第 1 節 緒 言
実 圃 場 に お け る 薬 剤 耐 性 菌 の モ ニ タ リ ン グ は 、 イ ギ リ ス の 農 薬 取 締 総 局 が 管 理 す る Fungicide Resistance Action Group（FRAG-UK）や 北 欧 の 農 業 科 学 協 会 に よ る ワ ー キ ン グ グ ル ー プ で あ る Nordic and Baltic Resistance Action Group
（NORBARAG） な ど の 組 織 に よ り 、 多 種 多 様 な 病 原 菌 に 対 し 行 わ れ て い る 。 な か で も 、 世 界 農 薬 工 業 連 盟 が 組 織 す る Fungicide Resistance Action Committee
（ 以 下 FRAC） は 最 大 級 の 組 織 で あ る 。FRAC は 病 原 菌 に よ る 化 学 薬 剤 耐 性 を 回 避 も し く は 管 理 す る 目 的 で 1981 年 に 設 立 さ れ た 国 際 機 関 で あ る 。 主 な 活 動 内 容 は 薬 剤 耐 性 菌 の 検 定 お よ び モ ニ タ リ ン グ 方 法 の 提 示 、 薬 剤 耐 性 菌 モ ニ タ リ ン グ 結 果 の 公 表 、 薬 剤 耐 性 菌 関 連 文 献 や 情 報 の リ ス ト 化 、 化 学 薬 剤 使 用 に 関 す る ガ イ ド ラ イ ン の 提 示 な ど で あ る 。 薬 剤 耐 性 菌 の モ ニ タ リ ン グ は 、 殺 菌 剤 を 作 用 機 構 別 に 分 類 し 、 欧 州 、 北 米 、 南 米 お よ び オ ー ス ト ラ リ ア な ど で 定 期 的 に 行 わ れ て い る 。 対 象 と な っ て い る 化 学 薬 剤 は anilinopyrimidines、azanapthalene、sterol biosynthesis inhibitor、succinate dehydrogenase inhibitor、quinone outside inhibitor（ 以 下 QoI） 殺 菌 剤 な ど の 5 系 統 と CAA 殺 菌 剤 を 含 め た 合 計 6 系 統 で あ る 。CAA殺 菌 剤 耐 性 ブ ド ウ べ と 病 菌 の モ ニ タ リ ン グ 対 象 と な っ て い る 国 は 、フ ラ ン ス 、 ド イ ツ 、 イ タ リ ア 、 ス イ ス 、 オ ー ス ト リ ア 、 ス ペ イ ン 、 ポ ル ト ガ ル 、 ギ リ シ ャ 、ハ ン ガ リ ー 、チ ェ コ の 10カ 国 で 2005年 か ら 2014年 の 現 在 に 至 る ま で 、 毎 年 モ ニ タ リ ン グ が 続 け ら れ て い る 。こ の モ ニ タ リ ン グ の 結 果 は FRACの ホ ー ム ペ ー ジ（http://www.frac.info/frac/index.htm）に て 一 般 公 開 さ れ て お り 、会 員 で な く て も 閲 覧 す る こ と が 可 能 で あ る 。
現 在 、 フ ラ ン ス 、 ド イ ツ 、 イ タ リ ア 、 ス イ ス 、 オ ー ス ト リ ア の ブ ド ウ 圃 場 か ら CAA殺 菌 剤 耐 性 ブ ド ウ べ と 病 菌 が 検 出 さ れ て い る 。特 に 、フ ラ ン ス 南 部 の ボ ル ド ー 、コ ニ ャ ッ ク 、ロ ー ヌ 地 方 で は 2009年 か ら 現 在 に 至 る ま で CAA殺 菌 剤 耐 性 ブ ド ウ べ と 病 菌 が 90％ 以 上 の 高 い レ ベ ル で 検 出 さ れ 続 け て い る （ 尾 崎 2013）。 加 え て 、2013年 に は オ ー ス ト リ ア に 隣 接 す る ハ ン ガ リ ー の ジ ェ ー ル ·モ シ ョ ン ·シ ョ プ ロ ン 地 方 に お い て 、 ハ ン ガ リ ー で 初 め て の CAA 殺 菌 剤 耐 性 ブ ド ウ べ と 病 菌 が 報 告 さ れ た （Fungicide Resistance Action Committee 2013）。 こ の 報 告 か ら は CAA 殺 菌 剤 耐 性 ブ ド ウ べ と 病 菌 が 欧 州 に て 危 機 的 に 広 が り を 見 せ て い る こ と が 伺 え る 。
