(A)
PQE･60
(B)
PQ∈‑60
EcoRI/RB$ 〟coI 8amHIβgJⅡ 6×Hiさ
CCATGGGAGGATCCAGATCT
亡CORIJRB$ 〟￠○Ⅰ
句仰
CCATG $ma‖100P A(;ATCT
〃加dⅡ ち
NaH2PO4,0.01MTris･HCIpH4.5)により溶出して精製した｡抗体の作製は北 山ラベス株式会社に依頼した｡
2‑2‑9westernblot解析
サンプル(粗膜画分)のSDS化は､懸濁液C(保存用)に終濃度でSDS が1.2%(w/v)､2･merCaPtOethanolが5%(v/v)となるように加え､100℃､5 分間処理することにより行った｡ポリアクリルアミド濃度は､3.13%濃縮ゲル
(3.05%b/v]acrylamide monomer,0.08%k/v]N,N,･methylenebisacryl･
amide,127mMTris･HCIpH6.8,0.1%[w/v]SDS,0.1%【v/v]TEMED,0.1%
【w/v】ammonium persulfate)､12.9%分離ゲル(12.6%【w/v]acrylamide･
monomer,0.34%【w/v]N,N,･methylenebisacrylamide,376mMTris･HCIpH 8.8,0.1%k/v]SDS,0.1%【v/v]TEMED,0.1%【w/v]ammoniumpersulhte) で行った｡泳動用緩衝液(9.9mMTris,77.3mMglycine,3.5mMSDS)､及び
ゲル板を泳動槽(ATTO AE‑6440)にセットしてからサンプルをアプライし､
15mAで電気泳動を行った(ATTOCONSTAPOWER3500)｡
電気泳動後､ミニトランスプロットセル(BIO･RAD)及び転写bu脆r(25 mMTris,192mMglycine,20%[v/v]methanoIpH8.3)により､100V､300mA､
1時間でゲルからPVDF膜(ClearBlotmembrane･P,ATTO)へのtransferを
度TBS･Tで洗浄し､TBS･Tで15,000倍希釈したalkaline phosphatase
conjugatedgoatanti･rabbitIgG(Fc)r(Promega)を二次抗体として室温で1時 間インキュベー卜した｡PVDF膜を洗浄後､発色用bu鮎r(100mMTris･HCIpH 9.5,100mMNaCl,5mMMgC12)で5分間平衡化し､アルカリフォスファター
ゼの発色基質である nitro blue tetrazolium(Promega)と 5‑bromo･4･Chloro･3･indolyl･phosphate(Promega)を終濃度がそれぞれ340 pg/ml､170pg/mlとなるように希釈した発色用bu鮎rで発色させた｡発色は､
停止液(1%k/v]aceticacid)に浸すことで止めた｡
シグナルの定量的な解析は､U.S.NationalInstitutes ofHealth(NIH)
web page(http:〟rsb.info.nih.gov/nih･image)から得たNIHimage analysis PrOgramにより行った｡
2‑2･10肋打亡びβCa∫P由月好伊d乃なβe(助)の転写量解析
転写量解析はQuantitativeRT･PCR(QRT‑PCR)により行った｡WT､LPT 細胞をR2培地30mlに0.5gずつ移植し､1週間培養後､ミラクロス(Calbiochem 製)上に減圧回収し､･80℃に凍結保存した｡これらからAGPC法によりtotal RNAを単離し､1pgを逆転写してsscDNAを合成した｡それをtemplateに､
各isoformの3'untranslatedregion(UTR)に対するspecificprimer:β劇1
forward,5'‑AGAGAmCGTAACTCAACTC･3';reverse,5'･GGTACTGCTGAT･
ATTATAGC･3';淵2forward,5'･AGTGTAAGAAGCTGTACATG･3';reverse,
5'‑GGAATTTATGACACAAAGTGT･3';刀c月43forward,5'‑TACACTGTC℃AA･
GAAGAGGA･3';reverse,5'･GCACATTGCCAACTCTGATA･3';助 4
