Real-time RT-PCR

マイクロアレイ解析で得られた発現変動遺伝子プロファイルを確認するため, ABI Prism

7900 HT (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA)

を用いて

により

mRNA

発現の定量解析を実施した。検討した遺伝子は, いずれかの抗甲状腺曝露群で無処置

群の発現量から

2

倍以上の増減を示したものとし, 発現量が増加した遺伝子として

vimentin,

ret proto-oncogene (Ret), v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene (v-Maf), tektin 4

を, 発

31

現量が減少した遺伝子として

claudin 11 (Cld11), zinc finger homeobox 1b (Zfhx1b)を選択した。

cDNA

合成には, マイクロアレイ解析時に調整した

aRNA (1

回増幅) を用い, 各遺伝子のプラ

イマーは

TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems Inc.)

を用いた。内因性コントロ

ールとして

glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)

の発現量を

TaqMan Rodent

GAPDH Control Reagents (Applied Biosystems Inc.)

を用いて測定した。発現量の定量は検量線

法により実施し, 各遺伝子の発現量は

GAPDH

の発現量で補正した。

免疫組織化学的解析

各群

10

匹 (無処置群は

6

匹) の雄子動物の脳をブアン固定後にパラフィン包埋し, 4-5 µm

の厚さに薄切した標本を用いて, マイクロアレイ解析で抽出した以下の分子について免疫組織化学的解析を実施した；vimentin (mouse monoclonal antibody, 1:200; Millipore Corporation,

Billerica, MA, USA), glial fibrillary acidic protein (GFAP, rabbit polyclonal antibody, 1: 500; Dako,

Glostrup, Denmark), Ret (rabbit polyclonal antibody, 1: 50; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa

Cruz, CA, USA), deleted in colorectal carcinoma (DCC, mouse monoclonal antibody, 1:40; Leica

Microsystems GmbH), oligodendrocyte specific protein (OSP, Cld11

と同一分子, rabbit polyclonal

antibody, 1: 200; Novus Biologicals, Inc., Littleton, CO, USA)。 Vimentin

抗体および

DCC

抗体使用

時には, 標本を

10 mM

クエン酸緩衝液内でマイクロウェーブにより

10

分間加熱することによ

り抗原賦活化を行った。シグナル検出は, VECTASTAIN Elite ABC Mouse IgG kitおよび

32 VECTASTAIN Elite ABC Rabbit IgG kit (Vector Laboratories, Iic.)

のプロトコールに従い, 免疫

反応は

3,3’-diaminobenzidine/H

₂

O

₂を用いて可視化した後, ヘマトキシリンにより対比染色し

た。

Vimentin, Ret

および

GFAP

陽性細胞については, 2つの切片 (約

100 µm

間隔) を用いて, 各

切片の両側の帯状束における単位面積 (mm²

)

当の陽性細胞数を測定した。定量解析のために,

DP70 Digital Camera System (オリンパス)

を搭載した

BX51 microscope (オリンパス)

にて

100

倍の倍率で染色標本の写真を取り込み, WinROOF image analysis software 5.7 (三谷商事) を用

いて定量した。DCCおよび

Cld11

の大脳白質における染色強度は, 次に示す様な基準でスコ

ア化した；0 発現なし, 1 軽微な発現, 2 軽度の発現, 3 中等度の発現, 4 強度の発現。

統計解析

定量データについては, 無処置群と各抗甲状腺剤曝露群間で比較し, Bartlett法により分散

性の同等性を評価した後に, 分散が等しい場合は

Dunnett

法，分散が等しくない場合は

Dunnett

型の多重比較検定を実施した。DCCおよび

Cld11

の免疫染色強度のスコアは, Mann-Whitney

の

U

検定を用いて無処置群を基準とした検定を実施した。なお, 有意水準

5%以下を有意差あ

りとした。

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ドキュメント内化学物質の発達期曝露による脳白質発達障害の短期評価手法開発に関する研究 (ページ 31-34)