日 本 に お け る 薬 剤 耐 性 菌 の 対 策 は 日 本 植 物 病 理 学 会 に 附 属 す る 「 殺 菌 剤 耐 性 菌
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研 究 会 」 が 対 応 し て お り 、 作 用 機 構 別 に 分 類 し た 殺 菌 剤 の ガ イ ド ラ イ ン 設 定 や 文 献 の 収 集 を 行 っ て い る 。 加 え て 、 殺 菌 剤 耐 性 菌 研 究 会 が 主 催 す る シ ン ポ ジ ウ ム で は 、 新 た に 問 題 と な っ た 薬 剤 耐 性 菌 、 新 規 殺 菌 剤 の 作 用 特 性 や 作 用 機 構 、 薬 剤 耐 性 菌 の 検 定 法 や モ ニ タ リ ン グ 結 果 の 公 開 に 加 え 、 海 外 に お け る 薬 剤 耐 性 菌 の 動 向 な ど が 取 り 上 げ ら れ て い る 。 近 年 で は 薬 剤 耐 性 菌 に 対 す る ガ イ ド ラ イ ン も 設 定 さ れ 、 予 防 散 布 を 徹 底 す る こ と や 同 系 統 の 化 学 薬 剤 を 年 に 複 数 回 使 わ な い こ と を 書 面 に て 注 意 喚 起 し て い る 。 し か し 、 現 在 ま で に 日 本 国 内 に お け る CAA 殺 菌 剤 耐 性 ブ ド ウ べ と 病 菌 に 対 す る モ ニ タ リ ン グ の 報 告 は 行 わ れ て い な い 。
フ ラ ン ス で は CAA 殺 菌 剤 耐 性 ブ ド ウ べ と 病 菌 が 大 量 に 発 生 し た 2009 年 以 降 、 CAA殺 菌 剤 に 対 す る ブ ド ウ べ と 病 菌 の 感 受 性 は 依 然 低 い ま ま を 維 持 し て い る（ 尾 崎 2013）。山 梨 県 で は 2012 年 に CAA 殺 菌 剤 が 防 除 暦 に 載 る と と も に 、QoI殺 菌 剤 耐 性 ブ ド ウ べ と 病 菌 の 広 が り に よ り 、CAA 殺 菌 剤 は ブ ド ウ べ と 病 防 除 の 基 幹 防 除 剤 へ と な り つ つ あ る 。 し た が っ て 日 本 に お い て も CAA 殺 菌 剤 耐 性 ブ ド ウ べ と 病 菌 に 対 す る モ ニ タ リ ン グ を 実 施 し 、 モ ニ タ リ ン グ ・ デ ー タ を 伴 っ た 注 意 喚 起 が 今 後 の 課 題 で あ る と 考 え る 。こ れ を 行 わ な か っ た 場 合 、CAA 殺 菌 剤 耐 性 ブ ド ウ べ と 病 菌 の 増 加 を 未 然 に 防 ぐ こ と が で き ず 、 フ ラ ン ス に お け る CAA 殺 菌 剤 と 同 じ 道 を 歩 む こ と で あ ろ う 。
本 章 で は 、CAA殺 菌 剤 耐 性 ブ ド ウ ベ と 病 菌 モ ニ タ リ ン グ の 先 鞭 を つ け る た め に 、 第 4 章 ま で に 構 築 し た CAA 殺 菌 剤 耐 性 ブ ド ウ べ と 病 菌 に 対 す る 検 定 方 法 を 使 用 し 、山 梨 県 内 で の CAA 殺 菌 剤 耐 性 ブ ド ウ べ と 病 菌 お よ び CAA 殺 菌 剤 耐 性 遺 伝 子 の モ ニ タ リ ン グ を 実 施 す る こ と と し た 。
第 2 節 材 料 お よ び 方 法
5-2-1 サ ン プ ル 採 集
2010～2012年 は 山 梨 県 の 2カ 所 の 圃 場 か ら 、2013 年 は 4カ 所 の 圃 場 か ら ブ ド ウ べ と 病 菌 羅 病 葉 を 分 譲 し て 頂 い た （ 図 10）。 第 2 章 の 方 法 に し た が い 、 罹 病 葉 か ら ブ ド ウ べ と 病 菌 DNA を 抽 出 し た 。DNA 抽 出 に 使 用 し た 罹 病 葉 は 少 し 湿 ら せ た プ ロ ワ イ プ に 包 み 4℃ の 冷 蔵 室 に て 保 管 し た 。
