P. aeruginosa のエラスターゼ活性への AmiE の影響

4.8.1. 緒言と実験方法

本節では，AHL 合成細菌に amiE 遺伝子を導入したときの，AmiE の AHL 分解による

QQ (Quorum Quenching)の確認を行った．QQ用のモデル細菌としてPseudomonas aeruginosa

PAO1株を選定した．P. aeruginosaはLasIおよびRhlIを介して，それぞれ3OC12-HSLお

よびC4-HSLをQSシグナル物質として合成しており，このうち3OC12-HSLを介したQS

によって，病原性にかかわるエラスターゼ活性を制御している^[29]．そこで，本節ではamiE を組み込んだプラスミドを有する P. aeruginosa のエラスターゼ活性を確認することで，

AmiEが細菌内で生産されたAHLを分解しQQを示すかどうか確認を行った．

① pBBR1-amiEプラスミドの作製

まず，Ooi24株の染色体からamiE配列を増幅させた．プライマーには5’-TCT AAG CTT

CCG ATC ATG AGC TTC AAT ATT GCA CC-3’および5’-TCT GGA TCC TCG TCA ATC AAT

TGA TTT CTA GTC GG-3’を用いた．なお，下線部にHindIIIおよびBamHIの制限酵素認

識部位を設けた．DNAポリメラーゼにはBlend Taqを用い，PCRを実施した．PCR産物

はHindIIIおよびBamHIによる制限酵素処理を実施後，同じ制限酵素処理を実施したベク

ターpBBR1MCS5へライゲーションし，pBBR1-amiEを作製した．

なお，ポジティブコントロールとして，Solibacillus silvestris StLB046株由来のAHLラ クトナーゼ遺伝子ahlSを選定し，pBBR1-ahlSを作製した^[30]．また，ネガティブコントロ ールとして，pBBR1MCS5を用いた．

② P. aeruginosa PAO1株への導入

pBBR1MCS5, pBBR1-ahlS, pBBR1-amiEそれぞれのP. aeruginosa PAO1株への導入はエ

レクトロポレーションにより行った^[31]．まず，P. aeruginosaをLB液体培地(4 mL)で培養 し，坂口フラスコに用意した LB 液体培地(100 mL)で本培養を行った．OD600の値が 0.4 前後になったところで，これを分取(40 mL)し遠心分離後，上清を除去した．これに300 mM スクロース水溶液(40 mL)を加えてボルテックス後，再び遠心分離し，上清を除去した．

さらに同スクロース水溶液を20 mL加え，同様の操作を行った．得られた沈殿物に同ス クロース水溶液600 μLを加え，ボルテックス後，これを100 μLずつ分取し，それぞれに

pBBR1MCS5, pBBR1-ahlS, pBBR1-amiEのプラスミド溶液2 μLを加えた．これを電極間隔

2 mmのエレクトロキュベットに入れ，パルス電流を流した．直後にこの溶液をマイクロ チューブに移し，LB液体培地(900 μL)を加えてインキュベーター中で放置した(30°C, ~24

101

h)．これをLB寒天培地（ゲンタマイシン100 μg/mL）にて培養し，生育したコロニーを プラスミド導入後のPAO1株として採取した．

③ エラスターゼ活性試験

プラスミド導入後のPAO1株をLB液体培地で前培養し，新しいLB液体培地へ1%濃 度で接種した．これにIPTG(1 mM)を加え，15 hの振とう培養を行った．培養物のOD600

を測定後，遠心分離し，上澄みを採取(600 μL)した．

ここからAHLを抽出するため，等量の酢酸エチル(600 μL)を加え，10 minのボルテッ クス混合を行った．水相は廃棄し，残った酢酸エチルを減圧下で蒸発させ，残留物を

DMSO(100 μL)に溶解させた．

エラスターゼ活性は上記の上澄みをサンプルとしてエラスチンコンゴーレッド(Elastin

Congo Red, ECR)アッセイによって評価した^[23]．まず，上澄み(100 μL)にECR (20 mg)およ

びECRバッファ(100 mM Tris, 1 mM CaCl2, pH 7.5, 900 μL)を加え，振とう培養を行った(4 h)．その後，溶けずに残留したECRを遠心分離で沈殿させ，波長495 nmにおける上澄み の吸光度を測定した．得られた値をOD600の値で除してエラスターゼ活性を算出した．

4.8.2. 実験結果

エラスターゼ活性の測定結果をFig. 4-16に示す．実験はn=3で実施し，その標準偏差を グラフ上にエラーバーで示した．pBBR1MCS5 ベクターを導入したPAO1 株と比較して，

pBBR1-amiEを導入した株はpBBR1-ahlSを導入した株とともに，エラスターゼ活性が50%

以上低下した．

抽出したAHLを確認した結果，pBBR1MCS5ベクターを導入したPAO1株の上澄みから は，P. aeruginosaが生産する3OC12-HSLおよびC4-HSLの両方が検出されたが，他の2つ のサンプルからはいずれも検出されなかった．AmiE に関しては C4-HSL の分解活性がな いにもかかわらず C4-HSL も検出されなかったが，これは C4-HSL を生産するための rhl

系QSが，3OC12-HSL存在下で活性化するlasR遺伝子により制御されている^[32]ためであ

ると考えられる．過去の研究におけるAHLアシラーゼPA0305についても50%以上のエラ スターゼ活性低下を示すと同時に，AmiE と同様の分解特性をもちながら C4-HSL は検出 されなかったと報告されている^[23]．

102

Fig. 4-16 Elastase activities in the culture supernatant of PAO1 harboring AHL-degrading gene

103