Daptomycin とグラム陽性菌細胞膜モデルの相互作用評価

図 17 (A) 及 び 図 1 7 (B) に は ， セ ン サ ー チ ッ プ に 固 定 化 し た POPG 及 び POPG/CLに 対 す る daptomycin の 相 互 作 用 測 定 結 果 の セ ン サ ー グ ラ ム を 示 し た ． 添 加 し た daptomycin 濃 度 の 増 加 に 伴 い セ ン サ ー グ ラ ム の レ ス ポ ン ス が 上 昇 し て い る こ と が 確 認 で き た ．こ れ ら の セ ン サ ー グ ラ ム か ら daptomycinと モ デ ル 脂 質 膜 間 の 相 互 作 用 が 飽 和 状 態 に 達 し て い な い こ と が わ か っ た ．

-100 200 500 800

-100 2000 4000

Response units

Time (s) (1) (2) (4) (3)

図 16. Daptomycin の モ デ ル 脂 質 膜 と の 相 互 作 用 セ ン サ ー グ ラ ム（(1)，POPG;

(2)，POPG/CL; (3), POPE/POPG; (4), POPC） Daptomycin 濃 度 : 50 M

ラ ン ニ ン グ 緩 衝 液 : 50 mg/L CaCl2を 含 ん だ 0.5 倍 濃 度 の PBS

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表 7に は ，図 17 に 示 し た 6 濃 度 (8.3 - 50 µM) の daptomycin -モ デ ル 脂 質 膜 相 互 作 用 の 結 合 速 度 定 数 ， 解 離 速 度 定 数 及 び 親 和 定 数 を 示 し た ． 繰 り 返 し 測 定 (n = 3) に よ り 算 出 し た 各 パ ラ メ ー タ の 再 現 性 は 良 好 で あ っ た ．セ ン サ ー グ ラ ム の 解 析 に 用 い た 解 析 モ デ ル は ， 第 1 章 第 2 節 と 同 様 に ， 抗 菌 薬-脂 質 膜 ま た は ペ プ チ ド-脂 質 膜 な ど に お け る 相 互 作 用 解 析 の こ れ ま で の 報 告 を 基 に two -state reaction modelを 選 択 し た 3 3 - 3 5 )．

表 7. Two-state reaction model (conformation change) 解 析 に よ り 得 ら れ た daptomycin (8.3 - 50 µM) の グ ラ ム 陽 性 菌 細 胞 膜 モ デ ル に 対 す る 相 互 作 用 に お け る 速 度 論 的 パ ラ メ ー タ 及 び 親 和 定 数

Lipid type

k_{a 1} k_{d 1} k_{a 2} k_{d 2} K

(1/Ms) (×10^{- 3}, 1/s) (×10^{- 4}, 1/s) (×10^{- 4}, 1/s) (×10⁶, 1/M) POP G 1290 ± 500^a 0.569 ± 0.117 18.3 ± 5.1 7.33 ± 3.29 8.05 ± 1.58 POP G/C L 2770 ± 1660 1.85 ± 1.14 26.8 ± 12.0 9.08 ± 5.00 6.13 ± 1.33 a. Mean ± standard deviation (n =3)

Running buffer: 50 mg/L CaCl2を 含 ん だ 0.5 倍 濃 度 の PBS

-100 200 500 800

-100 2000 4000

Response units

Time (s)

-100 200 500 800

-100 2000 4000

Response units

Time (s)

(A) (B)

図17. Daptomycinの グ ラ ム 陽 性 菌 細 胞 膜 モ デ ル と の 相 互 作 用 セ ン サ ー グ ラ ム

（(A)，POPG; (B)，POPG/CL）

Daptomycin 濃 度 : 8.3-50 M (8.3, 13, 17, 25, 33, 50 M) ラ ン ニ ン グ 緩 衝 液 : 50 mg/L CaCl2を 含 ん だ 0.5 倍 濃 度 の PBS

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Daptomycin の POPG/CL に 対 す る 親 和 定 数 は POPG に 対 す る 親 和 定 数 よ り も 少 し 高 い こ と が わ か っ た ． こ の 親 和 性 の 違 い は ，Step 1 の 結 合 速 度 定 数 の 違 い に よ る 影 響 が 最 も 大 き い ．POPG の kd 1値 が POPG/CL の kd 1値 に 比 べ て 低 い と い う こ と は ，daptomycin の POPG か ら の 解 離 が POPG/CL か ら の 解 離 よ り も 遅 い と い う こ と を 示 し て い る ． ま た ，daptomycin は POPG へ の 親 和 性 よ り も C L に 対 す る 親 和 性 の 方 が 弱 い と い う こ と が 考 え ら れ る ．