5-2-2 遺 伝 子 診 断 法 に よ る CAA殺 菌 剤 耐 性 遺 伝 子 の 検 出
前 節 で 収 集 し た サ ン プ ル DNA を 用 い て 、 第 3 章 で 開 発 し た ASP-PCR 法 を 行
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い CAA 殺 菌 剤 耐 性 遺 伝 子 の 検 出 を 実 施 し た 。ASP-PCR 法 で CAA 殺 菌 剤 耐 性 遺 伝 子 が 検 出 さ れ た サ ン プ ル に つ い て は 第 4 章 で 開 発 し た PCR-RFLP 法 に 供 試 し た 。 な お 、100 検 体 以 上 の サ ン プ ル を 検 討 す る た め 、ASP-PCR 法 と PCR-RFLP 法 の 結 果 は マ イ ク ロ チ ッ プ 電 気 泳 動 装 置 MultiNA（ 以 下 MultiNA） で 確 認 を 行 っ た 。
以 下 に MultiNAの 簡 単 な 操 作 手 順 を 記 す 。
①MultiNA に 接 続 さ れ て い る コ ン ピ ュ ー タ ー か ら MultiNA 制 御 ソ フ ト ウ ェ ア を 起 動 し 、 分 析 ス ケ ジ ュ ー ル を 登 録 し た 。
②MultiNA DNA-500 試 薬 キ ッ ト に 付 属 し て い る DNA-500マ ー カ ー 溶 液 120 μL を 0.5 mLチ ュ ー ブ に 加 え た 。
③ 事 前 に 調 整 し た MultiNA用 分 離 バ ッ フ ァ ー （ 第 2 章 参 照 ） と マ ー カ ー 溶 液 が 入 っ た 0.5 mLチ ュ ー ブ を MultiNAの 試 薬 ホ ル ダ ー に セ ッ ト し た 。
④50倍 に 希 釈 し た 25bp DNA ラ ダ ー を 0.2 mLチ ュ ー ブ に 分 注 し 、MultiNAの エ ク ス ト ラ ン サ ン プ ル ス タ ン ド に セ ッ ト し た 。
⑤ASP-PCR法 も し く はPCR-RFLP法 に て 作 製 し た サ ン プ ル を サ ン プ ル ス タ ン ド に セ ッ ト し た 。
⑥MultiNA制 御 ソ フ ト ウ ェ ア 画 面 か ら 開 始 ボ タ ン を ク リ ッ ク し 、解 析 を 開 始 し た 。
5-2-3 生 物 検 定 法 に よ る CAA 殺 菌 剤 耐 性 菌 の 検 出
PCR-RFLP 法 に よ り CAA 殺 菌 剤 耐 性 遺 伝 子 が 検 出 さ れ 、CAA殺 菌 剤 耐 性 菌 が 疑 わ れ た サ ン プ ル に つ い て は リ ー フ デ ィ ス ク 法 に よ る 生 物 検 定 を 実 施 し た （ 方 法 は 前 章 4-3-3を 参 照 ）。DNA 抽 出 後 、4 ℃ に て 保 管 し て お い た ブ ド ウ べ と 病 菌 を 継 代 し 、 胞 子 数 を 増 や し て か ら 接 種 原 を 調 整 し た 。 以 下 に 継 代 の 簡 単 な 手 順 を 記 す 。
① 大 き め の タ ッ パ ー に プ ロ ワ イ プ を 敷 き 詰 め 、 水 道 水 で 浸 し た 。
② 生 物 環 境 調 節 装 置 で 育 成 し て い た 甲 州 の 若 葉 を 1枚 切 り 取 り 、湿 っ た プ ロ ワ イ プ 上 に 置 い た 。
③5 mLの 滅 菌 水 の 入 っ た 50 mLチ ュ ー ブ を 用 意 し た 。
④ ブ ド ウ べ と 病 菌 の 病 斑 か ら 胞 子 を 筆 で か き 取 り 、50 mL チ ュ ー ブ 内 で 懸 濁 す る こ と に よ り 、 ブ ド ウ べ と 病 菌 の 胞 子 懸 濁 液 を 作 成 し た 。
⑤ 胞 子 懸 濁 液 を ガ ラ ス 製 噴 霧 器 に よ っ て タ ッ パ ー 内 に あ る 甲 州 の 若 葉 に 噴 霧 し た 。
⑥19℃ の 暗 所 に 一 晩 お い た 後 、19℃ で 7 日 間 12 時 間 光 照 射/12 時 間 暗 黒 下 で 培
