第 1 節 緒 言
CAA 殺 菌 剤 は セ ル ロ ー ス 合 成 酵 素 を 阻 害 す る こ と に よ り 殺 菌 作 用 を 示 す 。セ ル ロ ー ス は 、 ウ リ ジ ン 二 リ ン 酸 グ ル コ ー ス （UDP-グ ル コ ー ス ） を 糖 供 与 体 と し て β-1,3-グ ル カ ン 、β-1,6-グ ル カ ン で あ る セ ル ロ ー ス 単 鎖 が 合 成 さ れ 、 こ れ が Cellulose binding elicitor lectin（CBEL）に よ っ て 束 ね ら れ セ ル ロ ー ス 繊 維 と な り 、ブ ド ウ べ と 病 菌 を 含 め た 卵 菌 類 の 1次 細 胞 壁 お よ び 2次 細 胞 壁 の 構 造 を 形 成 す る 。卵 菌 類 は セ ル ロ ー ス 合 成 酵 素 複 合 体 を 形 成 し 、 最 大 で 4 つ の タ ン パ ク 質 か ら 成 る 。そ の 中 で も CesA3遺 伝 子 は 菌 糸 伸 長 を 形 成 す る 際 に 最 も 強 く 発 現 す る 遺 伝 子 で あ り 、発 現 を 抑 制 す る こ と で 細 胞 壁 へ の D-グ ル コ ー ス の 取 り 込 み が 阻 害 さ れ 、 細 胞 壁 内 の セ ル ロ ー ス 量 が 減 少 す る 。 そ の 結 果 、 卵 菌 に お け る 菌 糸 伸 長 の 抑 制 お よ び 付 着 器 生 産 に 重 度 の 障 害 が 起 き る（Blum et al. 2010、Grenville-Briggs et al. 2008、Fugelstad et al. 2009）。 ブ ド ウ べ と 病 菌 が CAA 殺 菌 剤 に 対 す る 耐 性 を 獲 得 す る に は 、 ブ ド ウ べ と 病 菌 の PvCesA3 遺 伝 子 が 一 塩 基 置 換 を 起 こ し 、 1105番 目 の コ ド ン が 変 異 す る（G1105S 変 異 ）必 要 が あ る 。ま た 、こ の 変 異 は 劣 性 遺 伝 で あ る た め 、 対 立 遺 伝 子 の 両 方 が 変 異 し た ホ モ 接 合 体 で な け れ ば 、 ブ ド ウ べ と 病 菌 は CAA殺 菌 剤 耐 性 を 獲 得 し な い （Gisi et al. 2006）。 第 3章 に お い て 、 ASP-PCR法 の 確 立 に よ りCAA殺 菌 剤 耐 性 遺 伝 子 を 迅 速 に 検 出 す る こ と が 可 能 と な っ た 。 し か し 、 本 法 で は CAA 殺 菌 剤 耐 性 ホ モ 接 合 体 と 感 受 性 ヘ テ ロ 接 合 体 を 区 別 す る こ と は で き な い こ と が 明 ら か に な っ た 。 し た が っ て 、 前 章 で 構 築 し た ASP-PCR法 に よ り CAA 殺 菌 剤 耐 性 遺 伝 子 が 検 出 さ れ た サ ン プ ル に つ い て 、そ れ が CAA 殺 菌 剤 耐 性 ブ ド ウ べ と 病 菌 で あ る と 診 断 す る た め に は 更 な る 診 断 方 法 を 考 案 す る 必 要 が あ る 。
ASP-PCR 法 以 外 に も 薬 剤 耐 性 遺 伝 子 診 断 法 は い く つ か 開 発 さ れ て い る 。 そ の 中 で も CAA 殺 菌 剤 耐 性 菌 を 検 出 す る た め の 候 補 と し て 挙 が る の は 、DNA 修 復 酵 素 と 蛍 光 色 素 を 利 用 し 、 標 的 の DNA 量 を 測 定 す る Invader 法 、 複 数 の プ ラ イ マ ー と 鎖 置 換 型 DNA 合 成 酵 素 を 使 用 し 、65℃ の 定 温 で 標 的 DNA を 増 幅 後 、 電 気 泳 動 に よ り 増 幅 バ ン ド を 確 認 す る Loop-Mediated Isothermal Amplification
（LAMP） 法 、PCR 法 を 基 盤 と し 、 複 数 の プ ラ イ マ ー を 使 用 す る Randomly amplification of polymorphic DNA（RAPD）法 、ゲ ノ ム の 一 部 を whole genomic PCR に よ り 増 幅 し 、 複 雑 度 を 低 く し た ア ン プ リ コ ン DNA を 比 較 す る Representational difference analysis （RDA） 法 、 そ し て 、PCR と 制 限 酵 素 処
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理 を 利 用 し た Polymerase chain reaction-restriction fragments length polymorphism （PCR-RFLP） 法 で あ る （Lyamichev et al. 1999、Luogen et al.
