Figure 2-3. Chromatogram (HPLC) of the amino acids (mixed standard solution).
38 2.5.5.
エタノール定量と同じ機器・測定方法を用いて、香気成分を定量した。ただし、内部標 準として終濃度100 mg/Lのn-アミルアルコールと終濃度10 mg/Lのカプロン酸メチル を用いた。限外ろ過した各培養液180 µLと、内部標準液 (1000 mg/Lのn-アミルアルコ ール溶液と 100 mg/L のカプロン酸メチル溶液) 20 µL とを混ぜた溶液をサンプルとし た。各香気成分の混合標準液を用いて作成した検量線より、サンプルの香気成分濃度を 計算した。
同定・定量する香気成分として、アルコール・アルデヒド系 (アセトアルデヒド、n-プ ロピルアルコール、イソブチルアルコール、イソアミルアルコール、2-フェニルエチル アルコール) の香気成分と、エステル系 (酢酸エチル、ダイアセチル、酢酸イソアミル、
カプロン酸エチル、酢酸2-フェニルエチル) の香気成分を用いた。
アルコール・アルデヒド系の香気成分各1000 mgとエステル系の香気成分各100 mgと をエタノール100 mLに溶かし、さらに水で10倍希釈し、香気成分混合標準液とした。
検量線の作成には、この混合標準液と、混合標準液を 10% v/v エタノール水溶液で 10 倍、50倍、100倍、200倍に希釈した溶液とを用いた。アルコール・アルデヒド系の内 部標準としてn-アミルアルコールを、エステル系の内部標準としてカプロン酸メチルを 用いた。n-アミルアルコール1000 mgとカプロン酸メチル100 mgとをエタノール 100 mLに溶かし、さらに水で10倍希釈し、内部標準液とした。各希釈倍率の香気成分混合
標準液900 µLと、内部標準液100 µLとを混ぜ、この溶液1 µLをGCに注入した。混
合標準液と内部標準液との濃度比を横軸に、ピーク面積比を縦軸にとって検量線を作成 した。
39
香気成分のクロマトグラムをFigure 2-4に示す。Figure 2-4における、アルコール・アル デヒド系の香気成分の濃度は100 mg/L、エステル系の香気成分の濃度は 10 mg/L であ る。ダイアセチル以外のピークの分離度は1.5以上であった。
AcetA
EtAc
EtOH
DA nPrOH
iBuOH
iAmAc
MeCap iAmOH
EtCap nAmOH
2-PEA 2-PE
-1000 2000 5000 8000 11000 14000 17000
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
µV
Time (min)
Figure 2-4. Chromatogram (GC-FID) of the volatile aroma compounds (mixed standard solution and internal standard (IS) solution): AcetA, acetaldehyde; EtAc, ethyl acetate; EtOH, ethanol;
DA, diacetyl; nPrOH, n-propyl alcohol (1-propanol); iBuOH, isobutyl alcohol (2-methyl-1-propanol); iAmAc, isoamyl acetate (3-methylbutyl acetate); MeCap (IS), methyl caproate;
iAmOH, isoamyl alcohol (3-methyl-1-butanol); EtCap, ethyl caproate; nAmOH (IS), n-amyl alcohol (1-pentanol); 2-PEA, 2-phenylethyl acetate; 2-PE, 2-phenylethyl alcohol.
40 2.5.6.
抗酸化能の評価には、2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル (DPPH) 法を用いた (Brand-Williams, Cuvelier, & Berset, 1995; Chua, Lu, & Liu, 2018; Jaworska et al., 2011)。濃
度0.2 mMのDPPHをエタノールを用いて調製した。抗酸化能における標準物質として、
トロロックス (Trolox, 6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸) を用 いた。50% v/vエタノール溶液で調製した、0, 100, 200, 300, 400, 500 µMのトロロックス 標準液を用いて検量線を作成した。濃度 0 mM には、トロロックス標準液の代わりに
50% v/vエタノール溶液を用いた。各濃度のトロロックス溶液100 µL、0.1 M Tris-HClバ
ッファー (pH 7.4) 400 µL、0.2 mM DPPH 500 µLを混合し、暗所、室温で30分間反応さ せた。なお、0.1 M Tris-HClバッファーの調製方法は以下である：トリスヒドロキシメ チルアミノメタン (Tris) 2.42 gを水に溶かし、6 M塩酸水溶液でpH 7.4に調整し、200 mLにメスアップした。30分後、分光光度計を用いて波長517 nmにおける吸光度を測 定した。トロロックス濃度0 mMの時の吸光度 (A0 mM) を基準とし、各トロロックス濃 度における吸光度 (Ax mM) の阻害率 (%) を、式 (2-16) を用いて計算した。
阻害率 (%) = ((𝐴0 mM− 𝐴x mM) 𝐴⁄ 0 mM) × 100 (2-16)
トロロックスの濃度を横軸に、吸光度の阻害率を縦軸にとって検量線を作成した。この 検量線より、活性酸素種を阻害するトロロックスの 50%阻害濃度 (IC50T) を計算した。
次に、発酵前後のサンプルをそれぞれ、50% v/v エタノール溶液で総量200 µL となる ように10倍、20倍、30倍、40倍希釈し、上記と同じ条件でDPPHと反応させた。な お、希釈した各サンプル200 µLのうち100 µLをDPPHと混合した。残りの100 µLを DPPH の代わりにエタノールと混合することでブランクとした。式 (2-16) の各トロロ ックス濃度における吸光度 (Ax mM) を、各希釈倍率のサンプルにおける吸光度からブラ ンクを引いた値に置換して阻害率を計算し、得られた検量線から同じように活性酸素種 を阻害するサンプルの IC50Sを計算した。式 (2-17) を用いて、サンプルのIC50Sをトロ ロックス当量 (µmol TE/100 mL) に変換し、サンプルの抗酸化能とした。
抗酸化能 (µmol TE 100 mL⁄ ) = IC50T× (200 IC⁄ 50S) × (100 1000⁄ ) (2-17)
41 2.5.7.
