USP5 ノックダウン RBL-2H3 細胞における TNF-α 放出及び

Vialinin AのRBL-2H3細胞内標的分子がUSP5であり、vialinin AはUSP5に酵 素活性阻害を有することから、vialinin Aの有する強力なTNF-α産生阻害活性は USP5 の酵素活性の阻害を介して発現すると予想された。そこで、USP5 ノック

ダウンRBL-2H3細胞を調製し、USP5の発現減少がTNF-α産生に与える影響に

ついて検討を行った。Vialinin A標的分子のUSP5及びvialinin Aにより強力な酵 素活性の阻害が認められた USP4 及び USP5 とドメイン構造の類似している

USP13 についてノックダウン細胞を調製することとした。トランスフェクショ

ン試薬Lipofectamine RNAiMAXを用いて、設計したそれぞれの2重鎖siRNAを

細胞内に導入し、ノックダウンさせた細胞を抗体感作、抗原処理を行い、細胞 上清サンプルと細胞サンプルを得た。細胞サンプルから、RNAを抽出し、逆転 写にてcDNAを合成後、リアルタイムPCR法にてそれぞれの脱ユビキチン化酵 素と内部標準のGAPDHの発現量を測定した。USP5 siRNA1及びUSP5 siRNA2 を処理したサンプルでは、Non-target siRNAを処理した Cont.に比較し、有意に 発現量の減少が認められたが、USP5 siRNA3を処理したサンプルでは発現の減 少が見られなかった。また、USP4 siRNA1及びUSP4 siRNA2、USP13 siRNA1、

USP13 siRNA2を処理したサンプルでCont. siRNA処理と比較し、mRNAレベル

において、有意な発現減少が見られた (Figure 3-4)。さらに、タンパク質レベル でも有意な発現減少が観察された (Figure 3-5)。この細胞を用いて、TNF-αの細 胞外への放出量をELISA法にて測定した。USP4及び USP13をノックダウンさ せた細胞からのTNF-α放出量は、Cont.細胞と比較し変化がみられなかったのに 対し、USP5 をノックダウンさせた細胞からの TNF-α 放出は有意に減少した

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(Figure 3-6)。さらに、USP5ノックダウン細胞からのTNF-αの細胞外への放出量

が有意に減少したことから、TNF-α 産生量について検討することとした。ここ での産生量とは、細胞外に放出されたTNF-αと細胞内に残存するTNF-αの和で 示した。USP5 ノックダウン細胞における TNF-α 産生量は、Cont.と比較し有意 な減少が観察された (Figure 3-7)。また、TNF-α mRNAレベルについても検討し たところ、有意な減少が観察された (Figure 3-8)。TNF-αと同じ炎症性サイトカ イン IL-4 及び脱顆粒の指標である β-hexosaminidase の放出量の減少は観察され なかった (Figure 3-9, Figure 3-10)。このRNA干渉の実験においての細胞毒性は、

LDH の細胞外への放出を検討することで評価し、細胞毒性が認められないこと が観察された (Figure 3-11)。

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Figure 3-4 Expression of USPs mRNA in USPs siRNA knockdown cells.

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Figure 3-5 Expression of protein levels of USPs in USPs siRNA knockdown cells.

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Figure 3-6 TNF-α release from USPs siRNA-knockdown cells.

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Figure 3-7 TNF-α production from USP5 siRNA-knockdown cells.

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Figure 3-8 Expression of TNF-α mRNA in USP5 siRNA-knockdown cells.

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Figure 3-9 IL-4 release from USPs siRNA-knockdown cells.

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Figure 3-10 Effect on β-hexosaminidase release from USPs siRNA-knockdown cells.

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Figure 3-11 Cell viability for USPs siRNA-knockdown cells.

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