Thyroxine とサイロイドホルモン結合タンパク質との結合における

0 75 150

-100 0 100 200 300 400 500

Response units (RU)

Time (s)

0 75 150

-100 0 100 200 300 400 500

Response units (RU)

Time (s)

0 75 150

-100 0 100 200 300 400 500

Response units (RU)

Time (s)

0 75 150

-100 0 100 200 300 400 500

Response units (RU)

Time (s)

0 75 150

-100 0 100 200 300 400 500

Response units (RU)

Time (s)

0 350 700

-100 0 100 200 300 400 500

Response units (RU)

Time (s)

0 75 150

-100 0 100 200 300 400 500

Response units (RU)

Time (s)

0 75 150

-100 0 100 200 300 400 500

Response units (RU)

Time (s)

0 75 150

-100 0 100 200 300 400 500

Response units (RU)

Time (s)

0 75 150

-100 100 300 500

Response units (RU)

Time (s)

0 75 150

-100 0 100 200 300 400 500

Response units (RU)

Time (s)

0 350 700

-100 0 100 200 300 400 500

Response units (RU)

Response units (RU)

Carbamazepine Diclofenac Furosemide

Genistein Ibuprofen Te t r a i o d o t h y r o a c e t i c a c i d

Carbamazepine Diclofenac Furosemide

Genistein Ibuprofen Te t r a i o d o t h y r o a c e t i c a c i d

TTR

TBG

図 21. 薬 剤 の TTR 及 び TBG と の 相 互 作 用 セ ン サ ー グ ラ ム 薬 剤 濃 度 : 0.156-20.0 M

ラ ン ニ ン グ 緩 衝 液 : 100 mM NaCl を 含 ん だ 10 mM リ ン 酸 緩 衝 液

69

T4 と サ イ ロ イ ド ホ ル モ ン 結 合 タ ン パ ク 質 と の 結 合 に お け る diclofenac に よ る 競 合 阻 害 能 評 価 を 実 施 し た ．Murkら は T4 を セ ン サ ー チ ッ プ に 固 定 化 し ，TTR あ る い は TBG と 薬 剤 の 混 合 液 を 添 加 す る こ と に よ っ て 競 合 阻 害 を 評 価 し て い

た ^{8 7 )}． 本 研 究 で は ， 始 め に TTR 及 び TBG を 固 定 化 し た セ ン サ ー チ ッ プ に 試 料

溶 液 中 の 終 濃 度 2.5 M T4と 0, 2.50, 5.00, 10.0 M diclofenac 混 合 液 を 添 加 し ， diclofenac濃 度 が 増 加 す る に 従 っ て T4 の TTR 及 び TBG に 対 す る セ ン サ ー グ ラ ム の レ ス ポ ン ス (RU) が ど の よ う に 変 化 す る か 確 認 し た (図 22)．Diclofenac は T4と TTR と の 結 合 を 競 合 的 に 阻 害 す る こ と が 知 ら れ て い る 7 1 , 7 8 , 8 7 )．そ の た め ， 添 加 す る diclofenac 濃 度 が 増 加 す る に 従 っ て ，TTR に 存 在 す る T4の 結 合 部 位 が 占 有 さ れ る の で ，T4 の TTR に 対 す る セ ン サ ー グ ラ ム の レ ス ポ ン ス が 低 下 す る の で は な い か と 考 え て い た ．し か し な が ら ，実 際 に は diclofenac 濃 度 依 存 的 な ， T4 の TTR に 対 す る セ ン サ ー グ ラ ム の レ ス ポ ン ス 変 化 は 見 ら れ な か っ た (TTR に 対 す る レ ス ポ ン ス : 99 RU [0 M], 99 RU [2.50 M], 101 RU [5.00 M], 110 RU [10.0 M]; TBG に 対 す る レ ス ポ ン ス: 61 RU [0 M], 51 RU [2.50 M], 55 RU [5.00 M], 57 RU [10.0 M])．こ の こ と か ら ，TTR を 固 定 化 し た セ ン サ ー チ ッ プ に T4，diclofenac 混 合 液 の 添 加 で は 競 合 阻 害 を 評 価 す る こ と は で き な い と 判 断 し た ．

0 75 150

-100 0 100 200 300 400 500

Response units (RU)

Time (s)

0 75 150

-100 0 100 200 300 400 500

Response units (RU)

Time (s)

0 M 2 . 5 0 M 5 . 0 0 M 1 0 . 0 M

(A) (B)

