本 研 究 で は 、 遺 伝 子 工 学 技 術 を 利 用 し た CAA 殺 菌 剤 耐 性 遺 伝 子 の 検 出 法 お よ び CAA 殺 菌 剤 耐 性 ブ ド ウ べ と 病 菌 の 診 断 法 を 確 立 し た 。 実 現 場 で 得 ら れ た ブ ド ウ べ と 病 菌 羅 病 サ ン プ ル か ら の CAA 殺 菌 剤 耐 性 診 断 ス キ ー ム は 、 現 時 点 に お い て 図 15 の 様 に な る 。 従 来 の 化 学 薬 剤 耐 性 ブ ド ウ べ と 病 菌 の 診 断 方 法 で は 、 病 原 菌 を 採 集 し て か ら 診 断 結 果 が 出 る ま で 2週 間 以 上 を 要 し 、生 き た ブ ド ウ 葉 で の 診 断 で あ っ た た め 、検 体 数 も 少 量 し か 扱 え な か っ た 。こ れ を 踏 ま え て 、昨 今 で は 様 々 な 分 子 生 物 学 的 手 法 を 用 い た 化 学 薬 剤 耐 性 診 断 方 法 が 確 立 し て い る （Ishii et al.
2001、Ma et al. 2003、Ma et al. 2005、Sirven et al. 2002）。 し か し 、 羅 病 サ ン プ ル を 採 集 し て か ら 病 原 菌 を 単 離 し 、 そ の 後 に 純 粋 培 養 を 行 う た め 、 こ れ ら の 診 断 方 法 で も 最 終 的 な 診 断 結 果 を 得 る ま で に 数 日 を 要 し て し ま う 。 ま た 、 複 数 の 地 域 に ま た が る モ ニ タ リ ン グ な ど の100検 体 を 超 え る 羅 病 サ ン プ ル を 扱 う に は 不 向 き で あ る 。 そ の た め 、 公 的 研 究 機 関 で 化 学 薬 剤 耐 性 診 断 が 実 施 さ れ る の は 現 場 の 生 産 者 か ら の 情 報 （ 例 え ば 、 ブ ド ウ べ と 病 に 対 し こ の 化 学 薬 剤 が 効 き に く く な っ て き た 、 な ど の 現 場 の 声 ） が き っ か け で あ り 、 薬 剤 耐 性 菌 が 既 に 圃 場 に 発 生 し て か ら 診 断 を 行 う た め 、 既 に 防 除 が 困 難 に な っ て い る 例 も 多 く 認 め ら れ る 。 こ れ ら の 先 行 事 例 を 受 け 、 本 研 究 で 構 築 し た CAA 殺 菌 剤 耐 性 ブ ド ウ べ と 病 菌 診 断 シ ス テ ム は 時 間 短 縮 お よ び 多 検 体 へ の 応 用 を 考 え 開 発 し た 。
ブ ド ウ べ と 病 菌 の 最 大 の 特 徴 は 絶 対 寄 生 性 の 病 原 菌 で あ る こ と で あ る 。 化 学 薬 剤 耐 性 ブ ド ウ べ と 病 菌 の 診 断 に お い て は 、羅 病 サ ン プ ル か ら 胞 子 を 単 胞 子 分 離 し 、 そ れ を 「 単 胞 子 分 離 株 」 と し て 分 析 を 行 う こ と が こ れ ま で の 通 例 で あ っ た
（Andrieu et al. 2001、Genet et al. 2006、Toffolatti et al. 2007）。 し か し 、 単 胞 子 分 離 に は 検 体 数 分 の ブ ド ウ 葉 と そ れ を 個 別 に 継 代 維 持 す る た め の 設 備 、 単 胞 子 分 離 株 を 継 代 す る う え で の 特 殊 な 技 術 、 そ し て 単 胞 子 分 離 株 化 を お こ な う ま で の 多 大 な 時 間 が 必 要 で あ る た め 、 本 研 究 の よ う に 多 検 体 を 迅 速 に モ ニ タ リ ン グ す る 必 要 が あ る 場 合 、 化 学 薬 剤 耐 性 診 断 の 材 料 と し て 単 胞 子 分 離 株 は 現 実 的 で は な い 。 