forward,5'･GTATGCATAAATTGAGCTGG･3';rev?rSe,5'･CCACAAGTGCAA･
TCAAATCA･3';戊月4 5 forward,5'･GACTGAGATGAAGATATATATG･3'
re寸erse,5'･AGAAAGCAAAGTATCACTGG･3';皿6forward,5'･ACACCG･
TCTAAGTAACTAAAT3';reverse,5'･TGTATTGCTGGGGATTGCAA･3'を利用
しPCRをした｡まず､指数関数的な増幅を示すcycle数を決定し(940C,30sec;
500C,30sec;720C,30sec;ムk月41,22cycles;地名24cycles;助長24 CyCles;助425cycles;皿5;23cycles;淵625cycles)､次にその
isoformの3'UTRを挿入した既知分子数のplasmidをtemplateにして指数関 数的な増幅を示す適当な分子数の範囲を決定し､これをstandardとした｡解析
は､電気泳動後アガロースゲルをSYBRGreenI(MolecularProbes)で染色し､
Ⅵ1riable ModeImager取phoon9400(Amersham Biosciences)とImage Quant(AmershamBiosciences)にて行った｡
2･2･11助1anti‑SenSe組換え体の作製
組換え用constructには以41の5'､3'UTRを含む全長とpIG121･Hm
(Ohta et al.1990)を利用した｡月山聖Ij の全長は､forward, 5'･GGGGAGCTCGATGAGAGTTCCTCTTTT･3,(下線は励cIsite);reverse,
5'‑GGGTCTAGAAGGTACTGCTGAmGC‑3,(下線はmaIsite)の
B
NOStor ユ5Spro NO$to†35Spro
J〝Iro〝‑GU5
■一員∽■‑叫L 〓句り ■‑♪‑
‑止○)叫 ■〓∈句q
ユtコ些=コ･‑･
‑‑ L8NOSpro NPT" NOSter 35Spro NOStor36Spro HPT NOSter
Kmr a〃掛きelI5e8cPA† Hygr
Fig.15T･DNAregion$OfthebharyvectorintroducedintoLPTce"$byAgrobacfe血mLumeねciensdTlediated
method.(A)lnhn･GuSwasintroduced a8aCOntr0l.(B)Dc朋1wa8rePlacedlntonal･SacIsitein the
dFrectionoftheanti･SenSe,andintroduced･RB,rightborder;LB･leftborder;CaMV35Spro･Caulif]owerrnosaic Virus35$promoter;NOSpro,nOPalinesynthasegenepromoter;NOSter,nOPa]ine$ynthasegonetormhator;NPT ll,neOmyCinph08Photransfbra8e";HPT,hygromycinpho$Photran8fera$e.
LPT3u叩即戚onco他 (R2modium)
25℃,Tday8 Settledcultリーo
COヰu托u帽WithAgroba￠t即血m (R2m￠dlum￠Ont8ininglO岬/ml
Acot08yringon)
=
25℃
引戎抽如=川Itu柑
25℃,2day8さ○壮lod￠リーtU帽
StOr日工ationofAg帽bac他rhlm
(9旭川kodw■hrcont別11ng 500■g/mlGObbxlmo)
=
mu托暮p馳ation0lco他
(R2modiu叫
mating法によりAgmbactezjumtzLmeAcibns(EHAlOl)に導入した(Fig.16)｡
対数増殖期まで培養した LPT細胞を､無菌的にろ糸氏上に減圧回収し､
acetosyringonlOpg/mlを含むR2培地に浸漬した滅菌ポリウレタンスポンジ 上に置いた｡前培養したEHAlOlは､aCetOSyringonlOpg/mlを含むR2培地
にOD600=1.0となるように懸濁し､培養細胞に感染させ25℃で3〜5日間共存
