が成立する根幹として厳密に制御される一方、その破綻は広範な疾患、例えば発生異常、遺 伝病、癌、不妊等の病態の起因となる。当研究グループは幹細胞 - 生殖細胞の発生分化とゲノム - エピゲノム制御 機構の特性解明、またその理解に基づく細胞 - ゲノムの人為操作の技術基盤の創出を目指し、分子生物学、生化学、
遺伝学、オミクス解析、また新たな実験系の開発を併せて研究を進めている。
（1）生殖顆粒構成分子によるレトロトランスポゾン抑制とゲノム保護：生殖細胞に顕著に観察される構造的特徴 に生殖顆粒 RNP 構造が挙げられる。我々はマウス生殖顆粒の特異的な構成分子をコードする tudor 関連 Tdrd 遺伝 子群の機能解析を進めている。Tdrd1、6、 7、 9 ノックアウトマウスを作製した所、これら遺伝子のホモ欠損個体は いずれも雄生殖細胞の分化に異常を示す事が明らかとなった。このうち TDRD1、9 はマウス piwi ファミリー MILI、
MIWI2 と相互作用し、雄生殖幹細胞において piRNA 経路を介してレトロトランスポゾン LINE-1 の RNA、エピゲ ノムレベルでの抑制に機能する。生殖幹細胞の LINE-1 制御の破綻は減数分裂期で同レトロトランスポゾンの過剰 発現を招き、ゲノム DNA 障害による広範な細胞死を誘起する。一方、TDRD6、7 は精子細胞の半数体成熟に働く。
Tdrd6、7 ノックアウトマウスでは精子細胞に特徴的な生殖顆粒である chromatoid body の形成不全が観察される が、Tdrd1、9 とは異なりレトロトランスポゾンのエピゲノム制御の破綻は検出されない。Chromatoid body は体細 胞の processing body、stress granule と分子構成が類似しており、現在 TDRD6, 7 と生殖細胞の RNA 制御、スト レス反応等について解析を進めている。（2）減数分裂を制御する開始シグナルとクロマチン動態：幹細胞 - 生殖細 胞サイクルにおいてゲノム情報の安定な継承は個体、種の成立に重要である一方、配偶子形成過程では減数分裂に よる 1 倍体化と相同遺伝子組換えによって遺伝情報の多様性が生まれる。減数分裂の制御機構の研究は主に酵母等 の単細胞生物を用いて行われており、多細胞生物において詳細な分子基盤の解明は進んでいない。我々は精原幹細 胞由来の樹立細胞株を用いて体細胞型増殖から第 1 減数分裂前期を誘導する実験条件を作出した。この培養実験系 を用いて減数分裂を促進および抑制するシグナル経路を同定したので、分子から個体レベルでの詳細な研究を進め ている。一方、クロマチン動態との関与が推測される遺伝子群を蛋白質ドメイン構造、発現パターン、進化的保存 等によりゲノムデータベースからスクリーニングし、遺伝学的、生化学的解析を進めている。これらの研究により 哺乳類の相同遺伝子組換えや半数体化を制御する分子基盤を明らかにし新たなゲノム操作技術への応用を目指す。
（3）幹細胞ゲノム恒常性の分子ネットワーク：ES 細胞のゲノム恒常性には幾つかの特徴的な性質が有る。ES 細胞
は明確な分裂寿命が認められずゲノム損傷による G1 チェックポイントが観察されない。ES 細胞の DNA 変異率は 10e-6 程度と見積もられており、他の体細胞の約 10e-4 と比べて約 2 桁程度低い。また ES 細胞の DSB 修復は他の 分化細胞と比べて HR 経路が NHEJ 経路よりも優位に利用される。更に ES 細胞の染色体不安定性のスペクトルは 分化体細胞とは異なる。これらの ES 細胞と分化体細胞の相違はゲノム損傷応答の違いと考えられるがその分子機 序は殆ど明らかになっていない。我々はゲノムワイドなマルチオミクス解析を徹底して行う事で ES 細胞のゲノム 損傷に対する修復ダイナミクス、例えば損傷認識、クロマチン動態、シグナル伝達クロストーク等、の分子ネット ワークの全体像を得る事を目指して研究を進めている。
The germline is the cell lineage that gives rise to full ontogenesis of individuals and transmits genetic information to next generations. During the differentiation of germ cells, important biological processes take place, such as epigenetic reprogramming, establishment of pluripotency and genetic DNA recombination. Our current research focuses on the molecular characterization of germinal granules/nuage, germline-specific ribonucleoprotein（RNP）assemblies in the cytoplasm, and the regulation of meiotic entry and chromatin dynamics.
