MRGPRX2 アンタゴニストを用いた検証

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第一章にてMRGPRX2 を介したヒト結合組織型肥満細胞の活性化によって PGD2産生が誘導 されることをあきらかにし（Figure 14），また，エイコサノイドがMBPおよびECPによって肥満細胞か ら放出されることも報告されていることから（Piliponsky et al., 2001，2003，Patella et al., 1996），MBP

（99–110）およびECP（29–45）刺激によるヒト結合組織型肥満細胞のPGD2の産生とMRGPRX2ア ンタゴニストによる阻害作用を評価した。その結果，MBP（99－110）および ECP（29–45）はヒト結合 組織型肥満細胞のPGD2 de novo合成を誘導し（Figure 24A，24B），MRGPRX2アンタゴニストは MBP（99－110）およびECP（29–45）によるPGD2産生を阻害した（Figure 24A，24B）。

以上の結果より，MBPおよびECPのtryptase断片化ペプチドがMRGPRX2を介してヒト結合組 織型肥満細胞を活性化することが示唆された。

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Figure 21 MRGPRX2 アンタゴニストによる MBP（99－110）または ECP（29－45）刺激の

MRGPRX2活性化阻害

各濃度のMRGPRX2アンタゴニスト（compound 1, A: compound 2, B）存在下にてFura-2/AMを取 り込ませたMRGPRX2/HEK293細胞に30 μM MBP（99－110）（A）またはECP（29－45）（B）にて

刺激後の340 nmの励起光で励起した際の510 nmの蛍光強度と，380 nmの励起光により励起し

た際の510 nmの蛍光強度の比を指標に細胞内Ca²⁺濃度を測定した。各ペプチド刺激のみによる

細胞内Ca²⁺濃度上昇を100%として，各濃度の化合物存在下での上昇比率を算出した。データは 3回測定して平均値とSDを算出した（基となるデータはページ127に記載）。

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Figure 22 MRGPRX2 アンタゴニストによるMBP（99－110）または ECP（29－45）刺激ヒト結合組 織型肥満細胞の脱顆粒誘導阻害

各濃度のMRGPRX2アンタゴニスト（compound 1, 2）存在下にてヒト結合組織型肥満細胞に10 μM

MBP（99－110）（A）または ECP（29－45）（B）を添加し，30 分後の培養上清を回収して培養上清

中に遊離した顆粒中に含まれる β-hexosaminidase 活性を指標にして脱顆粒誘導を測定した。化 合物非存在下でリガンドのみ添加時の脱顆粒誘導を 100%として，各濃度の化合物存在下におけ る脱顆粒誘導の比率を算出した。データは 3回測定して平均値と SDを算出した（基となるデータ はページ128に記載）。

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Figure 23 PTX前処置によるMRGPRX2リガンドのヒト結合組織型肥満細胞の脱顆粒誘導阻害

PTX（100 ng/mL）をヒト結合組織型肥満細胞に添加してCO2インキュベーターを用いて37℃で18 時間培養し，洗浄後，10 μM MBP（99－110）またはECP（29－45）を添加し，30分後の培養上清 を回収して培養上清中に遊離した顆粒中に含まれるβ-hexosaminidase 活性を指標にして脱顆粒 誘導を測定した。肥満細胞内の全β-hexosaminidase活性を100%とし，培養液中に放出された

β-hexosaminidase活性の比率を算出した。データは3回測定して平均値とSDを算出した（基となる

データはページ129に記載）。

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Figure 24 MRGPRX2アンタゴニストによるヒト結合組織型肥満細胞のPGD2産生阻害

10 μM MRGPRX2アンタゴニスト（compound 1，2）存在下でヒト結合組織型肥満細胞に各濃度の MBP（99－110）（A）またはECP（29－45）（B）を添加し，30分後の培養上清を回収して培養上清 中に含まれるPGD2量をELISAにて測定した。データは3回測定して平均値とSDを算出した

（基となるデータはページ130-131に記載）。

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