培養させた｡EHAlOlに覆われたLPT細胞をcefotaxime 500pg/ml含有滅菌 水に懸濁後､低速遠心(400×g,5min)することにより両者を分離し､これを3
回線り返して除菌した｡EHAlOlを完全に殺菌させると共に遺伝子が導入され たLPT細胞を選抜する為に､Cefotaxime 500pg/ml､kanamycin 50pg/ml､
hygromycin 25pg/mlを含むR2培地に浸漬させたスポンジ上にLPT細胞を
置き､25℃で約1ケ月無菌的に培養した｡出現したカルスを抗生物質を含む寒 天培地に移し､2次選抜により組換え体を得た｡
2‑2‑12ゲノムDNAの単離
LPT細胞及び組換え体からのゲノム DNAの単離は､Nucleic Acid PurificationKitMagExtractor(TOYOBO)により行った｡ゲノムPCRは､
LPT細胞､ASラインに関してはCaMV35Spr｡に対するspecific primer,
5'‑GGAAGGTGGCTCCTACAAATGCC･3'とムk毘4Jに対するspecific primer, 5'‑GATGAGAGTTCCTCTTTT‑3'を用い､コントロールラインに関しては､
CaMV35Spr｡に対する specific primer,5'･GGAAGGTGGCTCCTACAAAT･
GCC･3'とNOSterに対するspecificprimer,5'‑GAMCATCGCAAGACCGG･
CAACAGGATTC‑3'を用いた｡
2‑2･13助1anti‑SenSe組換え体の転写量解析
淵1anti･SenSe組換え体をR2培地30mlに0.5gずつ移植し､1週間
培養後､ミラクロス(Calbiochem■製)上に減圧回収し､･80℃に凍結保存した｡
これらからAGPC法によりtotalRNAを単離し､ムk毘4Jに関してはムk毘4 SenSeSPeCificprimer,5'･TGCGCTCCCGAGTTGAGTTA･3'を､淵且a4,
荻.βに関しては01igo(dT)20Primerを使用して1pgを逆転写した｡それを templateに､淵1は5'UTRを含んだ領域に対するspecificprimer:助1
forward,5'･GATGAGAGTTCCTCTTTTCT･3';reverse,5'･TTTTGGGAGCGA･
GACCA･3'を使用し､940C,30sec;500C,30sec;720C,30sec;30cyclesの条件 で行った｡戊月4之.よ.4､∂､βは2･2･10と同条件で行った｡
2‑3結果
2‑3‑1PMH+‑ATPase清性の比較
1章において､LPT細胞ではクエン酸放出時にPMH･･ATPaseを介して H+を放出していることがわかった｡これはWT細胞では認められないことであ
り､両細胞間でPMH+･ATPaseに変異が起こっていることが考えられた｡そこ で､水性二層分配法により細胞膜を高純度に精製し､活性を比較することにし た｡細胞膜が高純度に精製されているかどうかは､各膜のマーカー酵素活性を 測定することにより検定した｡Table3に示すように､WT細胞､LPT細胞共に
液胞膜マーカー酵素のnitrate･SenSitive ATPase､小胞体膜マーカー酵素の NADHCyt‑Creductase､ミトコンドリア膜マーカー酵素のCyt‑COXidaseのい ずれも､活性が細胞膜画分で約10%もしくは0.00pmolmin･1mgprotein‑1まで 減少しており､細胞膜以外の混入はないと判断した｡この条件下で細胞膜マー
カー酵素であるvanadate･SenSitiveATPase活性､つまりはPMH･･ATPase活 性を両細胞間で比較すると､WT細胞で0.50pmolmin･1mgprotein･1であるの
に対し､LPT細胞では1.50pmolmin･1mgprotein‑1と3倍高い活性を示した｡
よって､多量のクエン酸放出に見合うだけのH･を放出する為に､LPT細胞では PMH+･ATPase活性が増加していることがわかった｡
2‑3･2PMH+‑ATPasecDNAの単離
WT､LPT細胞間でPMH+･ATPaseに変異があることがわかったので､更
TabIe3Specificactivitiesofthemembrane‑bindingproteinsinmicrosomeandplasma membranefractionsisolatedfromWTandLPTce]ls.