こ れ を 受 け 、 本 研 究 で は 診 断 時 間 の 短 縮 を 重 視 し 、 ブ ド ウ べ と 病 菌 羅 病 葉 の 病 斑 か ら 直 接 DNA を 抽 出 し 遺 伝 子 診 断 法 に 供 試 し た 。 こ の 方 法 の 場 合 、 抽 出 し た DNA サ ン プ ル に は 複 数 の ブ ド ウ べ と 病 菌 由 来 の 遺 伝 子 が 混 在 す る こ と が 予 想 さ れ る 。 ま た 、CAA 殺 菌 剤 耐 性 遺 伝 子 は 劣 性 表 現 型 で あ る た め 、CAA 殺 菌 剤 耐 性 遺 伝 子 が 検 出 さ れ て も 、 そ の ブ ド ウ べ と 病 菌 が CAA 殺 菌 剤 に 対 す る 耐 性 を 獲 得 し た こ と を 意 味 し な い 。こ れ を 解 決 す る た め に 、本 研 究 で は 2段 階 の 遺 伝 子 診 断 法 を 組 み 立 て た 。1 次 ス ク リ ー ニ ン グ と し て 採 用 し た ASP-PCR 法 は 、PCR の み の 診 断 方 法 で あ る た め 、100 検 体 以 上 で あ っ て も 1 日 以 内 に CAA 殺 菌 剤 耐 性
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遺 伝 子 を 検 出 す る こ と が で き る 。 こ れ に よ り 、 単 一 圃 場 か ら 一 度 に 検 出 で き る ブ ド ウ べ と 病 菌 サ ン プ ル 数 が 飛 躍 的 に 増 加 し た 。2次 ス ク リ ー ニ ン グ の PCR-RFLP 法 は 、CAA 殺 菌 剤 耐 性 遺 伝 子 が 検 出 さ れ た サ ン プ ル の み か ら CAA 殺 菌 剤 耐 性 ブ ド ウ べ と 病 菌 を 検 出 す る 診 断 法 で あ る 。1 次 ス ク リ ー ニ ン グ で 検 体 数 を 大 幅 に 絞 れ る た め 、短 時 間 で 診 断 結 果 を 出 す こ と が 可 能 と な っ た 。 最 終 的 に 3次 ス ク リ ー ニ ン グ と し て 生 物 検 定 法 を 実 施 し て い る が 、2 次 ス ク リ ー ニ ン グ で 疑 わ し い 検 体 の み を 供 試 す る た め 検 体 数 を 最 小 限 に で き 、 従 来 の 生 物 検 定 法 の 欠 点 を 緩 和 す る こ と に 成 功 し た 。こ れ ら の 診 断 法 の 組 み あ わ せ に よ り 、2012年 に 採 集 し た 80サ ン プ ル か ら 1サ ン プ ル の CAA 殺 菌 剤 耐 性 ホ モ 接 合 体 を 、2013年 に 採 集 し た 157 サ ン プ ル か ら 5 サ ン プ ル の CAA 殺 菌 剤 感 受 性 ヘ テ ロ 接 合 体 を 検 出 す る こ と に 成 功 し た 。ま た 将 来 的 に ASP-PCR 法 お よ び PCR-RFLP 法 を 改 良 す る こ と で 、ゲ ノ ム 上 の CAA 殺 菌 剤 耐 性 遺 伝 子 お よ び 感 受 性 遺 伝 子 の コ ピ ー 数 を 正 確 に 検 出 で き れ ば 、 サ ン プ ル 内 に 遺 伝 子 型 の 異 な る ブ ド ウ べ と 病 菌 が 混 在 し て い る か 否 か を 判 断 で き る と 考 え て い る 。そ の 結 果 と し て 、CAA 殺 菌 剤 耐 性 ブ ド ウ べ と 病 菌 の 検 出 は 将 来 的 に 遺 伝 子 診 断 技 術 だ け で 可 能 と な り 、 図 15 で 示 し た よ り も さ ら に 迅 速 に 化 学 薬 剤 耐 性 診 断 が 完 了 す る で あ ろ う 。
