分野主任 教授 瀬原（藤沢）淳子
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【研 究 概 要】
はじめに
発生過程では固有の形や大きさを持った臓器が生ずる。骨格筋など特定の臓器では、それが傷害を受けると再生 するが、筋再生においては、筋衛星細胞と呼ばれる幹細胞が活性化され、それが発生過程と類似した細胞分化と形 態形成のプロセスによって骨格筋を作り直すことが知られる。
我々の研究室は、主に発生生物学・細胞生物学の立場から、（1）筋分化・筋形成機構、筋再生機構、（2）形態形 成における細胞間シグナリング・接着の制御機構としてのプロテアーゼ制御、の研究を行っている。主にマウスを 用いた分子遺伝学的手法や培養系による研究とともに、近年はゼブラフィッシュを用いて、生きた個体でのバイオ イメージングによって形態形成過程を蛍光蛋白質により可視化し、発生や再生の新しい仕組みを明らかにしつつあ る。
（1）筋分化と筋形成・再生機構：筋形成は、中胚葉由来の多能性細胞から筋芽細胞が生じ，それが互いに融合し て筋管を形成し、さらに神経支配を受け筋収縮を繰り返す中で成熟して機能的な筋肉となっていく。転写因子 Pax3/
Pax7 を発現する筋前駆細胞から、Myf5/MyoD を発現する筋芽細胞が生まれる仕組み、筋芽細胞が互いに融合して 細長い筋管を形成する仕組み、筋成熟の仕組み、などの未知な問題に取り組んでいる。一方、筋再生は、骨格筋が 壊されたときに幹細胞である筋衛星細胞が活性化され、それを修復する機構である。筋衛星細胞の、自己複製と分 化（筋芽細胞の産生）という幹細胞としての特質の獲得機構、そしてその幹細胞の産生と活性化の機構の問題に取 り組んでいる。
（2）形態形成における細胞間シグナリング・接着のプロテアーゼ制御：これは膜型シグナル分子や接着因子の脂 質二重層近傍における切断（ectodomain shedding）を介して、細胞間シグナリングの制御や接着制御に関与する、
ADAM と呼ばれる膜型プロテアーゼファミリーに着目した研究である。テーマ（1）の中から発展させてきた研究 であり、筋形成にとどまらず、発生の時間的空間的制御、不可逆的な制御としてきわめて大切な制御であることを 明らかにしてきた。 メルトリンα（ADAM12）、β（ADAM19）、ADAM8、ADAM10 などについて、いくつかの 形態形成に焦点を当てた研究を行っている。
紙面の関係上そのすべてをここで紹介するのは難しいため、年報ではひとつのテーマに関してやや詳しく紹介す ることにしている。今年は、培養細胞を用いた筋形成機構解明の試みについて、助教の栗崎知浩が中心となってお こなった研究を紹介する。
筋形成機構の研究
骨格筋は、運動器官であると同時に基礎代謝を担う発熱器官でもあり、アミノ酸やグリコーゲンの貯蔵庫でもあ り、全身に広がる重要な組織である。ヒトではこの骨格筋は数十から数百個もの筋細胞同士が細胞膜融合を起こす ことにより形成されるが、その分子機構はよくわかっていない。我々は、この筋細胞融合を制御している分子機構 の解明を目指している。
これまでにウイルス感染における Fusion peptide、受精における Izumo、破骨細胞形成における DC-STAMP と いった細胞融合に必要十分な膜分子が同定されてきているが、筋細胞融合に関してはそのような分子は見つかって いなかった。筋芽細胞は数日という比較的長い時間をかけて非同調的に一部の細胞だけが融合能を獲得し細胞融合 を起こす。我々は、筋融合の分子機構が明らかになっていない理由の一つが、この非同調性であると考え、また融 合能を獲得した筋細胞だけを取得する方法がないことに着目し、この問題を解決する為に融合能をもつ筋細胞を特 異的に認識する抗体の取得を目指した（図 1）。
最初に我々は、筋形成が MyoD ファミリーに属する転写因子 myogenin に依存することに着目し、 myogenin 遺 伝子の上流領域に GFP をつないだコンストラクトをマウス筋芽細胞株 C2 に導入し、分化状態を GFP で可視化で きる筋芽細胞株 mgd4EGFP-C2 を作製した。この細胞は、細胞分化を誘導すると筋融合がスタートする前にまず 単
図 3 Yaksa 抗体は融合部位を可視化できる 細胞質を GFP（緑）、核を Hoechs（青）で可視化した分化筋 細胞の融合過程。△筋細胞と多核筋管の接着部位が Yaksa 抗 体（赤）で可視化される。
図 2 Yaksa 抗体は融合活性を有する細胞と特異的に反応する Yaksa 抗体結合細胞は 8 時間以内に融合するが、非結合細胞は 融合しない。
図 1 筋分化細胞集団は均一ではない
増殖中の未分化筋芽細胞は誘導により、一部の細胞だけが筋細 胞へ分化し、更にその中の一部の細胞が Prefusion myoblast と なり融合する。これまで Prefusion myoblast の分子マーカーは 報告されていなかった。mg-: 未分化筋芽細胞、mg+: 筋細胞、
F:Prefusion myoblast。
核細胞の段階で GFP が活性化された。これらの GFP（+）細胞を単離し、これを抗原として分化筋細胞の表層抗 原に対するモノクローナル抗体ライブラリーを作製し、スクリーニングにより融合活性を持つ単核細胞（Prefusion Myoblast）と特異的に結合する抗体を取得、樹立し Yaksa 抗体と名付けた（図 2）。この Yaksa 抗体を用いて、融 合活性を持つ細胞だけを調製することが可能になっただけでなく、融合が起きつつある部位を可視化することも出 来た（図 3）。この抗体の利用により、筋融合開始直前に発現する遺伝子の解析、融合部位に集積するタンパク質の 解析、筋融合過程のイメージングなどが可能になると考える。
次に cDNA array を用いて Prefusion Myoblast で特異的に発現する約 500 個の遺伝子を特定し、さらにその遺伝 子を Gene Ontology database を利用した annotation 解析を行った。この解析をもとに、また Yaksa 抗体を利用し、
筋融合に関与する分子群を解明したい。
（English）
We are interested in molecular and cellular mechanisms of organ development and regeneration, especially from an aspect of cell-cell interactions required for morphogenesis and their spatial and temporal regulation.