Markerenzymes
Activitiesofmarkerenzymes(PmOlmin‑1mgprotein 1)
Microsomefraction
WT LPT
Plasmamembranefraction
WT LPT
Vanadate‑SenSitiveATPase O.25±0.01 Nitrate‑SenSitiveATPase O.21±0.02
NADHCyt‑Creductase l.01±0.15
Cyt‑COXidase O.23土0.01
0.31±0.00 0.23±0.02 0.81士0.00 0.30±0.03
0.50±0.05 1.50±0.09 0.02士0.01 0.00士0.00 0.00±0.00 0.09±0.09 0.00±0.00 0.00±0.00
に分子生物学的な解析を進める為にLPT細胞からcDNAを単離することにした｡
A指物点血塊a血刀私jおa皿旦作､(力:I甥a点aが柑､∧お()由朋〆lエ皿ムag血戯由 の4種類の植物､6種類のPMH+･ATPaseの保存されたアミノ酸配列を元に設
計した2組のde･generatePrimerによりde･generatePCRを行った｡約50ク ローンを得ることができ､BIJASTdatabank及びCLUSTALWによる解析の 結果､最も優勢的な皿Jとそれ以外の淵且引こ分類することができた｡
この3種類に関して､それぞれspecificprimerを設計し､5'RACE､3'RACE によりUTRを含めそれぞれ3201､3382､3162bpの全長cDNAの配列を決定
した｡推定されるアミノ酸は､それぞれ950(104.7kDa)､951(104.8kDa)､
956aminoacids(105.3kDa)であり､5,UTRは72.､150､80bp､3,UTRは279､
379､214bp得られた｡また､膜貫通領域予測ツールSOSUIの結果､植物の PMH+･ATPaseの特徴どおり10個の膜貫通ドメインが存在した(Fig.17)｡Fig.
17の白字で示してある匝sはATP結合残基であり､そのATPによってリン酸 化される残基がAsp(1)である(Palmgren2001)｡イオンの膜輸送にATP加 水分解を利用し､リン酸化された中間体を形成するという現象は､P･type ATPasesuper払milyに属するイオンポンプが有する特徴であり､Asp(1)か
ら続く『DKTGTI∬』はP･tyPeATPaseであることを証明するモチーフでもあ る｡白字のThr及びAsp(2,3)は､それぞれPMH+･ATPaseの活性化を行う
14･3･3が結合する為にリン酸化される残基､Asp(1)に結合するリン酸基を中 和するMg2+が結合する残基を示しており､これらも保存されていた｡以上のこ
とから､単離した瓜=月4はP･tyPeATPaseに属するPMH+･ATPaseであると結 論付けた｡
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バーてロT,ごECC九Ⅰ7RP抑入1EmVLご
Op′L q粁√.
占甘RLAqQGÅユ1■已良さn■Aユ己皿!∧〔コ心】VLC 5一丁下しA(:※コGAエ1鼠RJ■nLAユEE眠Ⅰ心1√L亡 QmでAユr;村上⊂エくご5J八Wトこ:ElT∇WPIつEM∵乙1'GIDNI▲LVt†∴〔に;TP!肌SⅥⅠ屯uGSERL入世X,Å1rrま≡Ⅷ‑八一F:ⅧGⅧ)m
てVLLCA/J憬1く1■EI(QDAJコÅAT∇C｢こ■三ノ入DPREA月｣り⊃11岨VHFFpFⅣmE;÷TAJ.TF一口5PGr√.･丑苫 ymLr▲AAf:八雲RVEVロワ几10A⊂好ノG餌PFE皿;TIIFⅦFT.PFTヾPmKFでA⊥′上■YlnNNNム■.･.r甑
N岩L5Vつ見封LVEVFA尺GV口RE N冗;.TVロKNこ｡1F:VてAlく(丁▽□入r〉
払′rVl)払!ム1EV÷､氾;(ミmAD
■∧屯㌻1′〔ユ･†･ご:爪1PPR}DざÅE■ご二旦1び山∴′冊〟官珂TrrCTブ〕LAニA又E′rGEf(こぶⅠ瓜■工､N忙ゞp≦丸氾.1J;ロNFコÅごIASLPIJDEL工El弧FJ広U三,'2L三K¥仁1VERLOI:三RHI∝三 し■和ごV〔TLL5LF三ユpPト且ロド言t汀:P戸A†.R:ぷⅥ爪ⅧでGこや｣1⊥A尺上二'｣t;府TJ̲て叩プrN†･7PSmLGロコKコ入ゴ1ムS｣叫几化し=･:E戸.DGF郎コ∇FPEH冗マEIⅥ､ロムOEと:民Eユm l■7rLF∇〔;T･t･P三･FコPPRHDSju■ニ､二只NLutコニ】Ⅵユノ7Lmr?GTX[LA二A且ErlLGLlllLC♪E3■r潮rP÷｢;LJT.T.仁叩F〔)SÅlA主L与11HE｣工EuLLXユFN■wpFTTFYETIJ7rFて.OEEmTVG