2005、Paplomatas et al. 2004、Spano et al 1997、Tsugunori et al. 2000）。
Invader 法 、LAMP 法 、RDA 法 、RAPD 法 は 、 信 憑 性 が 高 く 反 応 も 迅 速 に 行 わ れ る が 、 特 殊 な 酵 素 や 複 数 の プ ラ イ マ ー を 使 用 す る と い う 点 で 欠 点 が あ る 。 す な わ ち 、 こ れ ら の 方 法 は 手 間 と 費 用 が か さ む た め 、 本 研 究 の よ う に 毎 年 多 く の 検 体 を モ ニ タ リ ン グ す る に は 不 向 き で あ る 。 一 方 PCR-RFLP 法 は 、PCR 法 に よ り 増 幅 さ せ た 任 意 の DNA 断 片 を 制 限 酵 素 で 消 化 し た 際 、 そ の 長 さ の 違 い も し く は 制 限 酵 素 に よ る 消 化 の 有 無 を 判 断 す る こ と で 、塩 基 配 列 の 変 異 を 見 出 す 方 法 で あ る 。 PCR－RFLP法 は 元 々PCR法 を 基 盤 と し て 感 染 症 に お け る 病 原 の 同 定 や 遺 伝 病 の 診 断 を 迅 速 に 行 う た め に 開 発 さ れ た が 、 信 頼 性 、 簡 便 性 と い う 点 で 植 物 病 原 菌 の 薬 剤 耐 性 を 検 定 す る 方 法 と し て も 近 年 主 流 と な っ て き て い る（Furuya et al. 2009、
Ishii et al. 2001、Ma et al. 2005、Saito et al. 2008）。
以 上 の こ と か ら 、本 章 で は PCR-RFLP 法 を 用 い て CAA 殺 菌 剤 耐 性 ホ モ 接 合 体 と 感 受 性 ヘ テ ロ 接 合 体 を 正 確 に 区 別 す る 診 断 法 の 確 立 を 試 み る こ と に し た 。
第 2 節 材 料 お よ び 方 法
4-2-1 PCR法
ブ ド ウ べ と 病 菌PvCesA3遺 伝 子 の 3308-3327お よ び 3451-3432番 目 の 塩 基 配 列 よ り 設 計 し た プ ラ イ マ ー と ブ ド ウ べ と 病 罹 病 葉 か ら 抽 出 し たDNAをPCRに 供 試 し た 。 以 下 に 使 用 し た プ ラ イ マ ー の 塩 基 配 列 、PCR 反 応 液 組 成 お よ び PCR 反 応 条 件 を 示 す 。
P. viticolaの PvCesA3遺 伝 子 か ら 設 計 し た PCR-RFLP 用 プ ラ イ マ ー PvCesA3 Fw 3308-3327 5’-TTTGGCTTCTTCGTCATGAG-3’
PvCesA3 Rv 3451-3432 5’-CTGCACAAACACGACAATGT-3’
- 34 - PCR 反 応 液 の 組 成 ：
滅 菌 超 純 水 5.53 μL
10×buffer 1 μL
2.5mM dNTP Mixture 0.35 μL PvCesA3 Fw (10 μM) 1 μL PvCesA3 Rv (10 μM) 1 μL Taq polymerase 0.12 μL DNA テ ン プ レ ー ト 1 μL
合 計 10 μL
PCR 反 応 条 件 ：
95℃ 3min
95℃ 30sec
54℃ 30sec
72℃ 30sec
72℃ 2min
4℃ ∞
4-2-2 制 限 酵 素 処 理
PCR 産 物 に 対 し 、 制 限 酵 素 AluI を 用 い て 37℃ で 16 時 間 の 制 限 酵 素 処 理 を 行 っ た 。反 応 終 了 後 、2.5％ ア ガ ロ ー ス ゲ ル に ア プ ラ イ し 、電 気 泳 動 を 実 施 し た 。以 下 に 制 限 酵 素 処 理 反 応 液 の 組 成 を 示 す 。
AluI を 用 い た制 限 酵 素 処 理 反 応 液 の 組 成 ：
滅 菌 超 純 水 18 μL
10×Buffer TangoTM 2 μL
AluI 2 μL
PCR 産 物 10 μL
合 計 32 μL
電 気 泳 動 後 、 エ チ ヂ ウ ム ブ ロ マ イ ド 染 色 に よ り 、 制 限 酵 素 に よ る 切 断 の 有 無 を 確 認 し た 。
35Cycles
