Vancomycin 類とモデル脂質膜の相互作用評価

38

39 0

5000 10000

-100 200 500 800

Response units

Time (s)

0 5000 10000

-100 200 500 800

Response units

Time (s)

0 5000 10000

-100 200 500 800

Response units

Time (s)

0 5000 10000

-100 200 500 800

Response units

Time (s)

0 5000 10000

-100 200 500 800

Response units

Time (s)

0 5000 10000

-100 200 500 800

Response units

Time (s)

V a n -M -02

POPC POPG

ΔN -V a n -M -02 D im e r 1

0 1000 2000

-100 200 500 800

Response units

Time (s)

40 0

5000 10000

-100 200 500 800

Response units

Time (s)

0 5000 10000

-100 200 500 800

Response units

Time (s)

0 5000 10000

-100 200 500 800

Response units

Time (s)

0 5000 10000

-100 200 500 800

Response units

Time (s)

0 5000 10000

-100 200 500 800

Response units

Time (s)

0 5000 10000

-100 200 500 800

Response units

Time (s)

図 13. Van-M-02，N-Van-M-02及 び Dimer 1 の モ デ ル 脂 質 膜 と の 相 互 作 用 セ ン サ ー グ ラ ム

化 合 物 濃 度 : 20-50 M

ラ ン ニ ン グ 緩 衝 液 : 5% DMSO を 含 ん だ 2 倍 濃 度 の PBS

V a n -M -02 ΔN -V a n -M -02

POPG/CL POPE/POPG

D im e r 1

0 1000 2000

-100 200 500 800

Response units

Time (s)

41

表 5に は ， 図 13に 示 し た 7 濃 度 (20 - 50 µM) の vancomycin 類-モ デ ル 脂 質 膜 相 互 作 用 の 結 合 速 度 定 数 及 び 解 離 速 度 定 数 ， 親 和 定 数 を 示 し た ． 繰 り 返 し 測 定 (n = 3) に よ り 算 出 し た 各 パ ラ メ ー タ の 再 現 性 は 良 好 で あ っ た ． セ ン サ ー グ ラ ム の 解 析 に 用 い た 解 析 モ デ ル は ， 抗 菌 薬-脂 質 膜 ま た は ペ プ チ ド-脂 質 膜 な ど に お け る 相 互 作 用 解 析 の こ れ ま で の 報 告 を 基 に two-state reaction model を 選 択

し た 1 4 , 1 7 - 1 9 )． こ の 解 析 モ デ ル は ， 静 電 的 な 相 互 作 用 を 含 む 初 期 の 結 合 親 和 性 ，

本 研 究 で は vancomycin 類 と リ ポ ソ ー ム の 親 水 基 部 分 と の 相 互 作 用 (Step 1，ka 1， kd 1 を 算 出) を 経 て ， 疎 水 的 な 相 互 作 用 に よ る vancomycin 類 の 脂 質 膜 内 へ の 侵 入 (Step 2，ka 2，kd 2を 算 出) を 予 測 し た 解 析 モ デ ル と な っ て い る 5 3 - 5 5 )．

Van-M-02 の グ ラ ム 陽 性 菌 細 胞 膜 を 模 し た POPG 及 び POPG/CL に 対 す る 親 和 定 数 は 哺 乳 動 物 細 胞 膜 を 模 し た POPC 及 び グ ラ ム 陰 性 菌 を 模 し た POPE/POPG に 対 す る 親 和 定 数 よ り も 大 き い こ と が わ か っ た ．こ の こ と は Van-M-02が POPC 及 び POPE/POPG よ り も POPG 及 び POPG/C L に 対 す る 親 和 性 が 強 い と い う こ と を 示 し て い る ．Van-M-02 の POPG 及 び POPG/CL に 対 す る 親 和 性 と POPG 及 び POPG/CL に 対 す る 親 和 性 と の 違 い は ，主 と し て Step 1 の 結 合 速 度 定 数 の 違 い に よ る 影 響 が 大 き い ．ま た ，N-Van-M -0 2の POPG 及 び POPG/CL に 対 す る 親 和 定 数 は POPE/P OPG に 対 す る 親 和 定 数 よ り も 大 き い こ と が わ か っ た ． し か し な が ら ，POPC に 対 す る 親 和 定 数 と 同 程 度 の 値 で あ る こ と が 明 ら か と な っ た ．