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リ ー フ デ ィ ス ク に 散 布 す る マ ン ジ プ ロ パ ミ ド の 濃 度 は 0.1 mg/L と し 、 ブ ド ウ べ と 病 菌 の 生 育 が 確 認 さ れ た 場 合 は 1、5、10 mg/L と 濃 度 を 上 げ て 再 試 す る こ と と し た 。
第 3 節 結 果 お よ び 考 察
5-3-1 遺 伝 子 診 断 法 に よ る CAA殺 菌 剤 耐 性 遺 伝 子 の 検 出 （2009～2010 年 ）
予 備 実 験 と し て 2008～2009 年 に 採 取 さ れ 研 究 室 で 保 管 さ れ て き た ブ ド ウ べ と 病 菌 DNA を ASP-PCR 法 に 供 試 し た 。2008 年 の サ ン プ ル の 内 訳 は 甲 州 市 18 サ ン プ ル 、 甲 府 市 7 サ ン プ ル 、 山 梨 市 10 サ ン プ ル 、 甲 州 市 46 サ ン プ ル で 、 合 計 81サ ン プ ル を 供 試 し た 。2009年 の サ ン プ ル は 甲 州 市 20サ ン プ ル 、甲 府 市 4サ ン プ ル 、山 梨 市 34サ ン プ ル で 、合 計 58サ ン プ ル を 供 試 し た 。こ れ ら の サ ン プ ル は 市 ご と に 複 数 の 圃 場 か ら 分 譲 し て 頂 い て い る も の で あ り 、 各 年 の 防 除 暦 が 明 ら か で な い 圃 場 も あ っ た 。ASP-PCR 法 の 結 果 と し て 、 い ず れ の 年 の す べ て の サ ン プ ル は CAA 殺 菌 剤 感 受 性 ホ モ 接 合 体 で あ り 、CAA 殺 菌 剤 耐 性 遺 伝 子 の 存 在 を 確 認 す る こ と は で き な か っ た （ デ ー タ 示 さ ず ）。
ブ ド ウ べ と 病 に 適 応 を 有 す る CAA 殺 菌 剤 マ ン ジ プ ロ パ ミ ド お よ び ベ ン チ ア バ リ カ ル ブ イ ソ プ ロ ピ ル は 2009 年 に 日 本 で 上 市 さ れ た ば か り で あ り 、 こ の 当 時 は ジ メ ト モ ル フ も 含 め て 公 的 機 関 が 発 行 す る 防 除 暦 へ 記 載 さ れ て い な か っ た 。ま た 、 山 梨 県 を 例 に 挙 げ る と 、CAA 殺 菌 剤 は モ モ へ の 適 応 が な い た め 、ブ ド ウ と モ モ を 狭 い 範 囲 で 栽 培 す る 山 梨 県 で は ド リ フ ト 等 に よ る 意 図 し な い 化 学 薬 剤 の 拡 散 が も た ら さ れ る 問 題 が あ る た め 、 こ の 当 時 ブ ド ウ へ の 使 用 は 極 力 避 け ら れ て い た （ 天 野 2008、 尾 崎 2013、 風 間 2010）。 し た が っ て 、CAA 殺 菌 剤 も こ れ ま で に 耐 性 菌 が 出 現 し た 他 の 化 学 薬 剤 と 同 様 に 、 化 学 薬 剤 散 布 に よ る 選 択 圧 の 増 加 が CAA 殺 菌 剤 耐 性 菌 の 増 加 の 一 因 で あ る と 推 定 さ れ た 。
5-3-2 遺 伝 子 診 断 法 に よ る CAA殺 菌 剤 耐 性 遺 伝 子 の 検 出 （2010～2012 年 ）
2010 年 の 生 育 シ ー ズ ン か ら CAA 殺 菌 剤 は ブ ド ウ 圃 場 に 散 布 さ れ 始 め 、2012 年 か ら 現 在 に 至 る ま で 山 梨 県 の 公 的 防 除 暦 に CAA 殺 菌 剤 は 掲 載 さ れ 、 散 布 を 推 奨 さ れ て き た 。 こ の よ う な 背 景 の も と 、2010 年 に お い て は 甲 州 市 40 サ ン プ ル 、 甲 府 市 40サ ン プ ル の 計 80サ ン プ ル を 、2011 年 に は 甲 州 市 19サ ン プ ル 、甲 府 市