WT LPT

100±19 163±7

(%)

Fig･19We$tern blotana[ysi$OftheWTand LPT Ce"micro$Ome$USin9theanti･$erumagain$tthe

$malrl00POftheDcPAl.The$eCOndaryreaction

Wa$ COndLJCted with a]ka]ine pho$Phatase

COnjugated

^goat anti･rabbit

lgG(Fc),and

Vi$ualization ^wa$ COnducted by _nitro blue tetrazoriLJm and 5･bromo･4･Ch[oro‑3‑indo[yト Pho$Phate･Signa[inten$itie$Were CalcuJated by NIHimage _analy$Is pro9ram.Means and SD are

8hown(〃=3).

(cOLX)∽l当PO己ト∝u傭 ｣￠q∈コuldて0のu空ト

丁 2 4 5 3 β

type‑" type‑l βcPA

Fig･20TranscriptnumbersintheDcfWgenes

by quantitatjve

RT‑PCR.WT(filled _column) andLPTcells(OPenCOlumn)werecuJturedin

aR2mediumfor7d.ThePCR reactionswere COnducted usfng ^an aliquot of RT products Obtained fromlpg _of totalRNA as the tempJateandapaIrOfspecificprlmerSforthe

3'UTR of eachisoform.The PCR products

Were Stained with SYBR Green]and

と考えられた｡

2･3･5助∫anti･SenSe組換え体の解析

クエン酸放出に対するPM H+･ATPaseの直接的な関与を確かめる為に､

LPT細胞において転写レベルが優勢的であるムk月41をAgrobacterium法によ りanti･SenSeでLPT細胞に組換え､3ライン(ASl,2,3)を得た｡また､コン

トロールとしてpIG121･Hmを導入したラインも得た｡導入の確認は､ゲノム DNAを抽出し､T･DNA領域のvectorに特異的なprimerと瓜二月41に特異的な primerでPCRすることにより確認した(Fig.21)｡その結果､LPT細胞では 増幅が認められず､POSitivecontrolとしたpDcPAl･Hm及び組換え体では目的 のシグナルが増幅した｡

この条件下で､組換え体のPMH+･ATPase活性を測定すると､コントロー ルとLPT細胞では同等だったが､ASl､AS2､AS3はコントロールと比較して､

それぞれ76%､59%､63%に減少していた(Fig.22)｡また､Ca溶液中(pH5.6) でインキュベー卜した時のpH変化をモニターしたところ､pHの減少はLPT 細胞でApHO.80､ASlでApHO.64､AS2でApHO.30､AS3でApHO.57と

LPT細胞に比べASラインでpHの減少が抑えられていた(Table5)｡この減少 がタンパク質レベル､遺伝子レベルでの発現の抑制によるものであるのかを､

westernblot及び転写量解析により確かめたところ､3ラインともLPT細胞よ

りタンパク質レベルが減少しており(Fig.23A)､また､最もPM ^H+･ATPase 活性､タンパク質レベルが低下していたAS2では､皿Jの転写量のみが63%

に減少していることが認められた(Fig.23B)｡

更に､クエン酸放出も､85%､55%､60%とコントロールに比べてそれぞ

れ減少しており､PM H+･ATPase活性の減少とクエン酸放出の減少の間に高い 相関関係が認められた(r2=0.927)｡しかし､WT細胞と比較してみると､AS2

と3はPMH+･ATPase活性がWT細胞と同じレベルにまで減少しているが､ク エン酸放出はWT細胞よりも高かった｡

(Å)

(B)

Fig.21GenomicPCRoftherecombinantLPTcell

line$･The genomic DNA was extracted uslng Nuc[ejc Acid Purification Kit Mag Extractor

(TOYOBO)･The

^PCR reactjon ^was perfbrmed LJ$]ng ^a Pair of vector specific and DcfWlor 加地Ⅶ椚‑GUS印eCific prime怜.Thearrowsindicate

Objectivebands.

(A)anti‑$en$ereCOmbinantLPTce]LLine$

(B)contr01celllines

5 4 3 2

1

0

(.‑き竜巴‑習;竜∈ヱ 01巾占.6P￠l小一OX山

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 PMH+･ATPaseactivity

(LlmOJ/min/mgprotein)

Fig.22Correlatjon between PM H+･ATPas activity and citrate excretion of the

recombinanl:LPT ce"line$ Withih打On‑GuS

(COntrOl)andanti‑SenSeDcFu7(AS[ine$).The

excreted cjtratewa$meaSured afterincubation

inaCaso[ution,PH5.6($eeFig.5caption)for3

h･The PM H+‑ATPa$eaCtivitywas _measured us]ngthemicro$Omalfraction.Thecorrelation

COefficjent ^was calcuJated using only the recombinant cellline$.Means and SD are

$hown(〃王3).

■;COntrOl,○;ASl,●;AS2,●;AS3,△;LPT

Table5ThepH

shiftinaCasolution,PH5.6(SeeFig.5 CaPtion)duringincubatedeachcel=inefor5h.