図 18 (A) 及 び 図 18 (B) に は ，50 mg/L CaCl2を 含 ま な い ラ ン ニ ン グ 緩 衝 液 を 用 い て ，POPG 及 び P OPG/CL に 対 す る daptomycin の 相 互 作 用 を 測 定 し た 結 果 の セ ン サ ー グ ラ ム を 示 し た ．添 加 し た daptomycin 濃 度 の 増 加 に 伴 い セ ン サ ー グ ラ ム の レ ス ポ ン ス が 上 昇 し て い る こ と が 確 認 で き た ． こ れ ら の セ ン サ ー グ ラ ム か ら daptomycin と モ デ ル 脂 質 膜 間 の 相 互 作 用 が 飽 和 状 態 に 達 し て い な い こ と が わ か っ た ．サ ン プ ル 注 入 間 に お い て daptomycin は 脂 質 膜 と の 結 合 が 確 認 で き た ． し か し ， サ ン プ ル 注 入 が 終 了 す る と ，CaCl2 を 含 む ラ ン ニ ン グ 緩 衝 液 を 使 用 し た 時 と 比 較 し て （ 図 17），daptomycin の 脂 質 膜 か ら の 速 い 解 離 が 認 め ら れ た ．

-100 200 500 800

-100 2000 4000

Response units

Time (s)

-100 200 500 800

-100 2000 4000

Response units

Time (s)

(A) (B)

図18. Daptomycinの グ ラ ム 陽 性 菌 細 胞 膜 モ デ ル と の 相 互 作 用 セ ン サ ー グ ラ ム

（(A)，POPG; (B)，POPG/CL）

Daptomycin 濃 度 : 8.3-50 M (8.3, 13, 17, 25, 33, 50 M)

ラ ン ニ ン グ 緩 衝 液 : 50 mg/L CaCl2を 含 ま な い 0.5 倍 濃 度 の PBS

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表 8に は ，図 18 に 示 し た 6 濃 度 (8.3 - 50 µM) の daptomycin-モ デ ル 脂 質 膜 相 互 作 用 の 結 合 速 度 定 数 ，解 離 速 度 定 数 及 び 親 和 定 数 を 示 し た ．Daptomycin の 脂 質 膜 モ デ ル に 対 す る 親 和 定 数 は ，CaCl2 を 含 む ラ ン ニ ン グ 緩 衝 液 を 使 用 し た 時 の 親 和 定 数 と 比 較 し て 低 い こ と が わ か っ た ．特 に POPG の K 値 は カ ル シ ウ ム 存 在 下 に お け る POPG の K 値 と 比 較 し て ，1/4 の 低 下 が 認 め ら れ た ． こ の 2 つ の 測 定 条 件 で 得 ら れ た 親 和 定 数 の 違 い は ，Step 1 の 結 合 速 度 定 数 の 違 い に よ る 影 響 が 最 も 大 き い ．カ ル シ ウ ム が 存 在 し て い な い 条 件 下 で の POPG 及 び POPG/CL に 対 す る kd 1値 が ， カ ル シ ウ ム 存 在 下 で の P OPG 及 び POPG/CL に 対 す る kd 1値 よ り も 高 い と い う こ と は ， カ ル シ ウ ム が 存 在 し て い な い 条 件 下 で は daptomycin が POPG 及 び POPG/CL か ら 速 く 解 離 し て い る こ と を 意 味 し て い る ． こ れ ら の 結 果 か ら ，daptomycin が 脂 質 膜 へ の 結 合 を 維 持 す る た め に は カ ル シ ウ ム が 必 要 で あ る と い う こ と が わ か っ た ．

表 8. Two-state reaction model (conformation change) 解 析 に よ り 得 ら れ た daptomycin (8.3 -50 µM) の グ ラ ム 陽 性 菌 細 胞 膜 モ デ ル に 対 す る 相 互 作 用 に お け る 速 度 論 的 パ ラ メ ー タ 及 び 親 和 定 数

Lipid type

k_{a 1} k_{d 1} k_{a 2} k_{d 2} K

(1/Ms) (×10^{- 3}, 1/s) (×10^{- 4}, 1/s) (×10^{- 4}, 1/s) (×10⁶, 1/M)

POP G 5970 16.2 81.3 22.6 1.89

POP G/C L^a 9920 10.6 30.3 10.1 3.76

Running buffer: 0.5倍 濃 度 の PBS

57 第 3 項 考 察

Daptomycin に お け る 哺 乳 動 物 細 胞 膜 ，グ ラ ム 陽 性 菌 細 胞 膜 及 び グ ラ ム 陰 性 菌 細 胞 膜 を 模 し た モ デ ル 脂 質 膜 に 対 す る 相 互 作 用 の 速 度 論 的 パ ラ メ ー タ を 算 出 す る こ と が で き た （ 図 17, 18, 表 7, 8）． ま た ，daptomycin の グ ラ ム 陽 性 菌 細 胞 膜 モ デ ル に 対 す る 結 合 特 性 を 相 互 作 用 の 観 点 か ら 示 す こ と が で き た （ 図 1 5 , 1 6）．