5 . 0 0 M 1 0 . 0 M

図 22. T4 と diclofenac混 合 液 の TTR (A) 及 び TBG (B) と の 相 互 作 用 セ ン サ ー グ ラ ム

T4 濃 度 (試 料 溶 液 中 の 終 濃 度) : 2.50 M

Diclofenac 濃 度 (試 料 溶 液 中 の 終 濃 度) : 0, 2.50, 5.00, 10.0 M

ラ ン ニ ン グ 緩 衝 液 : 100 mM NaCl を 含 ん だ 10 mM リ ン 酸 緩 衝 液 (pH 8.5)

70

次 に ，0, 2.50, 5.00, 10.0, 20.0 M diclofenac を 含 ん だ リ ン 酸 緩 衝 液 を ラ ン ニ ン グ 緩 衝 液 と し て 用 い ，TTR あ る い は TBG が 固 定 化 さ れ た セ ン サ ー チ ッ プ に T4 (2.5 M) を 添 加 す る こ と に よ っ て 競 合 阻 害 が 確 認 で き な い か 検 討 し た ．そ の 結 果 ， ラ ン ニ ン グ 緩 衝 液 に 含 ま れ る diclofenac 濃 度 の 増 加 に 伴 っ て ，T4 の TTR に 対 す る セ ン サ ー グ ラ ム の レ ス ポ ン ス が 低 下 す る こ と が わ か っ た (図 23)．一 方 で ，T4 の TBG に 対 す る 相 互 作 用 セ ン サ ー グ ラ ム の レ ス ポ ン ス は ， ラ ン ニ ン グ 緩 衝 液 に 含 ま れ る diclofenac 濃 度 が 増 加 し て も ， 同 程 度 で あ っ た ． こ の 方 法 は diclofenac と 共 存 し た TTR あ る い は TBG の 条 件 を つ く る こ と に よ っ て ， diclofenacに よ る T4 と TTR あ る い は TBG と の 結 合 に お け る 競 合 阻 害 を 模 倣 し て い る と 考 え ら れ る ．

Diclofenac 単 独 に お け る TTR 及 び TBG へ の 親 和 性 結 果 か ら (図 21)，5 M diclofenac添 加 に お け る 相 互 作 用 セ ン サ ー グ ラ ム の レ ス ポ ン ス は 約40 RU (TTR) 及 び 20 RU (TBG) で あ っ た ．ま た ，セ ン サ ー グ ラ ム か ら diclofenacの TTR 及 び TBG と の 複 合 体 の 解 離 が 非 常 に 速 い こ と が 確 認 で き た (RU 値 が 急 速 に 下 が っ

0 75 150

-100 0 100 200 300 400 500

Response units (RU)

Time (s)

0 75 150

-100 0 100 200 300 400 500

Response units (RU)

Time (s)

(A)

(B)

2 . 5 0 M 5 . 0 0 M 1 0 . 0 M 2 0 . 0 M

0 M 2 . 5 0 M 5 . 0 0 M 1 0 . 0 M 2 0 . 0 M

図 23. T4 (+ラ ン ニ ン グ 緩 衝 液 と 同 濃 度 の diclofenac) の TTR (A) 及 び TBG (B) と の 相 互 作 用 セ ン サ ー グ ラ ム

T4 濃 度 (試 料 溶 液 中 の 終 濃 度) : 2.50 M

ラ ン ニ ン グ 緩 衝 液 : 100 mM NaCl 及 び diclofenac (0, 2.50, 5.00, 10.0, 20.0

M) を 含 ん だ 10 mM リ ン 酸 緩 衝 液 (pH 8.5)

71

て い る た め)． 一 方 で ，5 M T4を TTR 及 び TBG に 添 加 し た 時 の 相 互 作 用 セ ン サ ー グ ラ ム の レ ス ポ ン ス は 約60 RU (TTR) 及 び110 RU (TBG) で あ っ た (図20)．