LPT ASI AS2 AS3

ApH O.80士0.02 0.64±0.02 0.30±0.06 0.57±0.08 ThepHwasmonitoreduslngaPHmeter.MeansandSDare

Shown(〃=3).

(巾OLX首当PO‑dト∝u山

一Oq∈コu‑dて0￠u巴ト

^▲U

O 3

2

丁 2 ∂ 4 5 β

β甜

Fjg.23We$tern

b10ttin9(A)and transcrlpt(B) analyse$lnASline$.(A)Westernb[otthgana[ysis

Ofthe micr080me$○†each c0111in0.Tho primary andsecondaryreaction$WereCOnductedwithantl‑

Serum agahst the$ma"[00P Ofthe DcPAland

alka‖ne pho$Phatase

conjLJgated

^goat anti･rabbit

]gG(Fc).VisuaIizatlonwasconductedbynrEroblue

tdra王Or山m and 5･bromo‑トChloro‑&lnd01yト

Pho$Phate.(B)Tran$Crlpt

^{number$Of each DcFu}

i$Oform h theAS2and ^the LPTce"Iine.LPTce]1$

(filIed c01umn)and ÅS2(OPen C01umn)were

Culturedlna R2mediumfor7乱丁hePCRreadions

2‑4考察

1章において､LPT細胞の細胞膜上におけるクエン酸の輸送機構を解明し､

それに関わるタンパク質としてアニオンチャネル及びPM'H･･ATPaseを同定し た｡この章では､特にPMH+･ATPaseに着目し､生理学的､分子生物学的観点 からこのタンパク質の特性の解析を行った｡

WT細胞に比べ多量のクエン酸を放出し､それに伴い等価のH+をPM H+･ATPaseから放出している以上､何らかの変異がこのタンパク質に起きてい ることは明白である｡そこで､PM H+･ATPase活性を測定する為に､水性二層 分配法により細胞膜を精製した｡これは､｢緒言｣で述べたように､PEG層と

dextran層からなる水性二層分配液を利用し､膜の表面電荷や疎水性により膜画

分を分配する方法である(吉田,上村1987)｡表層に強い陰性の電荷を持つ

right･Side outの細胞膜のみがPEG層に分配され､この分配操作を3回線り返 すことにより高純度の細胞膜を得た｡純度の検定は､Table3に示すようにマー

カー酵素活性を測定することにより行い､細胞膜マーカー酵素活性以外はいず れも10%以下まで活性が減少していた為､高純度の細胞膜画分が得られたと判 断した｡PMH+･ATPase活性は､細胞膜マーカー酵素活性そのものであるので､

これを両細胞間で比較するとLPT細胞の方が3倍活性が高く､このことが大量 のクエン酸放出に見合うだけのH+を放出できる理由であると考えられた｡また､

これまでに同定されてきたCSとNADP･ICDHにおける活性の変化は､タンパ ク質量の変化､しいては転写量の変化であった(Takitaetal.1999b,Kiharaet

al.2003)｡クエン酸放出時にH+を放出するwhitelupinも､PMH+･ATPase活 性の増加に伴いタンパク質量の増加が認められている(%netal.2002)｡これ

らのことから､LPT細胞のPMH+･ATPaseも遺伝子レベルでの変化が起きてい ることは充分に考えられた｡

そこで､LPT細胞からPM ^H+･ATPase cDNAの単離を行ったところ､6 種類の全長cDNA(助1,名昂45;戊 が単離できた｡PMH+･ATPaseは､2

もしくは5種類のsubfamilyに分類することができ(Ou払ttole et al.2000,

DamblyandBoutry2001,Palmgren2001,Arangoetal.2003)､系統樹から､

助1､且.4,5はtype･ⅠⅠに､皿且6はtype･Ⅰに分類できた(Fig.18)｡

また､C末端から4番目のアミノ酸によって統計的に分類することもでき､tyPe･Ⅰ はSer(55%)もしくはAla(45%)であり､type･IIはHis(87.5%)もしくは

Asn(12.5%)である(DaふblyandBoutry26dl)｡刀戒41､2､4,∂はHis､

地久6はSerであった為､このこともそれぞれtype･ⅠⅠ､tyPe･Ⅰであること

を支持していた(Fig.17)｡しかし､A招ム軸点血塊a肋朋や肋よ血刀∂

pIzLmbaginiW8=は､他のtype‑III､ⅠⅤ､Ⅴに分類されるisoformも存在する｡

その為､ニンジン培養細胞にもこれらに分類されるiso丘)rmが存在する可能性 は充分に考えられるが､作製したde･generate primerが他のtypeにも cross･reaCtすることを考慮すると､他のisoformは転写量が低くニンジン培養