One structural characteristic observed in the germline is a cytoplasmic RNP domain called germinal granules or nuage. The germinal granule/nuage is evolutionarily conserved in divergent animals, suggesting its essential and common role in the germline, but the precise molecular and physiological function（s）remains unclear.
We are working on tudor-domain containing（Tdrd）genes, mainly Tdrd1, 6, 7 and 9, which encode for specific components of mammalian germinal granules/nuage. Gene-targeted disruption of Tdrd1, 6, 7 and 9 all led to male-specific sterility due to postnatal defects in spermatogenesis. Among these, TDRD1 and TDRD9 cooperate with piwi proteins, MILI and MIWI2, respectively, and function non-redundantly in retrotransposon silencing at RNA and epigenetic levels in spermatogonial stem cells and subsequent spermatogenesis. In contrast, Tdrd6 and 7 function in haploid spermiogenesis. Tdrd6 and 7 mutants show abnormal spermatid differentiation with aberrant chromatoid body architectures. Chromatoid bodies, a specialized form of germinal granules/nuage in spermatids, share some of their components with somatic processing bodies（p bodies）, a form of RNP implicated
マウス胚性幹（ES）細胞と生殖幹（GS）細胞のヒストン修飾の ChIP-seq 解析
ChIP-seq analysis of mouse embryonic stem（ES）cells and germline stem（GS）cells for histone H3 modifications
in degradation or translational control of mRNA. We are addressing the possible function of TDRD6 and 7 in the regulation/metabolism of RNA.
Molecular mechanisms controlling meiotic entry and chromatin dynamics are important research subjects in cell and developmental biology. We previously showed that primordial germ cells autonomously enter into meiosis when cultured in vitro and identified a factor that suppresses this meiotic transition from mitosis.
Recently, we established another in vitro culture system that induces meiosis initiation of an established germline stem cell line derived from spermatogonia. By using this culture system, we identified signaling molecules that promote or inhibit meiosis from mitotic spermatogonial stem cells. We are undertaking biochemical and genetic characterization of these signaling pathways in vitro and in vivo.
【業 績 目 録】
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誌上発表▣
（1）原著論文
Fujiwara, M., Yan, P., Otsuji, T. G., Narazaki, G., Uosaki, H., Fukushima, H., Kuwahara, K., Harada, M., Matsuda, H., Matsuoka, S., Okita, K., Takahashi, K., Nakagawa, M., Ikeda, T., Sakata, R., Mummery, C. L., Nakatsuji, N., Yamanaka, S., Nakao, K. and Yamashita, J. K. Induction and enhancement of cardiac cell differentiation from mouse and human induced pluripotent stem cells with cyclosporin-A. PLoS One 6, e16734（2011）
Sengoku, S., Sumikura, K., Oki, T. and Nakatsuji, N. Redefining the concept of standardization for pluripotent stem cells. Stem Cell Reviews and Reports 7, 221-226（2011）
Nagae, G., Isagawa, T., Shiraki, N., Fujita, T., Yamamoto, S., Tsutsumi, S., Nonaka, A., Yoshiba, .S, Matsusaka, K., Midorikawa, Y., Ishikawa, S., Soejima, H., Fukayama, M., Suemori, H., Nakatsuji, N., Kume, S. and Aburatani, H. Tissue-specific demethylation in CpG-poor promoters during cellular differentiation. Hum. Mol. Genet.
20, 2710-2721（2011）
Adachi, K., Suemori, H., Nakatsuji N. and Kawase, E. The role of SOX2 in maintaining pluripotency and differentiation of human embryonic stem cells. In “Stem Cells in Clinic and Research" pp. 169-184（Ed. Ali Gholamrezanezhad）（InTech）. ISBN: 978-953-307-797-0（2011）.
Sakurai, K., Shimoji, M., Aiba, K. and Nakatsuji, N. Efficient Integration of Transgenes and Their Reliable Expression in Human Embryonic Stem Cells. In “Embryonic Stem Cells: Basic Biology to Bioengineering”
pp. 105-122（Ed. Michael S. Kallos）（InTech）. ISBN: 978-953-307-278-4（2011）
Sasaki, N., Ishii, T., Kamimura , R., Kajiwara , M., Machimoto, T., Nakatsuji, N., Suemori, Ikai, I., Yasuchika, K. and Uemoto, S. Alpha-fetoprotein-producing pancreatic cancer cells possess cancer stem cell characteristics.
