Thyroxine とサイロイドホルモン結合タンパク質との結合における

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表 11. Diclofenac に よ る 50 % 阻 害 濃 度 の 算 出 (n = 3) Compound Ligand type IC5 0 M)^a Diclofenac

TTR 6.4 ± 3.6^b

TBG >20

TTR, Transth yretin; TBG, Tyroxine binding globulin

a 50% inhibition concentration

b Mean ± standard deviation (n = 3)

2.5 Th yroxine と サ イ ロ イ ド ホ ル モ ン 結 合 タ ン パ ク 質 と の 結 合 に お け る 薬 剤 に

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表 12. Tetraiodothyroacetic acid，diclofenac, genistein，ibuprofen，carbamazepine 及 び furosemide に よ る50 % (あ る い は80%) 阻 害 濃 度 の 算 出 (n = 3)

Ligand type Compound IC5 0 M)^a Literature RP^c TTR Tetraiodothyroacetic acid

<2.5

4.0 (IC8 0, M)^b 1.1 ^{8 7 )}, 11.5 ^{8 9 )} Diclofenac 6.4 0.02 ^{8 7 )}, 0.02 ^{7 1 )}

Genistein 7.9 0.4 ^{8 7 )}

Ibuprofen >20 NC^{d 8 7 )}

Carbamazepine >20 NC ^{8 7 )}

Furosemide >20 NC ^{8 7 )}, NC ^{7 1 )}

TBG Tetraiodothyroacetic acid

<2.5 11 (IC8 0, M)^b

0.6 ^{8 7 )}, 0.4 ^{9 0 )} Diclofenac >20 0.01 ^{8 7 )}, 0.00039 ^{7 1 )}

Genistein >20 NC ^{8 7 )}

Ibuprofen >20 NC ^{8 7 )}

Carbamazepine >20 NC ^{8 7 )}

Furosemide >20 NC ^{8 7 )}, 0.0011 ^{7 1 )} TTR, Transth yretin; TBG, Tyroxine binding globulin

a 50% inhibition concentration

b 80% inhibition concentration

c Relative potency, the reference's number was shown in parentheses

d Not calculated

Genistein に よ る T4 と TTR と の 結 合 に 対 す る IC5 0値 は 7.9 Mで ，T4 と TBG と の 結 合 に 対 す る IC5 0値 は 20 M 以 上 で あ っ た ．Genistein 及 び diclofenac の T4 と TTR と の 結 合 に 対 す る IC5 0値 は tetraiodothyroacetic ac id よ り も 高 い 値 を 示 し た ．RP 値 に お い て も tetraiodothyroacetic acid > genistein，diclofenac と 競 合 阻 害 能 は 同 じ 順 列 を 示 す こ と が わ か っ た ．

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Ibuprofen，carbamazepine 及 び furosemide は T4 と TTR 及 び TBG と の 結 合 に 対 し て 競 合 阻 害 し な い こ と が 知 ら れ て い る 7 1 , 8 7 )． 本 結 果 に お い て も T4と TTR 及 び TBGと の 結 合 に 対 す る IC5 0値 は 20 M以 上 で あ っ た ．こ れ ら の こ と か ら ， 本 評 価 系 結 果 か ら 算 出 さ れ た IC5 0値 が 20 M以 上 の 薬 剤 は T4 の 競 合 阻 害 に よ る 甲 状 腺 毒 性 の 危 険 性 が 少 な い の で は な い か と 考 え ら れ る ．

本 SPR 評 価 系 を 用 い る こ と に よ っ て ， 薬 剤 に よ る T4 と TTR 及 び TBG に 対 す る 競 合 阻 害 能 が 評 価 で き た ．ま た ，T4 と TTR 及 び TBGに 対 す る 競 合 阻 害 の 度 合 い を 評 価 す る こ と に よ っ て ， 薬 剤 に よ る 甲 状 腺 毒 性 能 の 強 弱 が 予 測 で き る の で は な い か と 示 唆 さ れ る ．

