membraneH+‑ATPaseの解析 2･1緒言
1章において､LPT細胞の細胞膜上におけるクエン酸輸送には､クエン酸 選択性を有する可能性のあるアニオンチャネル､及びクエン酸放出と同時にH+
を放出しているPMH+･ATPaseが関与していることを示した｡H+の放出に関し ては､Whitelupinの報告にはないクエン酸放出との定量的な結果を得ることも
でき､またWT細胞とは明らかに放出パターンが異なることから変異が起きて
いる可能性は非常に高いと考えられた｡生理学的に細胞膜上におけるタンパク 質の特性を調べるには高純度の細胞膜を単離する必要があり､それには水性二 層分配法が適している(Fig.13)｡水性二層分配法は､POlyethyleneglycol層(PEG層)とdextran層からなる水性二層分配液を利用しノ､生体膜の表面電荷 や疎水性により各層へ分配する方法である｡表層に強い陰性の電荷を持つ right･Side outの細胞膜のみがPEG層へ､inside‑Outの細胞膜及び液胞膜やミ
トコンドリア膜等その他の膜画分は全てdextran層へ特異的に分配される(吉
の報告が行われており､知見の広い遺伝子である｡PM H+･ATPase遺伝子は SuPer･gene払milyを形成し､Amム物見由tbalibDaで12個(Palmgren2001)､
仇γ詔Sativaで9個(Arangoetal.2003)､入物由DaPIzLmbagit2戯由で9個 (Perezetal.1992,Moriauetal.1993,Oufattoleetal.2000)と非常に多くの isoformが単離されており､2もしくは5種類のsub払milyに分類される
(Ou払ttoleetal.2000,DamblyandBoutry2001,Palmgren2001,Arangoet al.2003)｡分子量は約100kDaであり､N末端側からactuatorドメイン､ATP 結合ドメイン､リン酸化ドメイン､活性調節ドメインとなっており､通常10個 の膜貫通ドメインを持つ(木下,島崎2003)｡耐性品種獲得への有用遺伝子と
して確立する為に､これらの知見を元にLPT細胞からPM H+･ATPase遺伝子 を単離して一連の分子生物学的解析を行うことによりWT■細胞との相違点を見 い出すこと､及びアンチセンス組換え体を作製することによりクエン酸放出に 対する必須性を証明することを目指した｡
Micro$Omal fraction
0
00●●
｡㍉｡帰･●
000●●
●
Polyethyleneglyc0l Phase
Dextran Phase
Ultracentrifuge
l
Pla$mamembranal fraction
●:Right‑$ideoutPMve$icle$
2･2実験材料及び実験方法
2‑2･1細胞膜画分の単離
WT及びLPT細胞からの細胞膜画分は､吉田らの方法(吉田,上村1987, Ybshidaetal.1986,%shidaandUemura1986)を若干改良した方法により単
離した｡新鮮重約30gのニンジン培養細胞を､約3倍量(Ⅴ価)の細胞破砕用 緩衝液(0.25Mmannitol,0.1%【w/v]BSA,1.5%【w/v]pvRlmMDTT;2mM EGTA,2mMEDTA‑2Na,25mMpotassiumphosphatebu脆rpH7.8)に懸
濁し､あらかじめ氷冷した乳鉢を用いて､適当量の石英砂を加え氷上で完全に 破砕した｡この細胞破砕液を4重のガーゼで濾過後､濾液を0℃にて13,000×g､
20分間遠心した(①SAKUMA50A‑ⅠⅤ)｡その後､上清を0℃にて170,000×g､
35分間遠心し(②HITACHICP70G)､得られた沈殿は洗浄の為に懸濁液Dl (0.25Msorbitol,1mMDTT,10mMpotassiumphosphatebu鮎rpH7.8)に
テフロンホモジナイザーを用いて懸濁した｡0℃にて170,000×g､35分間の遠心 を行い(②)､沈殿を再び2mlの懸濁液Dlにテフロンホモジナイザーを用いて 懸濁した｡尚､この時点で懸濁液Dlではなく懸濁液C(保存用;0.25Msorbitol, 25mMHEPES,2mMDTT;BTPを加えpH7.2に調整)を用いたものを粗膜
画分とした｡
2mlの懸濁液Dlに懸濁したものを約20ml(25g系)の水性二層分配液 (6.4%【w/v]pEG3350,6.4%【w/v]dextranT‑500,0.25Msorbitol,1mMDTT, 30mMNaCl,10mMpotassiumphosphatebu鮎rpH7.8)に加え､手で反転
して撹拝後､0℃で30分放置してから､0℃にて750×g､4分間遠心した(①)｡