ブ ド ウ べ と 病 菌 は 11月 上 旬 ご ろ の 落 葉 前 ま で 圃 場 内 で 確 認 す る こ と が で き る 。 化 学 薬 剤 耐 性 診 断 を 実 施 す る 時 期 と し て 、 ブ ド ウ 収 穫 後 の 圃 場 か ら ブ ド ウ べ と 病 羅 病 サ ン プ ル を 採 集 し 、 本 研 究 で 確 立 し た 診 断 法 に よ り 診 断 を 開 始 す る の が 得 策 で あ る 。 翌 年 度 の ブ ド ウ 休 眠 期 へ の 作 業 を 開 始 す る こ の 時 期 ま で に 化 学 薬 剤 耐 性 診 断 を 完 了 し 、 圃 場 に お け る 薬 剤 耐 性 菌 の 有 無 を 把 握 で き れ ば 、 翌 年 度 に 使 用 す る 化 学 薬 剤 の 選 抜 に 貢 献 で き る 。 こ れ に よ り 、 防 除 効 果 の 薄 い 無 駄 な 化 学 薬 剤 の 使 用 を 無 く し 、 個 々 の 圃 場 で よ り 効 果 的 な 防 除 暦 を 作 成 で き る と 思 わ れ る 。 こ の よ う に 、 本 研 究 で 確 立 し た 化 学 薬 剤 耐 性 診 断 法 は ブ ド ウ 栽 培 に 貢 献 す る 一 技 術 と 成 り 得 る も の で あ る 。
本 研 究 に お い て 山 梨 県 内 の 圃 場 に CAA 殺 菌 剤 感 受 性 ヘ テ ロ 接 合 体 を 複 数 検 出 し た 。 こ の 結 果 は CAA 殺 菌 剤 耐 性 ブ ド ウ べ と 病 菌 の 発 生 リ ス ク が 山 梨 県 で 高 ま っ て い る こ と を 示 唆 す る 。CAA 殺 菌 剤 感 受 性 ヘ テ ロ 接 合 体 が 検 出 さ れ た 圃 場 の 防 除 暦 か ら 、CAA 殺 菌 剤 を 通 年 で 複 数 回 散 布 す る こ と に よ り 、CAA 殺 菌 剤 耐 性 遺 伝 子 が 圃 場 内 に 拡 散 し て い る よ う に 思 わ れ た 。CAA 殺 菌 剤 感 受 性 ヘ テ ロ 接 合 体 の 検 出 数 が 最 も 多 か っ た 圃 場 C は 、 防 除 暦 （ 表 2） か ら 分 か る 通 り 、2011 年 の 5 月 か ら 6 月 に か け て の 短 期 間 に CAA 殺 菌 剤 単 剤 （ マ ン ジ プ ロ パ ミ ド ） お よ び 混 合 剤 （ シ モ キ サ ニ ル ／ ベ ン チ ア バ リ カ ル ブ イ ソ プ ロ ピ ル ） を 複 数 回 圃 場 に 散 布 し て い た 。 圃 場 C の 栽 培 担 当 者 か ら 事 情 を 聞 い た と こ ろ 、5月 か ら 発 生 し 始 め た ブ ド ウ べ と 病 の 治 療 剤 と し て 使 用 し た と の こ と で あ っ た 。 尾 崎 ら （2013） は CAA
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殺 菌 剤 を ブ ド ウ べ と 病 に 連 続 使 用 す る 危 険 性 に つ い て 注 意 喚 起 を 行 っ て お り 、 CAA 殺 菌 剤 を 圃 場 に 散 布 す る 際 は CAA 殺 菌 剤 単 剤 を 単 用 で 使 用 す る こ と を 避 け 、 CAA殺 菌 剤 に 別 の 化 学 薬 剤 を 混 ぜ た 混 合 剤 と し て「 予 防 的 」に 散 布 す る こ と を 推 奨 し て い る 。 ま た 、 や む な く ブ ド ウ べ と 病 の 治 療 剤 と し て 使 用 す る 際 も 、 混 合 剤 と し て 使 用 す る こ と に よ り CAA 殺 菌 剤 耐 性 菌 の 初 期 発 生 リ ス ク が 大 幅 に 下 が る こ と を 尾 崎 ら （2013） は 示 し て い る 。 加 え て 、CAA 殺 菌 剤 耐 性 ブ ド ウ べ と 病 菌 が 優 位 な 圃 場 に お い て 2 年 間 CAA 殺 菌 剤 を 含 ん だ 混 合 剤 を 散 布 す る か 、 も し く は CAA 殺 菌 剤 を 散 布 し な い こ と に よ り 、そ の 圃 場 に お け る CAA殺 菌 剤 耐 性 ブ ド ウ べ と 病 菌 の 割 合 は 大 幅 に 低 下 す る （Gisi et al. 2008）。 