左端ビオチン化・右端ジゴキシゲニン化 λDNA 及び

作製

ここでは、左端ビオチン化・右端ジゴキシゲニン化λDNA (F-λDNA) の作製の 手順を述べる。なお、試薬調製表6-1、6-2には、左端ビオチン化・右端ジゴキシゲ ニン化SV40ori-λDNA (F-SV40ori-λDNA) の試薬の調製手順を記載した。

1. 0.6 mLのマイクロチューブ内にて、40 µgのλDNA (15 µgのSV40ori-λDNA)、 400 pmolのビオチン化合成オリゴヌクレオチドForward 1、400 pmolのビオ チン化合成オリゴヌクレオチドForward 2を加えて調製した (全量155 µL)。

[試薬調製表6-1]

Sample Vol. (µL) 投入量

440 ng/µL λDNA 90 - 40 µg 50 ng/µL SV40ori-λDNA - 151 15 µg

200 pmol/µL Forward 1 2 2 400 pmol

Oligonucleotides Sequences of oligonucleotides Forward 1 5’-Biotin-GTACTCCAGACTTAGAAGATGAT-3’

Forward 2 5’P-AGGTCGCCGCCCATCTTCTAAGTCTGGAGTAC-TEG-Biotin-3’

Reverse 1 5’-Biotin-CGTAGTGTCCTATCT-3’

Reverse 2 5’P-GGGCGGCGACCTAGATAGGACACTACG-TEG-Biotin-3’

200 pmol/µL Forward 2 2 2 400 pmol 滅菌水 Up to 155 µL

2. λDNA (SV40ori-λDNA) のコンカテマー形成を防ぐために、実験操作１の調製 溶液を含む0.6 mLのマイクロチューブを恒温槽 (HB-100、TAITEC) 上で65℃、

5分間加熱処理し、その後、氷上で急冷した。

3. 実験操作2の0.6 mLのマイクロチューブにT4 DNAリガーゼ (TaKaRa) 付属 の10 x Ligation buffer (TaKaRa) を1 x Ligation bufferとなるよう加えた後、

さらに2,450 UのT4 DNAリガーゼ (350 U/µL、TaKaRa) を加え、恒温槽上 で16℃、5時間、インキュベートした (全量180 µL)。

4. T4 DNA リガーゼを失活させるために、実験操作 3 の調製溶液を含む 0.6 mL のマイクロチューブを恒温槽上で65℃、5 分間インキュベートした後、室温に て自然冷却した。

5. ４本のマイクロスピンカラムS-400 (GE Healthcare) を準備した。3,000 r.p.m.、 1 分間に卓上遠心機を設定し、マイクロスピンカラム S-400 を遠心することに よってマイクロスピンカラムS-400内の内容液を除去した。

6. ２本のマイクロスピンカラムS-400 に実験操作 4の DNA溶液を半量ずつ (90 µL) 加え、3,000 r.p.m.、2分間に卓上遠心機を設定し、マイクロスピンカラム

S-400を遠心することによって調製DNAを精製した。その後、精製DNA溶液

を残りの２本のマイクロスピンカラムS-400に移し、再度3,000 r.p.m.、2分間 に卓上遠心機を設定した後、マイクロスピンカラム S-400 を遠心することによ ってDNAを再度精製した。

7. 新たな1.5 mLのマイクロチューブに精製した左端ビオチン化λDNA (左端ビオ チン化SV40ori-λDNA) を含む溶液をまとめた。

8. 0.6 mL のマイクロチューブ内にて、左端ビオチン化 λDNA (左端ビオチン化 SV40ori-λDNA)、5 UのKlenow Fragments (3’-5’ Exo-)、100 pmolのdATP、 dGTP、dCTP、ジゴキシゲニン-11-dUTP (Roche Diagnostics、Indianapolis、 IN、USA) を含む緩衝液 (1 x 2 NEBuffer [50 mM NaCl、10 mM Tris–HCl pH 7.9、10 mM MgCl2、1 mM DDT]) を調製し、恒温槽上で37℃、12時間、イ ンキュベートした (全量180 µL)。

[試薬調製表6-2]

Sample Vol. (µL) 投入量

10 x 2 NEBuffer 18 18 1 x 2 NEBuffer 100 pmol/µL dATP 1 1 100 pmol 100 pmol/µL dGTP 1 1 100 pmol 100 pmol/µL dCTP 1 1 100 pmol 100 pmol/µL ジゴキシゲニン-11-dUTP 1 1 100 pmol

2.5 U/µL Klenow fragment (3’-5’Exo–) 2 2 5 U 左端ビオチン化λDNA 156 - 40 µg 左端ビオチン化SV40ori-λDNA - 156 15 µg

全量 180 180 -

9. Klenow Fragments (3’-5’ Exo–) を失活させるために、実験操作8 の調製溶液 を含む0.6 mLのマイクロチューブを恒温槽上で70℃、10分間インキュベート した後、室温まで自然冷却した。

10. ４本のマイクロスピンカラムS-400を準備した。3,000 r.p.m.、1分間に卓上遠 心機を設定し、マイクロスピンカラム S-400 を遠心することによってマイクロ スピンカラムS-400内の内容液を除去した。

11. ２本のマイクロスピンカラムS-400 に実験操作 9の DNA溶液を半量ずつ (90 µL) 加えて、3,000 r.p.m.、2分間に卓上遠心機を設定し、マイクロスピンカラ

ムS-400を遠心することによって調製DNAを精製した。その後、精製DNA溶

液を残りの２本のマイクロスピンカラムS-400に移し、3,000 r.p.m.、2分間に 卓上遠心機を設定した後、マイクロスピンカラム S-400 を遠心することによっ てDNAを再度精製した。

12. 左端ビオチン化・右端ジゴキシゲニン化λDNA (F-λDNA) 溶液の濃度は分光光 度計 (UVmini-1240、Shimadzu) を用いることによって吸光度を計測した後、

新たな0.6 mLのマイクロチューブ内に20 µLごとに分注した。

13. 左端ビオチン化・右端ジゴキシゲニン化SV40ori-λDNA (F-SV40ori-λDNA) の 作製も同様な手順で調製した。