第二章 Vialinin A 標的分子の探索
第六節 実験の部
6-1. TNF-α放出阻害活性試験
6-1-1. TNF-α放出阻害活性試験サンプル調製
3.0×105 cells/mL になるように 10%FBS-DMEMで調製した RBL-2H3 細胞を 1 mLずつ24穴プレートに分注した。さらに各wellに30 ng/mLになるように調製 した Monoclonal anti-DNP IgE 抗体 を加 え 、37°C、16 時間 感 作した 。2％
FBS-DMEMに溶解した各サンプルを加え、15分間前培養した。その後、抗原と
してDNP-BSAを10 µg/mLとなるように加え、37℃でCO2インキュベーター内
にて 3 時間培養した。その後、培養上清を回収し、それを細胞培養上清サンプ ルとした。
6-1-2. TNF-α放出量及び産生量の定量
RBL-2H3細胞に発現したTNF-αの定量には、rat TNF-α Quantikine ELISA kit
(R&D systems) を用い、添付のプロトコールに従い、測定を行った。あらかじめ
TNF-α抗体が塗布してある96穴マイクロプレートにassay buffer 50 µLと測定す
るサンプル50 µLを入れ、室温で2時間静置した。Wash bufferで5回各wellを 洗浄し、HRP-conjugated anti-TNF-αを100 µL加え、室温で2時間静置した。そ の後、発色基質を100µL加え、30分後に反応停止薬としてstop solution 100 µL を加えた。反応停止後、OD450 nmを測定し、付属されているスタンダードを用い て定量した。
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6-2. FDMTsのRBL-2H3細胞内の局在性の検討
6-2-1. FDMTsを用いたRBL-2H3細胞への取り込み実験
T-25 cm2フラスコにRBL-2H3細胞を2.0×106 cells/mLになるように培養し、
そこに10% FBS-DMEMで希釈した100 µM FDMTsをそれぞれ添加し、15分間
処理した。処理後、PBSで2回洗浄し、10% FBS-DMEMをPBSで置換し、蛍光
顕微鏡OLIMPUS IX70で観察した。FDMTsの蛍光発色団であるクマリニル基は
励起波長360 nm、蛍光波長420 nmを持つため、ブルーライトバンドパスフィル
ターを介することにより、クマリニル基の蛍光を観察した。
PBS
PBS tablets (sigma) 1 tablets
Sterilized water 200 mL
Total 200 mL
6-2-2. 培養液添加時のFDMTsの状態
RBL-2H3 細胞内に蛍光発色が確認できなかった FDMT-1 及び FDMT-2、蛍光
発色の弱かったFDMT-3について、培養液中のそれぞれのFDMTsの状態につい て検討した。FDMT-1及びFDMT-2、FDMT-3を処理した培養液をTLC板に塗布 し展開した。展開されたTLC板にUV: 254 nmを照射し、現れるスポットを観察 した。
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6-3. FDMTsによるRBL-2H3細胞内分子への結合実験
6-3-1. サンプル調製
RBL-2H3細胞へのFDMTs結合実験を、intactな細胞にFDMTsを処理した実験
と細胞破砕し細胞内分子を抽出したものにFDMTsを処理した実験の2種類の方 法で検討した。
A). 破砕処理前処理
T-25 cm2フラスコに2.0×105 cells/mLになるように調製したRBL-2H3細胞に 30 ng/mLになるようにmoclonal anti-DNP IgE抗体を加え、37°C、16時間感作し
た。次に100 µM FDMTsをそれぞれ加え15分間処理し、細胞内結合分子と結合
させた。そこに抗原としてDNP-BSAを加え、3時間刺激した。そして、PBSで 2回洗浄後、0.2% tritonX-100-PBSを添加し、細胞を破砕した。そこに等量のsample
bufferを加え、サンプルとした。
B). 破砕処理後処理
T-25 cm2フラスコに2.0×105 cells/mLになるように調製したRBL-2H3細胞に 30 ng/mLのmonoclonal anti DNP IgE抗体を加え、37℃、16時間感作した。そこ に抗原としてDNP-BSAを加え、3時間刺激した。そして、PBSで2回洗浄後、
