6 5 4 3 2
1
O
ARSA − SUMF1 一
十 十十
58HP
十 十十
（B）
︵∈一〇∈ε﹀＝﹀一百Qの江く
10000 8000 6000 4000 2000 0
5．0 7．O
pH
9．0
Figure 4・12． Arylsulfatase activity of ARSA−FLAG in medium．
（A）The activity of O．4％of the total medium was measured at pH 5．O−8．5 using O．5 mM 4−MUS as a substrate．（B）The pH dependence of arylsulfatase activities． All activities calculated based on use of 20％of the total medium．（B）The pH dependence of arylsulfatase activities． All activities were calculated based on use of 20qo of total medium．
（A）
︵C＼る∈⊂︶≧≧8の﹃＜ 200 t60 120 80 40
O
ARSl ARSI−C93S
pH 5．0
SUMF1 一
十 十
十一十 十十 ︵∈δ∈⊂︶﹀↑≧8の江く 140 120 100 80 60 40 20
O
ARSl ARSI−C93S − SUMF1 一
十 十 十一十 十十
︵ξ一〇∈⊂︶﹀＝≧↑O雨の﹃＜ 70 60 50 40 30 20 10
O
ARSl 一
pH 7．4
．「一．A・
一一 一一．．・
一w」．．一一一
@
ARSI−C93S − SUMF1 一
十 十
十一十 十十 ξ一〇⊆；≧8の﹃互 50 40 30 20 10
O
ARSI
pH 8．5
ARSI−C93S − SUMF1 一
十 十
十一十 十十
（B） 140
A
120E
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7P OH
8．0 9．0Figure 4−13． Arylsulfatase activity of conditioned medium．
（A）Arylsulfatase activity of ARSI−FLAG． The activity of 20％of the total medium was measured at pH 5．0−8．5 using 5 mM 4−MUS as a substrate． Columns give the means of three independent experiments． Bars indicate standard deviations．（B）The pH dependence of arylsulfatase activities． The mean of triplicates was plotted． The arylsulfatase activity of
ARSI−FLAG activated with SUMFI−FLAG was estimated by subtracting the endogenous activity from the cells coexpressing ARSI−FLAG and SUMF1−FLAG（designated by f川ed
circles）．
第五章
網膜色素変性症患者における
arylsulfatase I遺伝子の変異探索
5．1緒言
遺伝性疾患の原因は遺伝子の異常である。効率よく遺伝子の変異を検出する方法は種々開発 されており、single strand conformation polymorphism（SSCP）法や、 TaqMan⑧のようなオリゴヌク レオチドを利用したタイピング法、DNAマイクロアレイによるハイブリダイゼーション法等が ある。近年は高性能なシーケンサーの開発により全ゲノム解析も可能となってきたが、まずは 疾患に関与すると考えられる遺伝子座を一塩基多型（single nucleotide polymorphisms；SNPs）の
ようなゲノム配列上のマーカーを利用して連鎖解析を行ったり、疾患の症状が現れる部位に発 現する遺伝子を探索するなど、標的遺伝子を絞り込む作業が必要となる。
本研究では網膜変性疾患に関与する新たな遺伝子を探索するために、視細胞と密接に関係す る網膜色素上皮細胞（RPE）特異的に発現する遺伝子の取得を試みた。第三章でARPB−19細胞 のcDNAライブラリーから取得したarylsulftase I（ARSI）は眼に特異的な遺伝子ではないがRPE に優位に発現することが示唆され、第四章で中性付近に至適pHを有するアリルスルファター ゼであることが示された。スルファターゼの異常は網膜変性を併発することがあり、さらに ARSIの場合は他のスルファターゼとは異なり眼に特異性を示すことから、網膜疾患のみを引 き起こす可能性も示唆される。そこで、本研究では国立障害者リハビリテーションセンターの 眼科に来院したRP患者68名を対象とし、変異スクリーニングを行なった。
5．2 材料と方法 5．2．1被験者
国立障害者リハビリテーションセンターのロービジョンクリニックに来院した血縁関係のな いRP患者68名を対象とした。対象者は臨床所見、患者病歴、家族歴を元に選抜した。68名の うち、26名に家族歴があり、27名には家族歴はない。残りの15名に関しては不明である。国 立障害者リハビリテーションセンターヒト・ゲノム遺伝子解析研究倫理審査委員会において審 査を受けて承認され、視覚障害者並びに健常者の方々に遺伝子試料（血液）を提供してもらう にあたっては十分なインフォームド・コンセントを得た。すなわち、研究の目的、研究の内容、
予想される協力者の不利益、個人情報の管理方法、研究結果の取扱い、試料の取扱いについて 文書及び口頭で十分な説明を行なった。文書で同意が得られた場合には、眼科外来において採 血を行ない、血液サンプルは個人識別情報管理者によって連結可能匿名化を行なった後、研究 に使用した。