Our research is now focusing on following topics:（1）molecular mechanisms of skeletal myogenesis and muscle regeneration, and（2）regulatory roles of ADAM（A Disintegrin And Metalloprotease）family proteins in cell-cell interactions and the ectodomain shedding during development. Although the third topic is originally studied in the first topic, we and others revealed that
Myoblast fusion is essential to form the multi-nucleated muscle fibers that provide the contractile strength of skeletal muscle. In an attempt to know molecular mechanisms of myogenic fusion, we established a novel monoclonal antibody, Yaksa that is specific to a subpopulation of myogenic cells. The Yaksa antigen is not expressed on the surface of growing myoblasts but only on a subpopulation of myogenin-positive myocytes. When Yaksa antigen-positive mononucleated cells were freshly prepared from a murine myogenic cell by a cell sorter, they fused with each other and formed multinucleated myotubes shortly after replating while Yaksa antigen-negative cells scarcely generated myotubes. These results suggest that Yaksa could segregate fusion-competent, mononucleated cells from fusion-incompetent cells during muscle differentiation. The Yaksa antigen was also expressed in developing muscle and regenerating muscle in vivo and it was localized at sites of cell-cell contact between mono-nucleated muscle cells and between mono-nucleated muscle cells and myotubes. Thus, Yaksa that marks prefusion myocytes before myotube formation can be a useful tool to elucidate the cellular and molecular mechanisms of myogenic cell fusion.
【業 績 目 録】
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誌上発表▣
（1）原著論文
Frohlich, C., Nehammar, C., Albrechtsen, R., Kribqvist, P., Kveiborg, M., Sehara-Fujisawa, A., Mercurio, AM., Wewer, UM..ADAM12 produces by tumor cells rather than stromal cells accelerates breast tumor progression. Mol. Cancer Res. 9（11）:1449-61（2011）
Kurisaki, T., Masuda, A., Nakagiri, S., Hayata, Y., Kuhara, M., Kishi, Y., Sehara-Fujisawa, A.. Generation of a
monoclonal antibody reactive to prefusion myocytes. J. Muscle Res, Cell Motil. 32: 31-38（2011）
Sunadome, K., Yamamoto, T., Ebisuya, M., Kondoh, K., Sehara-Fujisawa., A., Nishida, E.. ERK5 Regulates Muscle Cell Fusion through Klf Transcription Factors. Dev. Cell 20（2）: 192-205（2011）
（3）総説
飯田敦夫、瀬原淳子：ADAM8 プロテアーゼによる血液循環開始の制御、II. 冠循環の基礎 冠循環系の生理学、日 本臨牀（日本臨牀社）、69 巻 増刊号 7、P37-41（2011）
飯田敦夫：生きた個体で観察する血球の起源、実験医学（羊土社）、Vol.29, No.1（1 月号）、55-56 （2011）
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学会等の発表▣
1）学会・研究会発表
Iida A, Sakaguchi K, Nishimura D, Iwaki A, Yonemura S, Kawahara A, Sehara A.. Release of blood-vessel adhesion regulates both blood circulation start and angiogenesis in zebrafish. Joint Meeting ob the German and Japanese Scoeties of Developmental Biologists（2011.3.23 Dresden, Germany）
Atsuo Iida. Release of blood-vessel adhesion regulates both blood circulation start and angiogenesis in zebrafish.