困コFV5L:1PLl■J2ゝ'l皿ご′止丁了■こ耶AtJ几ぷ'丑ⅧコでG工将｣ムニ〔;はETし;RPlⅢlTⅧP5S.ゝL⊥仁Q上JEDと≦1皿PlコFT一丁EIてAmFAmPEEとTEIVmロAきヱHI⊂G
し､りFfCJ‑･LPLアロPPⅢ皿三入E■Ⅰ■:〃丁･ALI寸:ノ机Ⅳ∨下t亡てCDq仏工G医王′Ⅸ;EFユG耶1W爪■PS5Å⊥lぷローEロE5ユ九≡⊥PI⊃E⊥J上1くA□Gf■ÅGlノF 戸口r¥てETVXRLロAR丘11Im
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l一人JS【こアAt､mlIEロR■爪ざ■三レ1■1ぴ□YCFl｢lこ買E島ロー抑′Q亘TLIJGLOl〉P三∧｢｢NJFyコmSNTRE⊥SEI入已Q∫ul弓･ぴ､EV八戸了｡RFL【rTLEG㌻ⅣE5V∇盲ニRGLD=mLI YALさGIこÅリノしヨLL訂こ三丁入FTTFrDYCKEE上ノヽQ仙MtAQI}′T†.†･【rエロPPア皿SIJユFDD町J≦‑Y良三:.SETAEOAアR芦.ゝEVA且LFヱ｣∬二■⊥上:(】㌻rノ己5＼.V註⊥EGL:ユ:DTT
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Fig･17AJignmentofthededucedaminoacidsequencesofDcPA7,2,3,4,5and
and〃ね○ぬnap仙m由g血〟b佃戸〃〃■功m5e(P〃A2and川朋叫.加PAT,2,4and5
andFIMA4be[ongtotype‑1[subfamily,andDcFu3and6andPMA2belongtotype‑1
DcPAlと 2 は∧肋tibDa PlumbagiDihlibのPMA4(89,88%)､
Ambjdpsjktba血DaのAHAl(86,85%)と､DcPA3はPMA2(92%)､AHA4
(90%)と高い相同性を示し(Table4)､更に系統樹を作製したところ､瓜必ム 2は月眩44,A劇1同様･tyPe･ⅠⅠに､淵3は月眩42.A月A4同様type･Ⅰの
sub払milyに分類された(Fig.18)｡系統樹とは別に､植物のPM H+･ATPase は統計的にC末端から4番目のアミノ酸によって2種類のsubfamilyに分類す
ることができ､tyPe･ⅠはSerもしくはAlaであり､tyPe･IIはHisもしくはAsn である(DamblyandBoutry2001)｡DcPAlと2はHis､DcPA3はSerであ
り(Fig.17)､このこともsubfamilyの分類を支持していた｡更に､これら3種 類のcDNAにおいてアミノ酸配列がほぼ一敦する領域を元に､de･generate primerを新たに設計し再びde‑generatePCRを行った｡約30クローンを解析
し､3種類のisoform:.仇二月44.久6を得た｡5,RACE､3,RACEにより､UTR を含めそれぞれ3283､3195､3384bpの全長cDNAの配列を決定した｡推定さ れるアミノ酸は､949(104.8kDa)､950(104.7kDa)､956aminoacids(105.3 kDa)であり､5'UTRは137､161､276bp､3,UTRは299､184､240bp得ら
れた｡系統樹からムk月44､5はtype･ⅠⅠに､ムkだ4βはtype･Ⅰに分類され､C末 端から4番目のアミノ酸がDcPA4､5はHis､DcPA6はSerであることもそれ
を支持していた(Fig.17,18)｡また､淵1､213が有していたPMH+･ATPase
の特徴的な配列等は全て同様に有していた｡6種類のiso丘〉rmで相同性を比較し てみると､tyPe‑ⅠⅠのDcPAl､2､4､5どうしで92%以上､tyPe･ⅠのDcPA3､
6で98%と非常に高い相同性であった(Table4)｡また､異なるsubfami1y･ど うしで比較してみても､約80%の相同性を示した｡