逆 に 、CAA 殺 菌 剤 耐 性 菌 の 割 合 が 低 下 し た 圃 場 に お い て CAA殺 菌 剤 単 剤 を 単 用 で 使 用 す る と 、わ ず か 1 年 で CAA 殺 菌 剤 耐 性 ブ ド ウ べ と 病 菌 の 割 合 が 増 え 、CAA 殺 菌 剤 耐 性 ブ ド ウ べ と 病 菌 が そ の 圃 場 の 優 先 種 と な る こ と が 報 告 さ れ て い る （Gisi et al. 2008）。 以 上 の 知 見 か ら 、2011 年 に CAA 殺 菌 剤 混 合 剤 を 治 療 目 的 に 散 布 し た の に 続 き CAA 殺 菌 剤 単 剤 を 単 用 で 追 加 散 布 し 、続 く 2012年 に お い て も CAA 殺 菌 剤 単 剤 を 単 用 で 散 布 し た 圃 場 C で は 、 ブ ド ウ べ と 病 菌 に 対 し 急 激 に 且 つ 強 い 選 択 圧 が か か り 、 結 果 と し て2013年 に お け るCAA殺 菌 剤 感 受 性 ヘ テ ロ 接 合 体 の 検 出 に つ な が っ た と 推 察 し た 。本 研 究 結 果 を 受 け 、CAA 殺 菌 剤 耐 性 ブ ド ウ べ と 病 菌 の 発 生 リ ス ク が 非 常 に 高 い 圃 場 C の モ ニ タ リ ン グ を 今 後 も 続 け 、 山 梨 県 に お け る CAA 殺 菌 剤 耐 性 ブ ド ウ べ と 病 菌 の 発 生 状 況 を い ち 早 く 確 認 す る こ と が 我 々 の 一 つ の 使 命 だ と 考 え て い る 。
以 上 で 論 述 し た 圃 場Cの 栽 培 担 当 者 か ら の 聞 き 込 み 調 査 で 明 ら か と な っ た こ と は 、 我 が 国 の 化 学 薬 剤 散 布 に お け る 問 題 点 と し て 化 学 薬 剤 使 用 者 へ の 化 学 薬 剤 情 報 の 周 知 が 遅 れ て い る こ と で あ る 。 こ れ は 市 販 さ れ て い る 化 学 薬 剤 の 製 品 ラ ベ ル に 最 大 の 問 題 が あ る 。 第 5章 の 緒 言 で も 述 べ た が 、 化 学 薬 剤 は 作 用 機 構 別 に 系 統 化 さ れ て お り 、QoI 殺 菌 剤 や CAA 殺 菌 剤 は そ の 系 統 に よ る 呼 称 で あ る 。 そ の た め 同 じ 系 統 に 属 し て い る 化 学 薬 剤 は 作 用 点 が 同 じ で あ る こ と が 多 く 、 系 統 内 の 1 つ の 化 学 薬 剤 に 耐 性 を 獲 得 し た 病 原 菌 は 同 系 統 の す べ て の 化 学 薬 剤 に 耐 性 を つ け る （Gis et al. 2007、Ishii et al. 2001）。 こ の こ と か ら 、 化 学 薬 剤 使 用 者 は 化 学 薬 剤 を 系 統 別 に 認 識 し 、 適 切 な 化 学 薬 剤 を 圃 場 へ 散 布 す る こ と が 不 可 欠 で あ る 。 し か し 、1 つ の 農 作 物 に 対 し 数 多 く の 化 学 薬 剤 が 農 薬 登 録 さ れ 、 ま た 1 つ の 化 学 薬 剤 が 複 数 の 病 原 菌 を 標 的 と し て 登 録 さ れ て い る た め 、 化 学 薬 剤 の 使 用 者 の み な ら ず 化 学 薬 剤 散 布 を 指 導 す る 普 及 指 導 員 や 公 的 機 関 の 試 験 研 究 者 に と っ て も 市 販 さ れ て い る 化 学 薬 剤 の 系 統 を 把 握 す る こ と は 容 易 な こ と で は な い 。最 大 の 問 題 は 、 我 が 国 の 製 品 ラ ベ ル に は 化 学 薬 剤 情 報 と し て そ の 有 効 成 分 と 適 用 範 囲 、 使 用 上 限 は 記 載 さ れ て い る が 、 有 効 成 分 が 所 属 す る 系 統 に つ い て ま で は 記 載 さ れ て い な い