Diclofenac に 対 し て ，T4 で は TTR 及 び TBG に 対 す る 結 合 は 比 較 的 遅 い 解 離 で あ る こ と が 確 認 で き た ． つ ま り ，T4 の TTR 及 び TBG へ の 親 和 性 は diclofenac の TTR 及 び TBG に 対 す る 親 和 性 よ り も 非 常 に 強 い と い う こ と が 示 唆 さ れ る ． T4とdiclofenac混 合 液 の TTRと の 相 互 作 用 セ ン サ ー グ ラ ム の レ ス ポ ン ス が ， T4 単 独 と TTR と の 相 互 作 用 セ ン サ ー グ ラ ム の レ ス ポ ン ス と 同 程 度 で あ っ た の は (図 22)，T4 の TTR に 対 す る 親 和 性 が diclofenac の TTR に 対 す る 親 和 性 に 比 べ て 非 常 に 強 い た め だ と 考 え ら れ る ．Diclofenac を 含 ん だ ラ ン ニ ン グ 緩 衝 液 を 用 い る こ と に よ っ て ，diclofenac 濃 度 依 存 的 に T 4 の TTR に 対 す る セ ン サ ー グ ラ ム の レ ス ポ ン ス が 低 下 す る こ と か ら (図 23)，T4の 競 合 阻 害 を 評 価 す る た め に は ， TTR あ る い は TBG を diclofenac (薬 剤) と 常 に 共 存 さ せ た 条 件 下 に お く 必 要 が あ る と 考 え ら れ る ．

図 24 に は TTR 及 び TBG に 対 す る T4 レ ス ポ ン ス の 減 少 率 と diclofenac 濃 度 と の 関 係 を 示 し た ． ま た ，diclofenac に よ る TTR 及 び TBG に 対 す る T4 レ ス ポ ン ス の 減 少 率 (図 24) か ら ，IC5 0 を 求 め た (表 11)． 算 出 し た IC5 0値 の 再 現 性 は 良 好 で あ っ た (n = 3)．TTR に 対 す る diclofenac の IC5 0値 は 6.4±3.6 M で あ っ た ．一 方 ，TBG に 対 す る diclofenacの IC5 0値 は ，diclofenac濃 度 の 増 加 (2.50 - 20 M) に よ る TBG に 対 す る T4 レ ス ポ ン ス の 減 少 が み ら れ な か っ た の で 20

M 以 上 で あ っ た ．Diclofenac に よ る T4 と TTR と の 結 合 に お け る 競 合 阻 害 の 度 合 い は ，T4 と TBG と の 結 合 に お け る 競 合 阻 害 の 度 合 い よ り も 強 い こ と が 知 ら れ お り 7 1 , 8 7 )， 本 結 果 と 一 致 す る こ と が わ か っ た ．

72

-40.0 -20.0 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0

0 5 10 15 20 25

Decreasing rate (%)

Concentration (M)

-40.0 -20.0 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0

0 5 10 15 20 25

Decreasing rate (%)

Concentration (M)

(A) (B)

図 24. Diclofenac に よ る TTR (A) 及 び TBG (B) に 対 す る T4 レ ス ポ ン ス の 減 少 率 (n = 3)

T4 濃 度 (試 料 溶 液 中 の 終 濃 度) : 2.50 M

ラ ン ニ ン グ 緩 衝 液 : 100 mM NaCl 及 び diclofenac (0, 2.50, 5.00, 10.0, 20.0

M) を 含 ん だ 10 mM リ ン 酸 緩 衝 液 (pH 8.5) 減 少 率 = [T4 レ ス ポ ン ス(RU)]/[ラ ン ニ ン グ 緩 衝 液 に diclofenac を

含 ま な い T4レ ス ポ ン ス(RU)] x 100 [T4 レ ス ポ ン ス(RU)] : Diclofenac (2.50, 5.00, 10.0, 20.0 M) を 含 む ラ ン ニ

ン グ 緩 衝 液 を 用 い て 算 出 し た T4 の TTR あ る い は TBG に 対 す る 相 互 作 用 セ ン サ ー グ ラ ム の レ ス ポ ン ス ．

[ラ ン ニ ン グ 緩 衝 液 に diclofenac を 含 ま な い T4 レ ス ポ ン ス(RU)] : diclofenac を 含 ま な い ラ ン ニ ン グ 緩 衝 液 を 用 い て 算 出 し た T4 の TTR あ る い は TBG に 対 す る 相 互 作 用 セ ン サ ー グ ラ ム の レ ス ポ ン ス ．

73

表 11. Diclofenac に よ る 50 % 阻 害 濃 度 の 算 出 (n = 3) Compound Ligand type IC5 0 M)^a Diclofenac

TTR 6.4 ± 3.6^b

TBG >20

TTR, Transth yretin; TBG, Tyroxine binding globulin

a 50% inhibition concentration

b Mean ± standard deviation (n = 3)

2.5 Th yroxine と サ イ ロ イ ド ホ ル モ ン 結 合 タ ン パ ク 質 と の 結 合 に お け る 薬 剤 に