Van-M-02及 び N-Van-M-02のPOPE/POPG に 対 す る 親 和 性 はPOPG及 び POPG/CL に 対 す る 親 和 性 よ り も 弱 い こ と が わ か っ た ． Van-M-02 及 び

N-Van-M-02の グ ラ ム 陰 性 菌 へ の 活 性 は 低 い と 考 え て お り ，Van-M-02及 び

N-Van-M-02のPOPE/POPG に 対 す る 親 和 性 が グ ラ ム 陰 性 菌 へ の 抗 菌 活 性 に 関 与 し て い る の か も し れ な い ．

42

表 5. Two-state reaction model (conformation change) 解析により得られた vancomycin, Van-M-02, N-Van-M-02, Dimer 1及びDimer 2 (20 -

50 µM) の モデル脂質膜に対する相互作用における速度論的パラメータ及び親和定数

Compound Lipid type ka1 (1/Ms) kd1 (x10^-2, 1/s) ka2 (x10^-4, 1/s) kd2 (x10^-5. 1/s) K (x10³, 1/M)

Vancomycin

POPC

NC

^a

NC NC NC NC

POPG

NC NC NC NC NC

POPG/CL

NC NC NC NC NC

POPE/POPG

NC NC NC NC NC

Van-M-02

POPC

197 ± 96

^b

10.1 ± 0.8 4.59 ± 1.00 94.2 ± 31.4 3.00 ± 1.30

POPG

977 ± 108 3.28 ± 0.09 1.88 ± 1.00 50.1 ± 13.8 41.3 ± 7.7

POPG/CL

1220 ± 122 2.55 ± 0.02 3.18 ± 0.66 241 ± 63 54.4 ± 4.3

POPE/POPG

176 ± 41 5.95 ± 0.29 7.29 ± 2.09 363 ± 29 3.53 ± 0.66

ΔN-Van-M-02

POPC

424 ± 156 7.45 ± 0.54 11.0 ± 2.8 58.4 ± 20.6 20.9 ± 17.9

POPG

453 ± 64 3.41 ± 0.12 2.85 ± 0.40 213 ± 101 15.6 ± 3.4

POPG/CL

601 ± 60 3.19 ± 0.23 4.70 ± 1.13 351 ± 209 22.1 ± 4.8

POPE/POPG

140 ± 58 5.00 ± 0.13 6.20 ± 0.32 211 ± 38 3.60 ± 1.33

Dimer 1

POPC

1400 ± 221 1.68 ± 0.03 19.2 ± 0.2 163 ± 19 181 ± 18

POPG

611 ± 101 2.19 ± 0.02 15.0 ± 0.5 236 ± 21 45.6 ± 5.5

POPG/CL

875 ± 17 1.12 ± 0.01 3.72 ± 0.92 32.9 ± 4.8 171 ± 39

POPE/POPG

1630 ± 123 1.28 ± 0.22 34.8 ± 7.1 255 ± 62 308 ± 29

Dimer 2

POPC

NC NC NC NC NC

POPG

NC NC NC NC NC

POPG/CL

NC NC NC NC NC

POPE/POPG

NC NC NC NC NC

a Not calculated，^b Mean ± standard deviation (n =3)

42

43

Vancomycin ダ イ マ ー で あ る Dimer 1 は す べ て の モ デ ル 脂 質 膜 に 対 し て ， Van-M-02 及 びN-Van-M-02 よ り も 大 き な 親 和 定 数 を 示 し た ． ま た ，Dimer 1 は す べ て の lipid II 末 端 ジ ペ プ チ ド 類 (D-alanyl-D-alanine, L-alanyl -L-alanine,

D-alan yl-D-lactate, control) に 対 す る 親 和 性 に お い て も Van-M-02 及 び

N-Van-M-02 よ り も 強 い 親 和 性 を 示 し た （ 第 1 章 第 1 節 ）．Dimer 1 は 非 特 異 的 な 結 合 力 が Van-M-0 2及 びN-Van-M-02よ り も 強 い と 示 唆 さ れ る ．Vancomycin ダ イ マ ー で あ る Dimer 2 は モ デ ル 脂 質 膜 に 対 し て 相 互 作 用 が 認 め ら れ な か っ た ． こ の 違 い は Dimer 1 と Dimer 2 の リ ン カ ー 構 造 の 違 い に 影 響 さ れ て い る と 考 え ら れ る ．

ドキュメント内   論文本文   (7.69MB) (ページ 44-49)