0.2% tritonX-100-PBSを添加し、細胞を破砕した。そこに、100 µM FDMTsを添
加し、15分間処理し、細胞内結合分子にFDMTsをそれぞれ結合させた。そこに
等量のsample bufferを加え、サンプルとした。
53 0.2% TritonX-100-PBS
PBS tablets 1 tablet
Sterilized water 200 mL
TritonX-100 400 µL
Total 200 mL
Sample buffer
0.5 M Tris-HCl (pH6.8) 2.5 mL
10% SDS 4.0 mL
2-Mercaptoethanol 1.0 mL
Glycerol 2.0 mL
0.05% BPB 0.2 mL
Total 10 mL
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6-3-2. ポリアクリルアミド電気泳動
Sodium dodecyl sulfate- poly acrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) は、
Stacking gel (濃縮ゲル) 及びrunning gel (分離ゲル) の2層ゲルを用いて行った。
分離ゲルはアクリルアミド濃度を 12%で調製した。濃縮ゲルの各ウェルにサン プル20 µL、rainbow marker 5 µLずつ分注し、PAGERUN (ATTO) を用いて120 分、20 mAにて電気泳動を行った。泳動後、ゲルをfluorophorestar 3000 (anatech) を用いて、UVで励起し、FDMTsの染色を観察した。
Stacking gel
0.5 M Tris-HCl (pH6.8) 1.5 mL 2.9% acrylamide-1.0% Bis 0.6 mL
10% SDS 0.12 mL
TEMED 7 µL
10% APS 20 µL
Total 5 mL
55 Running gel
0.75 M Tris-HCl (pH8.8) 10 mL 2.9% acrylamide-0.5% Bis 8.0 mL
10% SDS 0.4 mL
TEMED 20 µL
10% APS 150 µL
Total 20 mL
Running buffer
Tris 3.0 g
Glycine 14.4 g
10% SDS 5.0 mL
Total 500 mL
56 6-4. Vialinin A標的分子の探索研究
6-4-1. RBL-2H3細胞内分子の抽出
RBL-2H3細胞の細胞質画分は、Dignamの改良法にて分画を行った。RBL-2H3
細胞を 200×g、5 分の条件で遠心分離することでペレットの状態にし培養液を
取り除いた。そこに2倍量のbuffer Aを添加し懸濁し、20分間氷上に静置した。
そして、0.05%になるように NP-40を添加し、ボルテックスミキサーで 10秒間 撹拌することで細胞膜を破砕した。抽出物を20,000×g、4°C、5分の条件で遠心 分離を行い、可溶化画分を分取した。その後、NP-40の濃度が0.01%になるよう
にbuffer Bで希釈し、buffer Cで4°C、3時間、透析を行った。透析後のサンプ
ルを10倍に希釈し、20,000×g、4°C、30分の条件で遠心分離を行い、その可溶 化画分を細胞質画分とした。タンパク質濃度を、Bradford reagent (sigma) を用い て測定した (Scheme 2-1)。
57 RBL-2H3 cells
←buffer A (on ice, 20 min)
←0.05% NP-40 (vortex, 10 sec)
(Centrifugation, 4°C, 20,000 x g, 5 min) Collected supernatants
←buffer B (5-fold) (Dialyze, 4°C, 3 h)
←buffer B (10-fold)
(Centrifugation, 4°C, 20,000 x g, 30 min) Collected supernatants
Cytoplasmic extracts
Scheme 2-1 Preparation of cytoplasmic extracts from RBL2H3 cells.