この上層(PEG層)を､新しい分配液の下層(dextran層)のみの溶液に重層 し､再び撹拝して0℃､30分放置後､｡遠心して上層を得た｡もう一度繰り返し､
計3回水性二層分配を行った後､上層を洗浄の為懸濁液C(洗浄用;0.25M､
SOrbitol,25mM HEPES,BTPを加えpH7.2に調整後滅菌フィルターに通し
た)に加え､0℃にて170,000×g､35分間遠心を行った(②)｡この洗浄を60 分でもう一度繰り返し､得られた沈殿を1mlの懸濁液C(保存用)に懸濁して､
これを細胞膜画分とした｡粗膜画分溶液､及び細胞膜画分溶液の保存はエツペ ンドルフチューブに分注後､･80℃で保存した｡
2‑2‑2マーカー酵素活性の測定
単離した細胞膜画分の純度を検定する為に､粗膜画分､細胞膜画分におい て以下のマーカー酵素活性を測定した｡tOtalATPase 活性のうち vanadate･SenSitiveATPase､nitrate･SenSitiveATPase活性を細胞膜マーカー
酵素､液胞膜マーカー酵素とした｡つまり､Vanadate‑SenSitiveATPase活性が PMH+‑ATPase活性に値する｡また､NADHCyt･Creductaseを小胞体膜､Cyt･C oxidaseをミトコンドリア膜のマーカー酵素とした｡
ATPaseの活性は､UemuraandSteponkus(1989)の方法に従い行った｡
(wル)TritonX･100 30plと2.5%(w/v)モリブデン酸アンモニウム 300plの 添加により白濁させ､室温にて20分後660nmの吸光度(HImCHIU･2000)
を測定することにより定量した｡尚､細胞膜マーカーATPase として0.1mM Na･Orthovanadateを､液胞膜マーカーATPaseとして100mMKNO3を終濃度
でそれぞれ添加した｡
antimycinAinsensitiveNADHCytLCreductase､Cyt･COXidaseの活性は､
Uemura and Ybshida(1983)､Ybshida ら(1983)の方法に従い行った｡
antimycinAinsensitiveNADHCyt･Creductaseの活性は､1.5mlの反応系(50
mMpotassiumphosphatebu鮎rpH7.4,405pgoxi･Cyt･ら264pgNaN3,0.1
mMantimycinA)に膜画分溶液を15pl､10mMNADHを50pl加え､550nm
での吸光度変化を追跡することにより測定した｡Cyt･COXidaseの活性は､膜画 分溶液50plに1%(w/v)TritonXrlOOを15pl加え､室温で5分後1.5mlの50
mMpotassiumphosphatebu鮎r(pH7.4)と100plred･Cyt･Cにより､550nm での吸光度変化を追跡することにより測定した｡
2･2‑3タンパク質の定量
タンパク質の定量は､Bradford(1976)の方法に従いBSAを標準タンパ ク質として595nmの吸光度(HITACHIU･2000)を測定して行った｡
2‑2･4totalRNAの単離
totalRNAの単離はacid guanidinium phenoIchloroform(AGPC)法 (ChomczynSkiandSacchi1987)及びNa沈殿(MackeyandChomczynSki
1995)により行った｡･80℃で保存しておいた培養細胞0.5gを､液体窒素で冷
却した乳鉢と乳棒により磨砕し､2.5mlのextraction bu鮎r(50% k/v]
guanidinethiocyanate,25mMNa‑Citrate,5%♭/v]2･merCaPtOethanol,0.5%
k/v]sarkosyl,0.1%b/v]antifoam)に懸濁した｡0.5mlずつ2mlチューブに 分注し､0.05mlの2MNaOAc(pH4.0)と0.5mlのwater･Saturatedphenol
を加えて混合した｡0.25mlのchloroform/isoamylalcohol(24:1)混和物を添加 し､氷上で15分放置後､20,000×g､4℃､15分間遠心した(KUBOTA1720)｡
(以下はRNasefreeで操作)水層0.4mlを1.5mlチューブにとり､0.2mlの 1.2MNaCl､0.8MNa･Citrate混和物と0.2mlのisopropanolを加えて混合し た｡室温で10分放置後､20,000×g､4℃､15分間遠心し沈殿を得た｡75%(Ⅴ/v) EtOHで洗浄後､風乾して20plのRNasefreeH20に60℃で加温して溶解し た｡
2･2‑5RNAの純度及び濃度測定