Cancer Letters 308, 152‒161（2011）
The International Stem Cell Initiative: Amps, K., Andrews, PW., Anyfantis, G., Armstrong, L., Avery, S., Baharvand, H., Baker, J., Baker, D ., Munoz, MB., Beil, S., Benvenisty, N., Ben-Yosef, D., Biancotti, JC., Bosman, A., Brena, RM., Brison, D., Caisander, G., Camarasa, MV., Chen, J., Chiao, E., Choi, YM., Choo, ABH., Collins, D., Colman, Al Crook, JM., Daley, GQ., Dalton, A., De Sousa, PA., Denning, C., Downie, J., Dvorak, P., Montgomery, KD., Feki, A., Ford, A., Fox, V., Fraga, AM., Frumkin, T., Ge, L., Gokhale,
PJ., Golan-Lev, T., Gourabi, H., Gropp, M., Lu G., Hampl, A., Harron, K., Healy, L., Herath, W., Holm, F., Hovatta, O., Hyllner, J., Inamdar, MS., Irwanto, AK., Ishii, T., Jaconi, M., Jin, Y., Kimber, S., Kiselev, S., Knowles, BB., Kopper, O., Kukharenko, V., Kuliev, A., Lagarkova, MA., Laird, PW., Lako, M., Laslett, AL., Lavon, N., Lee, DR., Lee, JE., Li, CL., Lim, LS., Ludwig, TE., Ma, Y., Maltby, E., Mateizel, I., Mayshar, Y., Mileikovsky, M., Minger, SL., Miyazaki, T., Moon, SY., Moore, H., Mummery, C., Nagy, A., Nakatsuji, N., Narwani, K., Oh, SKW., Oh, SK., Olson, C., Otonkoski, T., Pan, F., Park, IH., Pells, S., Pera, MF., Pereira, LV., Qi, O., Raj, GS., Reubinoff, B., Robins, A., Robson, P., Rossant, J., Salekdeh, GH., Schulz, TC., Sermon, K., Mohamed, JS., Shen, H., Sherrer, E., Sidhu, K., Sivarajah, S., Skottman, H., Spits, C., Stacey, GN., Strehl, R., Strelchenko, N., Suemori, H., Sun, BW., Suuronen, R., Takahashi, K., Tuuri, T., Venu, P., Verlinsky, Y., Ward-van Oostwaard, D., Weisenberger, DJ., Wu, Y., Yamanaka, S., Young, L. and Zhou, Q. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology 29, 1132‒1144（2011）
Uosaki, H., Fukushima, H., Takeuchi, A., Matsuoka, S., Nakatsuji, N., Yamanaka, S. and Yamashita, J. K. Efficient and scalable purification of cardiomyocytes from human embryonic and induced pluripotent stem cells by VCAM1 surface expression. PLoS One 6, e23657（2011）
Aizawa, E., Hirabayashi, Y., Iwanaga, Y., Suzuki, K., Sakurai, K., Shimoji, M., Aiba, K., Wada, T., Tooi, N., Kawase, E., Suemori, H., Nakatsuji, N. and Mitani, K. Efficient and accurate homologous recombination in hESCs and hiPSCs using helper-dependent adenoviral vectors. Molecular Therapy, In press （2011）
Pillai RS, Chuma S. piRNAs and their involvement in male germline development in mice. Dev Growth Differ. 2012 Jan 6（in press）.
Morozumi Y, Ino R, Takaku M, Hosokawa M, Chuma S, Kurumizaka H. Human PSF concentrates DNA and stimulates duplex capture in DMC1-mediated homologous pairing. Nucleic Acids Res. 2011 Dec 9.（in press）
Reuter M, Berninger P, Chuma S, Shah H, Hosokawa M, Funaya C, Antony C, Sachidanandam R, Pillai RS. Miwi catalysis is required for piRNA amplification-independent LINE1 transposon silencing. Nature. 2011 Nov 27;480（7376）:264-7.
Tanaka T, Hosokawa M, Vagin VV, Reuter M, Hayashi E, Mochizuki AL, Kitamura K, Yamanaka H, Kondoh G, Okawa K, Kuramochi-Miyagawa S, Nakano T, Sachidanandam R, Hannon GJ, Pillai RS, Nakatsuji N, Chuma S. Tudor domain containing 7（Tdrd7）is essential for dynamic ribonucleoprotein（RNP）remodeling of chromatoid bodies during spermatogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Jun 28;108（26）:10579-84.