す な わ ち ，daptomycin の グ ラ ム 陽 性 菌 細 胞 膜 モ デ ル に 対 す る 親 和 性 は 哺 乳 動 物 細 胞 膜 及 び グ ラ ム 陰 性 菌 細 胞 膜 モ デ ル に 対 す る 親 和 性 よ り 強 い こ と が わ か っ た ． 前 節 で 論 じ た よ う に ，vancomycin，teicoplanin，erythromycin 及 び linezolid は い ず れ の モ デ ル 脂 質 膜 に 対 し て も 親 和 性 を 示 さ ず ， こ れ ら の 抗 菌 薬 が 細 菌 細 胞 膜 相 互 作 用 に 寄 与 し な い 薬 効 メ カ ニ ズ ム に 基 づ く 事 実 と 符 合 す る 結 果 が 得 ら れ て い る（ 第 1章 第 2節 ）．Daptomycinの モ デ ル 脂 質 膜 に 対 す る 親 和 性 か ら も ，本 SPR測 定 法 に よ っ て 得 ら れ る 脂 質 膜 へ の 選 択 性 か ら ， 抗 菌 薬 の 作 用 メ カ ニ ズ ム を 予 測 す る こ と が 可 能 で あ る と 考 え ら れ る ．

Daptomycin が グ ラ ム 陽 性 菌 細 胞 膜 に 結 合 し 抗 菌 活 性 を 示 す た め に は ，カ ル シ ウ ム の 存 在 が 必 要 で あ る こ と が 知 ら れ て い る ^{3 3 )}．Daptomycinの カ ル シ ウ ム を 介 し た 脂 質 膜 へ の 親 和 性 は 薬 理 活 性 に 関 係 し て い る の で ， 重 要 な フ ァ ク タ ー の 1 つ と し て 考 え ら れ る ． こ れ ま で に ，daptomycinの 脂 質 膜 へ の 相 互 作 用 メ カ ニ ズ ム 及 び カ ル シ ウ ム の 役 割 に つ い て は ， 円 偏 光 二 色 性 ス ペ ク ト ル 測 定 ， 蛍 光 分 光 法 ， 示 差 走 査 熱 量 測 定 ， 核 磁 気 共 鳴 法 ， 蛍 光 共 鳴 エ ネ ル ギ ー 移 動 な ど 様 々 な 分 析 技 術 を 用 い て 調 べ ら れ て い る 3 1 , 6 6 , 6 7 )．本 研 究 に お い て も ，SP R 技 術 を 用 い て ， daptomycin の グ ラ ム 陽 性 菌 細 胞 膜 モ デ ル へ の 親 和 性 が カ ル シ ウ ム 濃 度 依 存 的 で あ り ， カ ル シ ウ ム 存 在 下 で の み ， 脂 質 膜 へ の 結 合 が 認 め ら れ る こ と が 確 認 で き た （ 図 14）．

本 研 究 は daptomycin の 脂 質 膜 親 和 性 に 対 す る 選 択 性 を SPR で 評 価 で き た 初 め て の 例 で あ る ．ま た ，本 SPR 評 価 系 は 他 の 抗 菌 薬 の 脂 質 膜 親 和 性 評 価 に も 応 用 で き る こ と が 期 待 さ れ る ．

58 第 4 項 小 括

SPRを 用 い て ，daptomycin に お け る 哺 乳 動 物 細 胞 膜 ， グ ラ ム 陽 性 菌 細 胞 膜 及 び グ ラ ム 陰 性 菌 細 胞 膜 を 模 し た モ デ ル 脂 質 膜 に 対 す る 相 互 作 用 の 速 度 論 的 パ ラ メ ー タ を 算 出 す る こ と が で き た ． ま た ，daptomycin の グ ラ ム 陽 性 菌 細 胞 膜 モ デ ル に 対 す る 結 合 特 性 を 相 互 作 用 の 観 点 か ら 示 す こ と が で き た ． す な わ ち ， daptomycin の グ ラ ム 陽 性 菌 細 胞 膜 モ デ ル に 対 す る 親 和 性 は 哺 乳 動 物 細 胞 膜 及 び グ ラ ム 陰 性 菌 細 胞 膜 モ デ ル に 対 す る 親 和 性 よ り 強 い こ と が わ か っ た ． ま た ， カ ル シ ウ ム 存 在 下 に お け る daptomycin の 脂 質 膜 選 択 性 を 明 ら か に す る こ と が で き た ．Daptomycin の グ ラ ム 陽 性 菌 細 胞 膜 モ デ ル へ の 親 和 性 は カ ル シ ウ ム 濃 度 依 存 的 で あ り ， カ ル シ ウ ム 存 在 下 で の み ， 脂 質 膜 へ の 結 合 が 認 め ら れ た ． 本 研 究 は ，daptomycin の 脂 質 膜 親 和 性 に 対 す る 選 択 性 を SPRで 評 価 で き た 初 め て の 例 で あ る ．ま た ，本 SPR 評 価 系 は 他 の 抗 菌 薬 の 脂 質 膜 親 和 性 評 価 に も 応 用 で き る こ と が 期 待 さ れ る ．

59

第 2 章 表 面 プ ラ ズ モ ン 共 鳴 法 を 用 い た thyroxine の タ ン パ ク 結 合 に 対