76 第 3 項 考 察

TTR 及 び TBG の セ ン サ ー チ ッ プ の 固 定 化 及 び T4 の TTR あ る い は TBG に 対 す る 解 離 定 数 算 出 に お い て ， 良 好 な 再 現 性 が 確 認 で き た (図 20, 表 9, 10)． ま た ，薬 剤 (tetraiodoth yroacetic acid，diclofenac, genistein，ibuprofen，carbamazepine 及 び furosemide) に よ る T4と サ イ ロ イ ド ホ ル モ ン 結 合 タ ン パ ク 質 (TTR, TBG) と の 結 合 に 対 す る 競 合 阻 害 能 を 評 価 す る こ と が で き た (図 23, 24, 表 11, 12)．

本 研 究 で は TTR 及 び TBG の 固 定 化 用 セ ン サ ー チ ッ プ に Sensor Chip CM5 を 用 い ， ア ミ ン カ ッ プ リ ン グ 法 に よ っ て 固 定 化 し た が ， ス ト レ プ ト ア ビ ジ ン が コ ー ト さ れ た Sensor Chip SA を 固 定 化 用 セ ン サ ー チ ッ プ に 用 い て ビ オ チ ン 化 し た TTR を 固 定 化 し た 実 験 も 報 告 さ れ て い る ^{9 1 )}．そ こ で ，実 際 に Sensor Chip SA に ビ オ チ ン 化 TTR を 固 定 化 し ，T4 の ビ オ チ ン 化 TTR に 対 す る 親 和 性 を 評 価 し た (ビ オ チ ン 化 TTR の 固 定 化 量 は 1400 RU 前 後 を 示 し た)．T4 の ビ オ チ ン 化 TTR に 対 す る セ ン サ ー グ ラ ム の レ ス ポ ン ス (RU) は ，Sensor Chip CM5 を 用 い た ア ミ ン カ ッ プ リ ン グ 法 に よ っ て 固 定 化 し た TTR に 対 す る セ ン サ ー グ ラ ム の レ ス ポ ン ス (RU) と 同 程 度 の 値 を 示 し た ． し か し な が ら ，T4 の ビ オ チ ン 化 TTR に 対 す る セ ン サ ー グ ラ ム の レ ス ポ ン ス (RU) に お け る 再 現 性 は ，ア ミ ン カ ッ プ リ ン グ 法 に 比 べ て 低 か っ た の で ，TTR 及 び TBG の 固 定 化 に は Sensor Chip CM5 を 用 い た ， ア ミ ン カ ッ プ リ ン グ 法 を 採 用 し た ．

T4の TTR に 対 す る 解 離 定 数 は 0.003-1.28x10^{- 7} M と い う こ と が 知 ら れ て い る

9 2 )． 本 SPR評 価 系 か ら 得 ら れ た T4 の TTR に 対 す る 解 離 定 数 は 3.55x10^{- 7} M で

あ り ，近 い 値 が 算 出 さ れ て い る ．ま た ，ラ ジ オ イ ム ノ ア ッ セ イ (^{1 2 5}I 標 識 T4) を 用 い て 算 出 し た T4 の TBG に 対 す る 解 離 定 数 は 0.37x10^{- 7} M と い う こ と が 知 ら れ て お り ^{9 3 )}，本 評 価 系 か ら 得 ら れ た T4の TBG に 対 す る 解 離 定 数 (3.76x10^{- 7} M) と 同 程 度 の 値 が 算 出 さ れ て い る ．

T4と TTRあ る い は TBGに 対 す る 薬 剤 の 競 合 阻 害 能 を IC5 0あ る い IC8 0と し て 求 め ， 薬 剤 の 競 合 阻 害 能 の 強 弱 が 評 価 で き た ． ま た ， 既 報 の 論 文 か ら 得 ら れ た 薬 剤 の 阻 害 活 性 能 は SPR に お け る 評 価 結 果 と ほ ぼ 同 等 で あ っ た ． 薬 剤 に よ る T4 と サ イ ロ キ シ ン 結 合 タ ン パ ク 質 と の 結 合 に 対 す る 競 合 阻 害 は ，TBG よ り も TTR の 方 が 起 こ り や す い と い う 結 果 が 得 ら れ た (表 12)．T4 の TTR に 対 す る 親 和 性 に お け る kd値 は ，T4の TBG に 対 す る 親 和 性 に お け る kd値 よ り も 高 い こ と