Watanabe T, Chuma S, Yamamoto Y, Kuramochi-Miyagawa S, Totoki Y, Toyoda A, Hoki Y, Fujiyama A, Shibata T, Sado T, Noce T, Nakano T, Nakatsuji N, Lin H, Sasaki H. MITOPLD is a mitochondrial protein essential for nuage formation and piRNA biogenesis in the mouse germline. Dev Cell. 2011 Mar 15;20（3）:364-75.
Yabuta Y, Ohta H, Abe T, Kurimoto K, Chuma S, Saitou M. TDRD5 is required for retrotransposon silencing, chromatoid body assembly, and spermiogenesis in mice. J Cell Biol. 2011 Mar 7;192（5）:781-95.
（2）著書
（3）総説
門田真、饗庭一博、中辻憲夫：ES 細胞（胚性幹細胞）研究 日本臨牀 第 69 巻 第 12 号（平成 23 年 12 月号）別刷 特集：幹細胞治療
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学会等の発表▣
（1）学会・研究会発表
中馬新一郎 . 哺乳類生殖幹細胞株の減数分裂誘導とクロマチン動態の制御 . 特定領域遺伝情報場第 4 回領域会議
（6.12-14, 2011, 北海道）
Shinichiro Chuma. Mammalian tudor related genes in the male germline. 44th Meeting of SSR（7.31-8.4, 2011, Portland）
中馬新一郎 . 生殖幹細胞の増殖から減数分裂移行を制御するシグナル伝達クロストーク . 特定領域細胞増殖制御第 5 回領域会議（9.7-9, 2011, 米子）
Shinichiro Chuma. Germline tudor genes, germinal granules and spermatogenesis in mice. CSHA conference
（10.11-15, 2011, Suzhou, China）
中馬 新一郎 . The germline stem cell cycle in mammalian developmen. 特定領域遺伝情報場第 2 回異分野融合 workshop（11.29, 2011, 大阪）
Shinichiro Chuma. Germline tudor family genes, retrotransposon silencing and spermatogenesis in mice. 日本分子 生物学会第 34 回年会（12.16, 2011, 横浜）
両角 佑一、伊能 諒平、高久 誉大、中馬 新一郎、胡桃坂 仁志 . PSF stimulates the recombination reactions mediated by DMC1 in vitro. 日本分子生物学会第 34 回年会（12.15, 2011, 横浜）
中馬新一郎 . Mammalian tudor family genes in the male germline. 理研 BRC（12.19, 2011, 筑波）
細川美穂子、田中敬、林瑛理、篠原美都、篠原隆司、中辻憲夫、中馬新一郎 . マウス生殖幹細胞株の体細胞型増殖 から第一減数分裂前期への移行 . 特定領域生殖サイクル若手勉強会 2011（7.13-15, 2011, 大阪）
細川美穂子、田中敬、林瑛理、篠原美都、篠原隆司、中辻憲夫、中馬新一郎 . マウス生殖幹細胞の体細胞型増殖か ら第一減数分裂前期への移行 . 特定領域研究生殖サイクル第 4 回公開シンポジウム（11.17-18, 2011, 大阪）
細川美穂子、刀谷在美、田中敬、林瑛理、篠原美都、篠原隆司、中辻憲夫、中馬新一郎 . マウス生殖幹細胞株の体 細胞型増殖から第一減数分裂前期への移行 . 再生研若手発表会（12.26, 2011, 京都）
（2）講演・シンポジウム
中辻憲夫：世界で始まった ES/iPS 細胞の実用化〜細胞治療と新薬スクリーニング〜．第 10 回国際バイオ EXPO．
特別講演 （2011.7.1. 東京）
Nakatsuji, N.: Chemical biology and model cell production using pluripotent stem cells. Heidelberg‒Kyoto Joint Symposium “Crossing Boundaries: Stem Cells, Materials, and Mesoscopic Sciences”（2011.7.23. Heidelberg）
Nakatsuji, N.: Multi-disciplinary research and application of pluripotent stem cells for disease mechanism research and drug discovery. iCeMS and MRC-CRM Joint Symposium “Next Generation Stem Cells: Tools and Technologies”（2011.7.25. Edinburgh）
中辻憲夫： ES 細胞と iPS 細胞の現在と未来：物質科学 - 細胞科学の融合と医学創薬への応用．第 63 回コロイドお