第 44 回発生生物学会年会（2011.5.18 沖縄）
Takahiko Sato, Didier Rocancourt, Solveig Thorsteinsdottir, Margaret Buckingham. A Pax3/Dmrt2/Myf5 regulatory cascade functions at the onset of myogenesis. 第 44 回発生生物学会年会（2011.5.18 沖縄）
Yosuke Hiramuki, Takahiko Sato, Margaret Buckingham, Atsuko Sehara. Identification of miRNA players in muscle stem cells based on Pax3 expression. （Pax3 を発現する骨格筋幹細胞における miRNA の同定）第 44 回発生生物学会年会（2011.5.18 沖縄）
Yoshitaka Kimura, Takahiko Sato, Tomohiro Kurisaki, and Atuko Sehara-Fujisawa. A novel cell population, myogenin-negative cells, required for myogenesis. 第 44 回発生生物学会年会（2011.5.18 沖縄）
Iida A, Kawahara A, Sehara A.. Live imaging of cytoskeletal behaviors at the onset of blood circulation in zebrafish. 第 63 回日本細胞生物学会（2011.6.27 北海道）
荒井宏行、佐藤文規、瀬原淳子 : ADAM プロテアーゼの役割からみる心臓の弁形成機構の解明、第 16 回日本プロ テアーゼ学会学術集会（2011.8.26 大阪）
友澤 杏奈 , 飯田 敦夫 , 川原 敦雄 , 瀬原 淳子：Roles of ADAM10/Kuzbanian in vasculogenesis of zebrafish，17th Japanese Medaka and Zebrafish Meeting（2011.9.8 静岡）
飯田 敦夫 , 坂口 和弥 , 友澤 杏奈 , 川原 敦雄 , 瀬原 淳子：A novel erythroblast-mediated angiogenic regulation in zebrafish，17th Japanese Medaka and Zebrafish Meeting（2011.9.9 静岡）
Atsuo Iida, Kazuya Sakaguchi, Daigo Nishimura, Anna Tomosawa, Atsuo Kawahara, Atsuko Sehara-Fujisawa. 生 きたゼブラフィッシュを用いて血管形成の新しいメカニズムに迫る（Live zebrafishu sheds light on novel mechanisms on blood vessel formation）、第 84 回日本生化学会大会（2011.9.21 京都）
酒井大史 , 佐藤貴彦 , 櫻井英俊 , 庄子栄美 , Didier Montarras, 瀬原淳子 : the engraftment of fetal skeletal muscle progenitors into muscular dystropy models. The 21th CDB Meeting, The 1st CDB-Regeneration Biology Study Group meeting（2011.11.24 兵庫）
Hiroshi Sakai, Takahiko Sato, Hidetoshi Sakurai, Didier Montarras, Margaret Buckingham, Atsuko
Sehara-Fujisawa. Engraftment of embryonic and fetal myoblasts into dystrophic mice. 第 34 回日本分子生物学会年 会（2011.12.13 神奈川）
飯田 敦夫，友澤 杏奈，坂口 和弥，瀬原 淳子 : Primitive erythroblasts control a timing for blood vessel sprouting in zebrafish development, 第 34 回日本分子生物学会年会（2011.12.13 神奈川）
栗崎知浩，中井雄治，瀬原淳子、融合活性マーカーを用いた筋細胞融合制御遺伝子の探索、第 34 回日本分子生物学 会年会（2011.12.13 神奈川）
Tomosawa Anna, Atsuo Iida, Akira Kakizuka, Atsuko Sehara. Roles of ADAM10/kuzbanian in vasculogenesis of zebrafish. 第 34 回日本分子生物学会年会（2011.12.13 神奈川）
2）講演・シンポジウム
Atsuko Sehara-Fujisawa. "The Role of ADAM and RIP Proteases in Development and Beyond"（Discussion Leader）Gordon Research Conferences "Regulated Proteolysis of Cell Surface Proteins"（2011.7.10 Davidson, USA）
Atsuko Sehara-Fujisawa. A roles of ADAM8 in the onset of blood circulation. The 7th Aso International Meeting
（2011.7.30 熊本）
Atsuko Sehara-fujisawa. Roles of ADAM19 in nervous system development in zebrafish. Gordon Research Conference “Metalloproteinase Research at the intersection of Basic Science and Applied Medicine”
（2011.8.7 Smitnfield, USA）
Atsuko Sehara-Fujisawa. Roles of Meltrin beta（ADAM19）in development of peripheral nervous system. The 5th Asia-Oseania Zebrafish Meeting（2011.8.27 北京、中国）
Atsuo Iida, Kazuya Sakaguchi, Anna Tomozawa, Daigo Nishimura, Atsuo Kawahara, Atsuko Sehara-Fujisawa. A Role of ADAM8 in the Onset of Blood Circulation. KEY Forum in Developmental Biology and Regenerative Medicine-Supported by Global COE and IMEG, KumamotoUniversity（2011.9.9 熊本）
Tomohiro Kurisaki, Yuji Nakai, Atsuko Sehara. A digestive enzyme to function in myoblast fusion. 筋生化学国際 シンポジウム（2011.10.28 東京）
Daigo Nishimura, Hiroshi Sakai, Takahiko Sato, Atsuo Iida, Fuminori Sato, and Atsuko Sehara-Fujisawa. Roles of ADAM8 for skeletal muscle regeneration. The Second Pacific Symposium on Vascular Biology（2011.10.30 済州、韓国）