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が わ か っ て お り (表 10)，T4-TTR 複 合 体 を 維 持 し に く い こ と が ， 薬 剤 の T4 と TTRと の 結 合 に 対 す る 競 合 阻 害 が T4と TBGと の 結 合 に 対 す る 競 合 阻 害 よ り も 起 こ り や す い 原 因 の 一 つ な の か も し れ な い ． ま た ， 本 結 果 か ら ラ ッ ト で は genistein及 び diclofenacに よ っ て T4と TTR と の 結 合 が 阻 害 さ れ 血 中 の T4ク リ ア ラ ン ス の 亢 進 が 引 き 起 こ さ れ る と 予 想 さ れ る が ， ヒ ト で は T4 は 主 に TBG と 結 合 す る た め ，genistein及 び diclofenac に よ る 血 中 の T4ク リ ア ラ ン ス の 亢 進 は 引 き 起 こ さ れ な い の で は な い か と 考 え ら れ る ．

本 SPR評 価 系 は TTR と TBG の 阻 害 程 度 の 違 い か ら 甲 状 腺 毒 性 に お け る 種 差 を 推 測 で き る ほ か ， 薬 剤 の 甲 状 腺 毒 性 を 予 測 で き る 評 価 系 と し て 幅 広 く 応 用 で き る こ と が 期 待 さ れ る ．

78 第 4 項 小 括

SPRを 用 い て ，TTR及 び TBG の セ ン サ ー チ ッ プ の 固 定 化 及 び T4の TTR あ る い は TBG に 対 す る 解 離 定 数 算 出 に お い て ， 良 好 な 再 現 性 が 確 認 で き た ． ま た ， 薬 剤 (tetraiodothyroacetic acid，diclofenac, genistein，ibuprofen，carbamazepine 及 び furosemide) に よ る T4と サ イ ロ イ ド ホ ル モ ン 結 合 タ ン パ ク 質 (TTR, TBG) と の 結 合 に 対 す る 競 合 阻 害 能 を 評 価 す る 分 析 法 を 構 築 す る こ と が で き た ． さ ら に SPR を 用 い て ，T4 と TTR あ る い は TBG に 対 す る 薬 剤 の 競 合 阻 害 能 を IC5 0

あ る い IC8 0と し て 求 め ，薬 剤 の 競 合 阻 害 能 の 強 弱 が 評 価 で き た ． ま た ，既 報 の 論 文 か ら 得 ら れ た 薬 剤 の 阻 害 活 性 能 はSPRに お け る 評 価 結 果 と ほ ぼ 同 等 で あ っ た ． 本 SP R評 価 系 は TTR と TBG の 阻 害 程 度 の 違 い か ら 甲 状 腺 毒 性 に お け る 種 差 を 推 測 で き る ほ か ， 薬 剤 の 甲 状 腺 毒 性 を 予 測 で き る 評 価 系 と し て 幅 広 く 応 用 で き る こ と が 期 待 さ れ る ．

79 総 括

SPRを 利 用 し た 分 子 間 相 互 作 用 解 析 装 置 を 用 い て ，抗 菌 薬 の lipid II へ の 結 合 特 性 評 価 を 目 的 に ，vancomycin と そ の 類 似 化 合 物 の lipid II 末 端 ジ ペ プ チ ド リ ガ ン ド 類 (D-alanyl -D-alanine や D-alanyl -D-lactate な ど) に 対 す る 親 和 性 評 価 系 を 構 築 し た ．ま た ，teicoplanin, erythromycin 及 び linezolidの lipid II 末 端 ジ ペ プ チ ド リ ガ ン ド 類 へ の 親 和 性 並 び に 結 合 選 択 性 を 評 価 し ， 以 下 の 知 見 を 得 た ．