58 Buffer A
10 mM HEPES (pH7.9) 10 mM KCl
0.1 mM EDTA 1 mM DTT
0.5 mM PMSF
Buffer B
20 mM HEPES (pH7.9) 100 mM KCl
0.2 mM EDTA 10%(v/v) glycerol
1 mM DTT 0.2 mM PMSF
Buffer C
20 mM HEPES (pH7.9) 100 mM KCl
0.2 mM EDTA 10%(v/v) Glycerol 0.1% Triton X-100 1 mM DTT 0.2 mM PMSF
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6-4-2. Biotin標識化プローブを用いたRBL-2H3細胞内標的分子の単離
RBL-2H3 細胞内標的分子の探索には、有機合成した 2 種の biotin プローブ
(biotin-DMT、biotin-phenol) を用いた。2 mg/mL RBL-2H3細胞細胞質画分にそれ ぞれ100 µM biotin-DMT及び100 µM biotin-phenol、vehicleとして使用したDMSO を添加し、4°C で 1 時間撹拌した。非結合分子を取り除いた後、Streptavidin sepharose resin (GE Healthcare) を添加し、4°Cで15分間反応させた。resinを取
り除き、SDS-PAGE sample bufferにて結合分子を溶出させた。溶出液をSDS-PAGE
に供し、Instant Blue染色にて結合分子を染色した。
6-4-3. MALDI-TOFMSサンプル作成
Biotin-DMT を 用 い た ア フ ィ ニ テ ィ ー ク ロ マ ト よ り 溶 出 さ れ た 分 子 を
SDS-PAGE に供し、染色されたバンドを切り出した。切り出したゲルは、既存
のプロトコールに従い、脱色、還元、アルキル化、脱水、膨潤、乾燥を行った。
その後、トリプシン消化を行い、アセトニトリルでペプチドを抽出後、濃縮し た (Scheme 2-2)。
60 Clipped gel
←50% methanol (65°C, 15 min, 4 times; decoloration)
←6 M guanidine hydrochloride, 10 mM DTT, 100 mM ammonium bicarbonate (15 min; reduction)
←6 M guanidine hydrochloride, 500 mM acrylamide, 100 mM ammonium bicarbonate (15 min; alkylation)
←50% methanol 10% acetate (10 min, 3times; wash)
←50% acetonitrile (10 min; anhydration)
←100% acetonitrile (10 min; anhydration)
←50 mM ammonium bicarbonate (10 min; swelling)
←100% acetonitrile (10 min; anhydrration)
←50 mM ammonium bicarbonate (10 min; swelling)
←50% acetonitrile/50 mM ammonium bicarbonate (10 min; anhydration)
←100% acetonitrile (10 min; anhydration) (centrifugal concentration)
←10 ng/µL trypsine (gel digestion)
←50 mM ammonium bicarbonate (37°, overnight; digestion)
←50% acetonitrile (sonication, 15 min; extraction)
←100% acetonitrile (sonication, 15 min; extraction) (centrifugal concentration)
Peptide sample for MALDI-TOFMS
Scheme 2-2 Preparation of peptide sample
61
6-4-4. PMF解析による標的分子の同定
濃縮した標的分子ペプチドサンプル及び2種混合スタンダード※1をマトリッ クスα-Cyano-4-hydroxycinnamic acidと混合し、MALDI-TOFMSに供した。標的 分子のpeptide mass fingerprint (PMF) 解析はMALDI-TOFMS AXIMA Performance を用いて以下の設定で行った。
※1
2種混合スタンダード
ProteoMass Brdykinin Fragment 1-7 MALDI-MS Standard (SIGMA) ProteoMass P14R MALDI-MS Standard (SIGMA)
MALDI-TOFMS AXIMA Performance Sample plate: 384-wells plates
Turning mode: Reflectron Mass range: 1.0-3,000 Max Laser Rap Rate: 20 Power: 50
Shots: 5 Profiles: 200
Ion Gate: Blank, 700
Pulsed Extraction optimized at (Da) : 1500
62 Peak Processing
Peak width: 20
Smoothing methods: off Threshold Offset: 0.1-1.0 mV
Mascot Search Server Search Engine: PMF Data Base: NCBI
Taxonomy: Rattus norvegicus Digest Enzyme: Trypsin Missed Cleavages: 1
Fixed modification: Carbamidomethyl Variable Modifications: Oxidation (M) Treat Masses as: Monoisotopic
Mass Type: MH+ Mass List: 1,000-3,000
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6-6. Biotin-DMTに対するDMT及びvialinin A、Ubの競合試験
競合試験には、有機合成したbiotin-DMT及びDMT、vialinin Aと大腸菌を用 いて大量発現させたrecombinant human USP5 (rhUSP5)、市販のUbを使用した。
10 µM Biotin-DMTとそれぞれの濃度 (5 µM及び10 µM、20 µM、50 µM) に調整 したvialinin A及びDMTを1.6 µg/mL rhUSP5に添加し、その混合物を4°Cで1 時間撹拌した。また、biotin-DMTに対するUbの競合試験においても同様の方法 で処理を行った。その後、ストレプトアビジンビーズを添加し、4°C、15分間撹 拌した。非結合分子を洗浄した後、biotin-DMTに結合したrhUSP5を溶出させ、
SDS-PAGEで展開し、InstantBlue染色にて可視化させた。
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