RNAの純度は､10mMTris･HCl(pH7.5)に希釈して200nm〜310nmを 波長スキャンし､A260:A230=2.2〜2.5:1､A260:A280=1.8〜2.0:1となる時 高純度であると判断した｡また､濃度はH20に希釈後､A260を測定しA260が1 の時40pg/mlであることを利用して算出した｡
て01igo(dT)20Primerを添加し､70℃､10分処理後bu飴r(TOYOBO)､dNTPs (TOYOBO)､RNaseInhibitor(ThKaRa)､reVerSetranSCriptase(TOYOBO) を加えて42℃､60､分;70℃､15分のRT反応を行った｡合成されたsinglestrAnd CDNA(sscDNA)をtemplateとし､Amb軸点由tba血Da(Harperetal.1989)､
ゑamqys(JinandBennetzen1994,P6rez･Casti丘eriaetal.1995)､a:ア甜 Satin(Wadaetal･1992,00kuraetal.1994)､Nh,tib
(Perezetal.1992)の4種類の植物､6種類のPMH･･ATPaseの保存された
アミノ酸配列を元に設計した2組のde･generate Primer:丘rstforward,
5'･GA払/G]GA払/G]AA【c/T]AA【C/T]GCIGGIAA【c/T]GC･3,;secondforward, 5'･GAhJG]GCIGTIGTIATh/C/T]GCIACIGG･3,;firstreverse,5,･TC[G/T]TT･
ITCICC[G/T]TCICCIGTC･3,;second reverse,5,･CCIGCCCAIGGCCAIGG･3,
(Ⅰ:inosine)により丘rst､SeCOndPCRを行った｡得られたcDNA断片をDNA LigationKitⅥr･2(TaKaRa)を用いてpT7BlueT･VeCtOr(Novagen)にTA Cloningし､EcoH(ⅩL･1BlueMRF')(Stratagene)にtransformationした｡
QIAprepSpinMiniprepKit(QIAGEN)によりplasmidを調製し､BigDye Tbrminatorv3･1CycleSequencingKit(AppliedBiosystems)によるdideoxy 法とABIPRISM377DNASequencer(AppliedBiosystems)により塩基配列
を決定して､DNASequencingSoftware(AppliedBiosystems)､BIJASTdata bank及びCLUSTALW(www.genome.ad.jp)により解析を行った｡3,端の塩
基配列は､これにより決定した配列を元にspecificprimerl､2を設計し､01igo (dT)20Primerのadaptor primer とのPCRによる 3,RACE(rapid amplificationofcDNAends)により行った｡5,端の決定もまたRACE法により
行った｡まずspeci丘c primer3によりRT反応を行い､3,側へのdC･tailing反 応をした｡その後､SPeCificprimer4､5とoligo･dGabridgedanchorprimer によるPCR反応により断片を得た｡
2‑2‑7膜貫通領域予測及び系統樹の作製
mucusmmtaH+･ATPase(DcPA)の膜貫通領域予測は､コンピューター アルゴリズムのSOSUI(Hirokawaetal.1998)により行った｡また､推測さ
れるアミノ酸配列孝元にした分子系統樹は､DDBJ(www.ddbj.nig.ac.jp)で公
表されているCLUSTALWプログラムにより作製した｡
2‑2‑8Dcml抗体の作製
DcPAl抗体は､QIAexpress恥peATGKit(QIAGEN)により精製した smal1loop(132aa‑239aa)を抗原として作製した｡forward,5,･GGGG･
CCjmGAAAAACAAAGGTTCTTAGG･3,(下線はjVboIsite);reverse,
5,･GGGAGATCTCTTCTGGAAATGGCCAAC･3,(下線は#IIsite)の2種類
のprimerによりsma11loopの断片を増幅し､肋Ⅰ･邸IIsiteで制限酵素処 理したpQE･60(QIAGEN)に1igationした(Fig.14)｡Eの〟(ⅩL･1BlueMRF') (Stratagene)にtransformation後､QIAprepSpinMiniprepKit(QIAGEN)(A)
PQE･60
(B)
PQ∈‑60
EcoRI/RB$ 〟coI 8amHIβgJⅡ 6×Hiさ
CCATGGGAGGATCCAGATCT
亡CORIJRB$ 〟￠○Ⅰ
句仰
CCATG $ma‖100P A(;ATCT
〃加dⅡ ち