1) Vancomycin の lipid II 末 端 ジ ペ プ チ ド リ ガ ン ド 類 に 対 す る 結 合 選 択 性 を 評 価 し た 結 果 ，D-alanyl -D-alanine リ ガ ン ド に 選 択 的 な 結 合 を 示 し た ．

2) Lipid II 末 端 ジ ペ プ チ ド リ ガ ン ド 類 の セ ン サ ー チ ッ プ へ の 固 定 化 及 び 評 価 し た 抗 菌 化 合 物 の lipid II に 対 す る 結 合 定 数 算 出 に お い て ，良 好 な 再 現 性 を 確 認 で き た ．

3) Vancomycin モ ノ マ ー の 結 合 定 数 と MIC 値 を 比 較 し た と こ ろ ，ほ ぼ 符 合 す る 結 果 が 得 ら れ る こ と が わ か っ た ．

4) Teicoplanin, erythromycin 及 び linezolidの ジ ペ プ チ ド リ ガ ン ド 類 へ の 親 和 性 を 評 価 し た 結 果 ， teicoplanin の み が D-alan yl -D-alanine 及 び

D-alan yl -D-lactate リ ガ ン ド に 選 択 的 な 結 合 を 示 し ， 本 SPR 評 価 法 で は 抗 菌 薬 が 有 す る 薬 効 メ カ ニ ズ ム に 基 づ き リ ガ ン ド に 親 和 性 を 示 し て い る こ と が 認 め ら れ た ．

抗 菌 薬 の 脂 質 膜 へ の 結 合 特 性 評 価 を 目 的 に ，vancomycin及 び そ の 類 似 化 合 物 ， teicoplanin, erythro mycin 並 び に linezolid の モ デ ル 脂 質 膜 （ 哺 乳 動 物 細 胞 膜 ， グ ラ ム 陽 性 及 び 陰 性 菌 細 胞 膜 ） に 対 す る 親 和 性 を 評 価 し た ． 得 ら れ た 知 見 を 以 下 に 示 す ．

1) Vancomycin，teicoplanin，erythromycin 及 び linezolidは 脂 質 膜 を 標 的 と し

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た 抗 菌 薬 で は な く ， い ず れ の モ デ ル 脂 質 膜 に 対 し て も 親 和 性 を 示 さ な か っ た こ と か ら ，本 SPR 測 定 法 の 抗 菌 薬 に 対 す る 脂 質 膜 親 和 選 択 性 が 確 認 で き た ．

2) モ デ ル 脂 質 膜 へ の 親 和 性 が 認 め ら れ た Van-M-02，N-Van-M-0 2 及 び Dimer 1 の モ デ ル 脂 質 膜 に 対 す る 親 和 定 数 算 出 に お い て ，良 好 な 再 現 性 を 確 認 で き た ．

3) Van-M-02，N-Van-M-02 及 び Dimer 1 に お い て ，SPR に よ る モ デ ル 脂 質 膜 に 対 す る 親 和 性 結 果 と MIC 値 か ら ，こ れ ら の 化 合 物 の 特 徴 を 考 察 す る こ と が で き た ．

Daptomycin の 細 菌 細 胞 膜 結 合 特 性 評 価 を 目 的 に ，daptomycin の モ デ ル 脂 質 膜

（ 哺 乳 動 物 細 胞 膜 ， グ ラ ム 陽 性 及 び 陰 性 菌 細 胞 膜 ） に 対 す る 親 和 性 評 価 系 を 構 築 し た ． ま た ，daptomycinの 脂 質 膜 へ の 結 合 選 択 性 な ど を 検 討 し ， 以 下 の 知 見 を 得 た ．