ものであり､LPT細胞における高いPMH+rATPase活性にはこのisoformが大

きく貢献していることが充分に考えられた｡一方､WeStern blotによる発現量 の比較から､LPT細胞の方が発現量が高いことがわかったが､DcPAlに対する

抗体を利用しているにもかかわらず､その発現量の差はわずか1.6倍であった (Fig.19)｡これは､抗体を作製したDcPAlのsmal1loop領域が他のisoform と相同性が非常に高いことにより(アミノ酸レベルで>90%)､抗体が他の isoformにもcross‑reaCtしてしまう為だと考えられた｡実際､両細胞における PMH+･ATPaseの全転写量は､WT細胞で4.4×104､LPT細胞はその1.6倍の

6.9×104であり発現量の差に一敦している｡以上のことから､LpT細胞におけ る高いPMH+･ATPase活性は発現量の増加､更には転写量の増加によるもので あることがわかった｡

LPT細胞の高い助J転写レベルが実際にクエン酸放出に必須であるか を確認するには､anti･SenSe組換え体により発現を抑制することが最適である｡

得られた組換え体は､PM H+･ATPase活性やクエン酸放出にライン間でばらつ きがあるものの､活性の減少がそのまま放出の減少につながっており､両者の 相関関係は非常に高いものであった(Fig.22)｡Ca溶液のpH変化もPM

H+･ATPase活性の減少に伴い､ASラインで変化が抑えられていることが認め られた(Table5)｡また､WeSternblotの結果発現量が減少していることが示さ れ(Fig.23A)､更にそれはムkた4Jの転写量の減少によるものであった(Fig.

23B)｡よって､淵Jの高い転写レベルによる活性の増加は多量のクエン酸放 出に必須であると結論付けた｡しかし､AS2や3は活性がWT細胞と同レベル にまで減少しているのに対し､クエン酸放出はWT細胞よりも高いという結果

であった｡可能性としては､H+以外のカチオンの放出がクエン酸放出に関与し ており､その為放出がこれ以上減少しないということがあるのかもしれない｡

これは､バナジン酸を添加した状態でクエン酸放出を測定しても完全には阻害 されなかったことからも伺える(Fig.10)｡しかし､クエン酸とH+の放出は定 量的にバランスのとれた関係にある為(Fig.8)､必ずしもそうとは言い切れな

い｡また別の観点から推測すると､WT細胞でもLPT細胞でもCa溶液に移植 直後の0時間目に､濃度依存であると思われる放出がわずかにある｡濃度依存

である理由は､この時にpHの変化がないことから伺える(data not shown)｡

しかし､WT細胞ではその後一定であり､またクエン酸を吸収する為の力が見受 けられないことから､平衡状態にあるのではなく放出が止まっている､つまり

クエン酸は細胞質に少量しかなく液胞に蓄積されているのではないかと考えら

れた｡実際､SyCamOreにおいて有機酸が細胞質よりも液胞に蓄積されていると

いう報告がある(Goutetal.1993)｡しかし､LPT細胞や組換え体はWT細胞

に比べクエン酸含量が高い為､細胞質の濃度も増加している可能性がある｡そ

れにより､組換え体は濃度依存的な放出がWT細胞よりも高く､PMH+･ATPase

活性が同程度であってもクエン酸放出はWT細胞レベルまで減少しないのでは

ないかと考えられた｡しかし､細胞質中の濃度については仮説の域を出ない為､

液胞中の濃度等を含め測定する必要があるだろう｡

総合考察

Alイオン及びそれに伴うリン酸欠乏状態に対する抵抗手段として､有機酸 の放出がこれまでに様々な植物において研究されてきた｡有機酸はキレ一夕ー として働き､Alイオンの無毒化､リン酸Alからの可溶性リン酸の溶出という効 果を持っ｡放出される有機酸は植物によって特異的であり､Wheat､rye､triticale 等はAlイオンに応答して特にリンゴ酸を(Ryanetal.1995,Lietal.2000,Ma etal.2000)､Whitelupin､tOmatO等はリン酸欠乏時にクエン酸を(Neumann

etal.1999,NeumanムandR6mheld1999,Imasetal.1997)､SOybeanはAl

イオンに対してクエン酸を放出する(Silvaetal.2001,%ngetal.2001)｡

また､リンゴ酸を放出する植物には代謝変動を伴わない場合が多く､一方 クエン酸を放出する植物では代謝変動が起きる場合が多い｡これに対する1つ

の推測が､一般的に有機酸含有量はリンゴ酸の方がクエン酸に比べ圧倒的に多

く(Mimuraetal.2000)､リンゴ酸を放出する場合はそれをそのまま放出すれ

ばよいが､クエン酸の場合は代謝を変えることによって過剰に蓄積させる必要

があるということである｡WhitelupinやrapeではPEPCase活性が(Homand

etal.1992,Johnsonetal.1994,Neumannetal.1999)､SOybeanではCS活性 が確かに増加している(%ngetal.2001)｡

我々がリン酸Al培地から選抜したLPT細胞も､代謝変動によりクエン酸 を過剰に合成するタイプであり､これはCSの高発現､NADP･ICDHの低発現 によるものであることがわかっている(Takitaetal.1999b,Kiharaetal.2003)｡

ドキュメント内 低リン酸耐性ニンジン培養細胞におけるクエン酸輸送関連タンパク質の解析 (ページ 73-96)