残存タンパク質の確認には、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳 動 (SDS-PAGE) を用いた。
サンプル5 µLと変性剤5 µLとを混合し、5分間煮沸した。変性剤の調製方法は以下で ある：1.0 M Tris-HCl (pH 6.8) 30 mL、SDS 5.0 g、2-メルカプトエタノール10 mL、グリ
セロール20 mL、ブロモフェノールブルー0.15 gを混合し、水で100 ｍLにメスアップ
した。
分離ゲル (アクリルアミド濃度 13%) の作製方法は以下である：30%アクリルアミド 4300 µL、1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) 2500 µL、10% SDS 100 µL、10% 過硫酸アンモニウム
100 µL、テトラメチルエチレンジアミン4 µL、水2900 µLを混合し、ゲルスラブ用ガラ
ス板対に注入した。水飽和n-ブタノールをゲルに重層し、ゲルが固化するまで静置した。
水飽和n-ブタノールを水で洗い流した後、濃縮ゲル (組成：30%アクリルアミド500 µL、
0.5 M Tris-HCl (pH 6.8) 700 µL、10% SDS 30 µL、10% 過硫酸アンモニウム20 µL、テト ラメチルエチレンジアミン3 µL、水1750 µL) を分離ゲルに重層し、コームを差し込み、
同様にゲルが固化するまで静置した。
固化したゲルからコームを抜き、ゲルを水で洗浄した。AE-6530Mラピダス・ミニスラ ブ電気泳動槽 (ATTO Co., Tokyo, Japan) に泳動バッファーを入れ、洗浄したゲルを取り 付けた。泳動バッファーの調製方法は以下である：Tris 30.3 g、グリシン 143.1 g、SDS
10.0 gを水に溶かし、水で1 Lにメスアップしたものを水で10倍希釈した。ゲルが浸る
まで泳動バッファーをさらに加えた。水で 20 倍希釈した分子量マーカー (Protein Molecular Weight Marker (Broad); Takara Bio Inc., Shiga, Japan) 8 µLと、変性させたサンプ
ル5 µLとをそれぞれ、ゲルのウェルに入れた。泳動槽を電気泳動用電源装置AE-8135
マイパワーⅡ 300 (ATTO Co.,) に接続し、電圧300 V、ゲル1枚あたりの電流30 mAで、
ブロモフェノールブルーがゲルの下部に移動するまで約60分間電気泳動した。
42
泳動終了後、ゲルをガラス板から外し、水で十分に洗浄した。洗浄後のゲルをクマシー ブリリアントブルー (CBB) 溶液に浸し、電子レンジで加熱した後、5 分間振とうして 染色した。CBB溶液の調製方法は以下である：CBB G250 200 mgをエタノール100 mL に溶かし、リン酸170 mLを加え、水で2 Lにメスアップした。染色後、ゲルを水で十 分に洗浄して電子レンジで加熱することを繰り返し、脱色した。
43
3.
3.1.
ホエイ (RW) または脱塩ホエイ (DMW) を原料とした発酵飲料の写真を Figure 3-1 に 示す。写真左側に示したRWの発酵産物は濁っていたが、写真右側に示したDMWの発 酵産物は上清が透き通っていた。DMWの発酵中、3日程度でDMW溶液に沈殿が生じ、
上清が透明な黄色になった。一方で、RW溶液中のタンパク質は沈殿せず、溶液は発酵 終了後も濁ったままであった。
DMW溶液においては、エタノール濃度の上昇またはpHの低下にともなって、DMW溶 液中のタンパク質が変性・沈殿したと考えた。RWとDMWの大きな違いはミネラル濃 度であることから、タンパク質の安定性には、エタノール濃度の上昇やpHの低下だけ でなく、ミネラル濃度やその他の要因も関わっていることが示唆された。