1) Daptomycin の モ デ ル 脂 質 膜 選 択 性 を 評 価 し た 結 果 ，哺 乳 動 物 細 胞 膜 及 び グ ラ ム 陰 性 菌 細 胞 膜 に 比 べ ， グ ラ ム 陽 性 菌 細 胞 膜 に 対 し て 非 常 に 強 い 親 和 性 を 示 し た ．

2) Daptomycinの グ ラ ム 陽 性 菌 細 胞 膜 へ の 親 和 性 は カ ル シ ウ ム 濃 度 依 存 的 で あ り ， カ ル シ ウ ム 存 在 下 で の み ， 脂 質 膜 へ の 結 合 が 認 め ら れ た ．

3) モ デ ル 脂 質 膜 の セ ン サ ー チ ッ プ へ の 固 定 化 及 び daptomycinの グ ラ ム 陽 性 菌 細 胞 膜 に 対 す る 親 和 定 数 算 出 に お い て ， 良 好 な 再 現 性 を 確 認 で き た ．

薬 剤 に お け る 甲 状 腺 毒 性 の 予 測 評 価 を 目 的 に ，薬 剤 に よ る T4の TTR/TBG と の 結 合 に 対 す る 競 合 阻 害 能 を 評 価 す る 分 析 法 を 構 築 し た ． 得 ら れ た 知 見 を 以 下 に 示 す ．

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1) TTRあ る い は TBGの セ ン サ ー チ ッ プ へ の 固 定 化 及 び T4のTTR あ る い は TBG に 対 す る 解 離 定 数 算 出 に お い て ， 良 好 な 再 現 性 が 確 認 で き た ．

2) T4 の TTR あ る い は T BG へ の 結 合 に 対 す る ，薬 剤 の 競 合 阻 害 能 を IC5 0あ る い は IC8 0と し て 求 め ， そ の 強 弱 を 定 量 的 に 評 価 で き た ． ま た ， 既 報 の 論 文 か ら 得 ら れ た 薬 剤 の 阻 害 活 性 能 は SPRに お け る 評 価 結 果 と ほ ぼ 同 等 で あ っ た ．

3) 本 SPR 評 価 系 は TTR と TBG の 阻 害 程 度 の 違 い か ら 甲 状 腺 毒 性 に お け る 種 差 を 推 測 で き る ほ か ， 薬 剤 の 甲 状 腺 毒 性 を 予 測 で き る 評 価 系 と し て 幅 広 く 応 用 で き る こ と が 期 待 さ れ る ．

本 研 究 で は ，SPR 技 術 を 用 い て 薬 剤 の 標 的 細 菌 あ る い は 結 合 タ ン パ ク 質 へ の 結 合 特 性 を 評 価 す る こ と が で き た ．本 SPR 評 価 系 は 他 の 薬 剤 に 対 す る 結 合 選 択 性 ， 薬 効 メ カ ニ ズ ム 及 び 毒 性 に 関 わ る 評 価 な ど に も 幅 広 く 応 用 で き る こ と が 期 待 さ れ る ．SP R法 は 分 子 間 相 互 作 用 に お け る 結 合 速 度 定 数 及 び 解 離 速 度 定 数 を 短 時 間 で 算 出 で き ， し か も 少 量 の 試 料 で 高 感 度 に 親 和 性 評 価 を 実 施 で き る こ と が 他 の 技 術 と 比 較 し て 大 き な 利 点 で あ る と い え る ． 正 確 で 安 定 し た in vitro 評 価 系 を 用 い て ， 薬 剤 の 薬 効 や 毒 性 に 関 す る 情 報 及 び 種 差 の 影 響 な ど を 予 測 す る こ と が で き れ ば ， 薬 剤 の 上 市 ま で の 成 功 確 率 を 向 上 さ せ る こ と が で き ， 薬 剤 が 患 者 に 渡 る ま で の 期 間 を 短 縮 さ せ る こ と が で き る ． よ り 発 展 的 な 薬 剤 の 評 価 系 を 構 築 す る こ と が ， 多 く の 患 者 を 救 う こ と に つ な が る と 期 待 し て い る ．