T7 Exo を短時間ないし連続的に供給したときの

た。図5-3Bは本実験にて用いた微細流路装置を示す。DNA分解反応の間、T7 Exo を含まない緩衝液の供給から10分間までは、λDNAのdsDNA領域の長さが自由端 から徐々に減少した。一方、その10分間以降では、λDNAのdsDNA領域の長さの 減少が停止した (図5-7A)。以上の結果、T7 Exoを含まない緩衝液の供給から10分 間までは、DNAに結合したT7 ExoがdsDNA領域を分解し、それ以降ではT7 Exo がDNAから解離した可能性が高い。その結果、10分間以降ではDNAのdsDNA領 域の長さの変化が見られなかったと考えられる (図5-7B)。

図5-7. T7 Exoを短時間、供給した実験でのDNA分解反応の直接観察とそのときのDNA分解 反応時間あたりのT7 Exoが分解したdsDNA領域の長さとその塩基数 流路内に3分間T7 Exo を含む緩衝液を供給した後、40分間T7 Exoを含まない緩衝液を供給した。T7 ExoによるDNA 分解反応は伸長したλDNAのdsDNA領域の長さ情報をもとに解析され、DNAのdsDNA領域 はSYTOX Orangeによって蛍光染色された。

A T7 Exoが分解したλDNA４分子のdsDNA領域の直接観察した連続画像 白矢印：λDNAのdsDNA領域の固定端

白三角：λDNAのdsDNA領域の自由端 黒線：10 µmのスケールバー

B DNA分解反応時間あたりのT7 Exoが分解したλDNA４分子のdsDNA領域の長さとその 塩基数

白四角：T7 Exoが分解したA-1のλDNAのdsDNA領域の長さとその塩基数 白丸：T7 Exoが分解したA-2のλDNAのdsDNA領域の長さとその塩基数 白三角：T7 Exoが分解したA-3のλDNAのdsDNA領域の長さとその塩基数 白ダイヤ：T7 Exoが分解したA-4のλDNAのdsDNA領域の長さとその塩基数

さらに、本実験ではT7 Exoを連続的に供給した実験でのDNA分解反応の直接 観察した。図 5-3C は本実験にて用いた微細流路装置を示す。T7 Exo による DNA 分解反応の間、λDNAのdsDNA領域の長さは自由端から減少し、その減少の間、5

0 3000 6000 9000

0 1 2 3

-5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

分解 DN A の長さ

DNA分解反応時間 [分]

分解 DN A の塩基数

[µm] [塩基]

1 )  2 ) 3 ) 4 )

B

分間から15分間程度の一時的なλDNAのdsDNA領域の長さの減少が停止した (図 5-8A)。T7 Exoを短時間、供給したときのDNA分解反応の実験結果、DNA分解反 応の間のλDNAのdsDNA 領域の長さの減少の停止はDNAからT7 Exo が解離す る可能性が示唆されたことから、この一時的な停止はT7 ExoがDNAから解離した 可能性が考えられる。これらの実験結果から、T7 Exo が DNA の自由端に結合し、

自由端からDNAを分解することによってDNAが徐々に短くなり、さらにT7 Exo が解離することによってDNAの分解が停止したというT7 Exoが他のT7 Exoに入 れ替わることによる DNA 分解反応の素反応が連続的に繰り返されていることが強 く示唆された (図5-8B)。上記に述べたように、エキソヌクレアーゼによるDNA分 解反応産物をゲル電気泳動法によって得られる結果では、DNA分解反応の素反応や その中間過程が覆い隠されてしまい、DNAを分解するエキソヌクレアーゼの動的挙 動を明らかにすることができなかった。一方、本研究は１分子レベルでの蛍光観察 によってエキソヌクレアーゼによる DNA 分解反応の素反応やその中間過程やエキ ソヌクレアーゼ１分子の動的挙動を明らかにすることができた。しかしながら、さ らなるより詳細な T7 Exo１分子の動態特性を解析するためには、蛍光標識した T7 Exoを用いることによる解析が必要である。

図5-8. T7 Exoを連続的に供給した実験でのDNA分解反応の直接観察とそのときのDNA分解 反応時間あたりのT7 Exoが分解したdsDNA領域の長さとその塩基数 T7 ExoによるDNA分 解反応は伸長したλDNAのdsDNA領域の長さ情報をもとに解析され、DNAのdsDNA領域は SYTOX Orangeによって染色された。

A T7 Exoが分解したλDNA４分子のdsDNA領域の直接観察した連続画像 白矢印：λDNAのdsDNA領域の固定端

白三角：λDNAのdsDNA領域の自由端 黒線：10 µmのスケールバー

B DNA分解反応時間あたりのT7 Exoが分解したλDNA４分子のdsDNA領域の長さとその 塩基数

黒四角：T7 Exoが分解したA-1のλDNAのdsDNA領域の長さとその塩基数 黒丸：T7 Exoが分解したA-2のλDNAのdsDNA領域の長さとその塩基数 黒三角：T7 Exoが分解したA-3のλDNAのdsDNA領域の長さとその塩基数 黒ダイヤ：T7 Exoが分解したA-4のλDNAのdsDNA領域の長さとその塩基数

0 5000 10000 15000

0 1.5 3 4.5

-5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

DNA分解反応時間 [分]

分解 DN A の長さ 分解 DN A の塩基数

[µm] [塩基]

1 )  2 ) 3 ) 4 )

B