- 35 - 4-2-3 生 物 検 定 法
甲 州 種 の 若 葉 か ら 6 mm パ ン チ を 用 い て リ ー フ デ ィ ス ク を 切 り 出 し 、 蒸 留 水 を し み こ ま せ た 脱 脂 綿 を 敷 き 詰 め た シ ャ ー レ に 置 い た 。 こ の 際 、 リ ー フ デ ィ ス ク の 裏 側 を 上 に し た 。CAA 殺 菌 剤 マ ン ジ プ ロ パ ミ ド を 0、0.1、1、5、10あ る い は 100 mg/L の 濃 度 で そ れ ぞ れ 10枚 の リ ー フ デ ィ ス ク に 散 布 し 、4-5 時 間 風 乾 し た 。 そ の 後2009年 度 に 採 集 し た ブ ド ウ べ と 病 菌 の 胞 子 を5000 spores/mLに な る よ う に 調 整 し た 。 薬 剤 を 散 布 し た リ ー フ デ ィ ス ク 上 に 胞 子 懸 濁 液 を ピ ペ ッ タ ー に よ り 接 種 し 、19℃ で 一 晩 暗 所 に お い た 後 、19℃ で 7 日 間 12 時 間 光 照 射/12 時 間 暗 黒 下 の 条 件 で 培 養 し た （Sierotzki et al. 2003）。 培 養 期 間 終 了 後 、 リ ー フ デ ィ ス ク 上 の 病 班 形 成 の 有 無 に よ り CAA 殺 菌 剤 に 対 す る 薬 剤 耐 性 を 評 価 し た 。 各 処 理 濃 度 に お け る 評 価 結 果 を も と に EC50値 を 常 法 に よ り 算 出 し た 。
第 4 節 結 果 お よ び 考 察
4-4-1 PCR-RFLP 法 に よ る CAA 殺 菌 剤 耐 性 遺 伝 子 の 切 断
本 法 で 使 用 し た 制 限 酵 素 AluIは 塩 基 配 列AGCTを 認 識 し Gと Cの 間 を 切 断 す る （ 図 7）。 そ の た め 、PvCesA3遺 伝 子 よ り 増 幅 さ れ た PCR 産 物 に CAA 耐 性 に 関 わ る 塩 基 配 列 の 変 異 （GGC AGC） が 入 っ て い た 場 合 、AluI に よ り PCR 産 物 は 切 断 さ れ る 。本 章 で は 、第 3章 に て シ ー ケ ン ス 解 析 を 行 っ た ブ ド ウ べ と 病 菌
（CAA 殺 菌 剤 感 受 性 と 診 断 ）DNA を PCR-RFLP 法 に 供 試 し た 。そ の 結 果 を 図 8
（ レ ー ン 1～10） に 示 し た が 、 い ず れ の ブ ド ウ べ と 病 菌 DNA 由 来 PCR 産 物 も AluI で は 切 断 さ れ な か っ た 。 一 方 、CAA 殺 菌 剤 耐 性 遺 伝 子 断 片 を 鋳 型 と し て PCR-RFLP を 行 っ た 場 合 、AluI に よ る 切 断 が 確 認 さ れ た（ 図 8レ ー ン R）。以 上 の 結 果 よ り 、本 研 究 で 構 築 し た PCR-RFLP 法 は ブ ド ウ べ と 病 菌 の CAA 殺 菌 剤 耐 性 遺 伝 子 を 効 率 的 に 検 出 で き る こ と が 示 さ れ た 。
4-4-2 生 物 検 定 法 に よ る CAA 殺 菌 剤 耐 性 菌 の 検 出
リ ー フ デ ィ ス ク 法 を 用 い た 生 物 検 定 法 の 結 果 、CAA 殺 菌 剤 に 対 す る こ れ ら ブ ド ウ べ と 病 菌 の EC50は す べ て 0.1よ り 小 さ か っ た 。本 研 究 で 使 用 し た レ ー バ ス フ ロ ア ブ ル の 推 奨 散 布 濃 度 は 100-200 ppmで あ る こ と か ら 、供 試 し た ブ ド ウ べ と 病 菌 は 再 び CAA 殺 菌 剤 感 受 性 と 診 断 さ れ た 。
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4-4-3 PCR-RFLP 法 を 応 用 し た CAA 殺 菌 剤 耐 性 菌 の 検 出
本 PCR-RFLP法 を 確 立 す る 段 階 で CAA殺 菌 剤 耐 性 遺 伝 子 を 有 す る ブ ド ウ べ と 病 が 確 認 さ れ て い な か っ た た め 、 人 工 合 成 し た CAA 殺 菌 剤 耐 性 遺 伝 子 と 感 受 性 ブ ド ウ べ と 病 菌 か ら 調 整 し た CAA 殺 菌 剤 耐 性 遺 伝 子 を 混 合 し た 「CAA 殺 菌 剤 耐 性 菌 ・ 感 受 性 菌 ゲ ノ ム モ デ ル 」 を 構 築 し た 。