5．2．2DNAサンプルの調製
約14mlの静脈血よりPUREGENE＠DNA purification Kit（Gentra Systems）を用いてゲノム DNAを抽出した。抽出したゲノムは一80℃にて保管した。塩基配列解析に使用するサンプルを 調製するために、ゲノムDNAを鋳型としてPCRを行なった。 ARSI遺伝子領域（NT＿029289．10）
のゲノム配列をNcBIのヒトゲノムデータベース（Build 363）より取得し、ARslの開始コドン のアデニン（A）をポジション1として表記した。PCRによる増幅に使用したプライマーを Table 5−1に示す。一段階目PCRでは250μgのゲノムDNAを鋳型としてTaKaTa Ex Taq⑧ polymerase（TaKaRa Bio）を使用してARSI遺伝子の全領域を増幅した。反応条件は、98℃の変 性30sec、63℃のアニール30 sec、72℃の伸長4minを1サイクルとして30サイクル行ない、
最後の伸長の72℃を10min追加した。二段階目のPCRでは一段階目のPCR産物を鋳型として、
一部配列が重複するように遺伝子領域を3分割して増幅した（Figure 5−1）。
5．2．3塩基配列解析
PCRによる増幅産物を鋳型として、Table 5−2に示したプライマーを用いて両方向から塩基配 列の決定を行なった。シーケンス反応にはBigDye＠ Terminator v3．lCycle sequencing kit（Applied Biosystems）を使用し、 EDTA沈殿により精製を行なった後、3130xlジェネティックアナライザ ー（Applied Biosystems）によって解析した。ハプロタイプはクラークアルゴリズム131）と期待値 最大化（expectation−maximization；EM）アルゴリズム132）によって見積もった。
5．3結果
5・3・1arylsulfatase 1 M伝子座の塩基配列解析
スルファターゼの変異が原因となるムコ多糖症（MPS）ではRPのような網膜変性が観察さ れる。ARSIはRPEに優位に発現するスルファターゼであることから、RPの原因遺伝子候補と した。68名のRP罹患者からゲノムDNAを抽出し、ARSI遺伝子領域での変異探索を行なった。
ARsl遺伝子は染色体5q33．1に位置し、2つのエキソンからなる全長6．6 kbの遺伝子である。
全遺伝子領域をPCRにより増幅し塩基配列の解析を行った。 Table 5−3にARSI遺伝子領域上 に存在する25個の塩基置換を示す。この中にはここで行った塩基配列解析から見いだされたも のと、dbSNPに登録されたものの両方を含んでいる。日本人RP患者68名から検出された14 箇所の一塩基置換のうち7箇所がdbSNPに登録されていない新規の置換であった。そのうちの 4箇所は稀な置換で、3箇所（SVIO， SV22， SV25）は8％以上のアレル頻度を有するSNPsであっ た。dbSNPに登録されている11箇所の置換は解析を行った68名の中からは見いだせなかった。
コーディング領域に2箇所の同義置換（SVI9， SV22）が見られたが、アミノ酸配列を変化させ る置換は存在しなかった。この解析では疾患の原因となり得る変異を見いだせなかったので、
対照群の解析は行わなかった。
1％以上のアリル頻度を有する置換は10箇所あり、これらのSNPsはHardy−Weinberg平衡に 矛盾しない。SNPO3とSNPO4、 SNPO5とSNPO7はそれぞれ連鎖していた。 Table5−4には68名 のRP患者から得られた136の染色体上の10箇所のSNPsから算出したハプロタイプを示した。
主要なハプロタイプはHO 1で、全染色体の66．2％を占める。 HO 1、 HO2、 HO3はホモ接合体が存 在し、起こり得る21の組み合わせのうち13のディプロタイプが観察された。
5．4考察
ARSI遺伝子を取得した当初は、 ARSBおよびARSAとのアミノ酸配列の類似性から、 ARSI はリソソームに局在し、酸性条件下で活性を有するスルファターゼであると考えていた。スル ファターゼの変異によって引き起こされるリソソーム蓄積症にはRP様の網膜変性が併発する ことがあるため、RPEに優位に発現するARSIはRPに関与する可能性が高いと思われた。実 際にはARSIはリソソーム酵素ではなく、細胞内ではERに局在するが、培養液中に分泌され て中性付近で働く酵素であることが第四章の解析から示された。ARSIは活性のあるスルファ ターゼであるが、例えば遺伝子に変異があったとしてもリソソーム蓄積症の原因にはならない と考えられる。本研究で行った68名のRP患者からは疾患に関連するようなミスセンス変異も ナンセンス変異も見いだせなかった。しかし、ARSIが眼に多く発現し、さらにその中でもRPE に優位に発現することは事実であるので、網膜疾患に関与する可能性はいまだ十分考えられる。
また、リソソーム酵素でないスルファターゼも疾患の原因遺伝子となっている。Steroid sulfatase，
isozyme S（STSfARSC）はERに局在しする中性のスルファターゼであるが、 X連鎖性魚鱗癬の 原因遺伝子として同定されており、ゴルジ体に局在するarylsulfatase E（ARSE）は点状軟骨異形 成症の原因として知られている。これらのことを考慮すると、ARSIの変異探索は継続してい
くべきである。
RP患者のARSI遺伝子座の変異探索を行うと共に、 HapMapおよびdbSNPから既知のSNPs の情報を収集した。dbSNPには今回の解析では見いだせなかった置換が多く登録されていた。
そのなかにコーディング領域に1塩基の欠失があり、これはアミノ酸配列のフレームシフトを 引き起こす。このフレームシフトが起きると、ARSIのC末端が短くなり、第四章で考察した ように基質特異性に何らかの影響を及ぼすことが懸念される。しかし、この変異を有する被験 者が視力障害を煩っているかどうかは判らない。