CAA 殺 菌 剤 感 受 性 菌 ゲ ノ ム ホ モ 接 合 体 モ デ ル （CAA 殺 菌 剤 耐 性 遺 伝 子 ：CAA 殺 菌 剤 耐 性 遺 伝 子 ＝2：0） を PCR-RFLP 法 に 供 試 し た 結 果 、CAA 感 受 性 ブ ド ウ べ と 病 菌 DNA と 同 様 、AluI に よ る 切 断 は 認 め ら れ な か っ た （ 図 9 レ ー ン SS）。
一 方 、 感 受 性 菌 ゲ ノ ム ヘ テ ロ 接 合 体 モ デ ル （CAA 殺 菌 剤 耐 性 遺 伝 子 ：CAA 殺 菌 剤 耐 性 遺 伝 子 ＝1：1） の 場 合 、AluI に よ り 切 断 さ れ た PCR 産 物 と 切 断 さ れ な い PCR 産 物 が 混 在 す る 結 果 と な っ た （ 図 9 レ ー ン SR）。 対 し て 、CAA 殺 菌 剤 耐 性 菌 ゲ ノ ム ホ モ 接 合 体 モ デ ル（CAA殺 菌 剤 耐 性 遺 伝 子：CAA 殺 菌 剤 耐 性 遺 伝 子 ＝0： 2） の 場 合 、 す べ て の PCR 産 物 が AluI に よ っ て 切 断 れ た （ 図 9 レ ー ン RR）。 以 上 の 結 果 に よ り 、 本 PCR-RFLP 法 を 駆 使 す る こ と に よ り 、CAA 殺 菌 剤 耐 性 菌 を 診 断 す る こ と が 可 能 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。
PCR-RFLP 法 は 制 限 酵 素 を 必 要 と す る た め 、制 限 酵 素 認 識 部 位 が 使 え な い 塩 基 配 列 の 変 異 に は 応 用 が 効 か な い と い う 欠 点 が あ る 。 ま た 、 使 用 す る 制 限 酵 素 に よ っ て は 処 理 時 間 が 長 く な り 、 診 断 結 果 を 得 る ま で の 時 間 が 長 く な る 。 こ れ ら の 欠 点 が あ る た め 、CAA 殺 菌 剤 耐 性 ブ ド ウ べ と 病 菌 の 診 断 に 関 し て も 、本 PCR-RFLP 法 は 検 体 数 が 多 い1次 ス ク リ ー ニ ン グ に は 向 か な い 手 法 で あ る と 言 え る 。し か し 、 本 法 は 、 特 別 な 技 術 も 必 要 な く 、 診 断 の 精 度 も 極 め て 高 い 方 法 で あ り 時 間 は か か る と 言 っ て も 約 4時 間 で 結 果 が 得 ら れ る た め 、検 体 数 が 大 幅 に 減 る 2次 ス ク リ ー ニ ン グ で は 迅 速 に 検 定 が で き る 。し た が っ て 、CAA 殺 菌 剤 耐 性 ブ ド ウ べ と 病 菌 の 検 出 に は 、一 次 ス ク リ ー ニ ン グ と し て ASP-PCR法 を 行 な い 、CAA殺 菌 剤 耐 性 遺 伝 子 が 検 出 さ れ た サ ン プ ル に つ い て PCR-RFLP 法 お よ び 生 物 検 定 法 で 耐 性 菌 か 否 か の 精 密 診 断 を 行 う の が 合 理 的 で あ ろ う 。
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図 7 PCR-RFLP 法 に よ る CAA 殺 菌 耐 性 遺 伝 子 の 検 出 （ 概 要 ）
A、T、G、C は 塩 基 配 列 を N、V、F、G、S、Lは ア ミ ノ 酸 配 列 を 表 す 数 字 は PvCesA3遺 伝 子 上 の 何 番 目 の 塩 基 か を 表 す
矢 印 は 制 限 酵 素 AluI よ る 切 断 部 位 を 表 す PvCesA3：CAA 殺 菌 剤 感 受 性 遺 伝 子 R-PvCesA3：CAA殺 菌 剤 耐 性 遺 伝 子
四 角 で 囲 っ た 3つ の 塩 基 は 1105 番 目 の コ ド ン を 示 す 。
CAA 殺 菌 剤 耐 性 遺 伝 子 で は 第 一 塩 基 G が A に 変 化 し て い る 。