MRGPRX2 アンタゴニストによる肥満細胞活性化阻害

複数のMRGPRX2リガンドで刺激したヒト結合組織型肥満細胞の脱顆粒に対するMRGPRX2ア ンタゴニスト（compound 1および2）の阻害作用を検討した。Compound 1および2の両化合物とも

SP，SPA および PACAP（6-27）刺激のヒト結合組織型肥満細胞脱顆粒を用量依存的に阻害した

（Figure 12A）。MRGPRX2アンタゴニストによる脱顆粒阻害作用が，ヒト結合組織型肥満細胞にお

ける脱顆粒過程の基本メカニズムに作用した結果であるかを判断するために，塩基性ペプチド以 外の刺激によるヒト結合組織型肥満細胞の脱顆粒反応に対する MRGPRX2アンタゴニストの影響 を検討した。まず，細胞内 Ca²⁺濃度を強制的に上昇させて受容体非依存的な脱顆粒反応を誘導 する Ca²⁺イオノフォア（A23187）を MRGPRX2 アンタゴニスト存在下にてヒト結合組織型肥満細胞 に作用させたが，MRGPRX2 アンタゴニストは脱顆粒反応を阻害しなかった（Figure 12A）。 同様 に，IgEプライミングしたヒト結合組織型肥満細胞にMRGPRX2アンタゴニスト存在下でIgEにて刺 激したが，何れのアンタゴニストとも脱顆粒反応を阻害しなかった（Figure 12B）。また，McNeil ら はmorphineやbradykinin B2 receptorアンタゴニストであるicatibantがヒト肥満細胞を活性化（薬 物誘発偽アレルギー反応）することを報告している（McNeil et al., 2015）。そこで，MRGPRX2アン タゴニスト存在下で30 μM icatibantにてヒト結合組織型肥満細胞を刺激したところ，両MRGPRX2 アンタゴニストはicatibant 刺激による脱顆粒反応を用量依存的に阻害した（Figure 13）。以上の結 果より，basic secretagogueおよび薬剤によるIgE非依存的なヒト結合組織型肥満細胞の脱顆粒反

応はMRGPRX2アンタゴニストによって制御できることが明確になった。

肥満細胞が活性化されると，ヒスタミン等の貯蔵された炎症関連メディエーター放出と，脂質由 来物質がde novo合成される（Metcalfe et al., 1997）。Benyonらは，SP刺激によって肥満細胞にお けるPGD2等のエイコサノイドのde novo合成が誘導され，エイコサノイドが放出されることを報告し ている（Benyon et al., 1989）。そこで，ヒト結合組織型肥満細胞を SP にて刺激し，培養上清中の PGD2量を評価した。なお，無刺激のヒト結合組織型肥満細胞溶解液中の PGD2量は，無刺激ヒト

~ 35 ~

結合組織型肥満細胞の培養上清と同様に検出限界値付近であったことから，SP 刺激によって上 清中に放出されたPGD2はヒト結合組織型肥満細胞でde novo合成されたものと判断した。SPはヒ ト結合組織型肥満細胞によるPGD2 de novo合成を誘導し，両MRGPRX2アンタゴニストによって 阻害された（Figure 14）。この結果より，MRGPRX2 の活性化は，ヒト結合組織型肥満細胞の脱顆 粒を誘導するだけではなく，PGD2のde novo合成を誘導することが示唆された。

MRGPRX2アンタゴニストの生体活性を評価するためには，マウス等のin vivo試験が必要であ

る。まず，取得した MRGPRX2 アンタゴニストが初代培養マウス肥満細胞にも作用するかを検討し た。その結果，SPA およびPACAP（6-27）は用量依存的に初代培養マウス肥満細胞の脱顆粒を誘 導したが（Figure 15A），MRGPRX2 アンタゴニストはSPA およびPACAP（6-27）刺激したマウス肥 満細胞の脱顆粒を阻害しなかった（Figure 15B）。取得した MRGPRX2アンタゴニストは SPA およ びPACAP（6-27）が作用するヒトMRGPRX2と相同機能のマウスGPCR（以後、マウスカウンターパ ートと記す）には作用しないと判断し，MRGPRX2アンタゴニストを用いたin vivo評価は断念した。

今後，short hairpin RNA法などを用いてヒトMRGPRX2のマウスカウンターパートを絞り込み，ヒト

MRGPRX2 とそのマウスカウンターパートの両方を阻害できるアンタゴニストを探索して，そのアン

タゴニストを用いてin vivo試験による生体活性評価を実施する必要がある。

マウス等における in vivo での MRGPRX2 アンタゴニストの作用は検討できなかったが，

MRGPRX2 は神経原生炎症や薬物誘発偽アレルギー反応を引き起こす IgE 非依存的な肥満細

胞活性化を誘導する受容体であることが強く示唆された。

~ 36 ~

Figure 12 MRGPRX2アンタゴニストのヒト結合組織型肥満細胞の各脱顆粒誘導に対する作用

（A）各濃度の MRGPRX2 アンタゴニスト（compound 1，2）存在下でヒト結合組織型肥満細胞に 1 μM SP，SPAおよびPACAP（6-27）と0.3 μM A23187を添加した。（B）rhIL-4（1 ng/mL）およびhIgE

（0.5 μg/mL）にて 5 日間培養してプライミングしたヒト結合組織型肥満細胞を培地で 3 回洗浄し，

MRGPRX2アンタゴニスト（compound 1，2）存在下にて10 μg/mL抗IgE抗体を添加した。脱顆粒 は刺激30分後の培養上清を回収して培養上清中に遊離した顆粒中に含まれるβ-hexosaminidase 活性を指標にして脱顆粒誘導を測定した。化合物非存在下で刺激剤のみ添加時の脱顆粒誘導を 100%として，各濃度の化合物存在下における脱顆粒誘導の比率を算出した。データは 3 回測定 して平均値とSDを算出した（基となるデータはページ114-115に記載）。

~ 37 ~

Figure 13 MRGPRX2アンタゴニストによるヒト結合組織型肥満細胞の脱顆粒誘導阻害

各濃度のMRGPRX2アンタゴニスト（compound 1，2）存在下でヒト結合組織型肥満細胞に30 μM

icatibantを添加し，30分後の培養上清を回収して培養上清中に遊離した顆粒中に含まれる

β-hexosaminidase 活性を指標にして脱顆粒誘導を測定した。肥満細胞内の全β-hexosaminidase活 性を100%とし，培養液中に放出されたβ-hexosaminidase活性の比率を算出した。データは3回 測定して平均値とSDを算出した（基となるデータはページ116-117に記載）。

~ 38 ~

Figure 14 MRGPRX2アンタゴニストによるヒト結合組織型肥満細胞のPGD2産生阻害

10 μM MRGPRX2アンタゴニスト（compound 1，2）存在下でヒト結合組織型肥満細胞に各濃度の SPを添加し，30分後の培養上清を回収して培養上清中に含まれるPGD2量をELISAにて測定 した。データは3回測定して平均値とSDを算出した（基となるデータはページ118に記載）。

~ 39 ~

Figure 15 MRGPRX2リガンドによるマウス結合組織型肥満細胞の脱顆粒誘導（A）と

MRGPRX2アンタゴニストの作用（B）

（A）各濃度のSPおよびPACAP（6-27）刺激をマウス結合組織型肥満細胞に添加した。（B）各濃

度のMRGPRX2アンタゴニスト（compound 1，2）存在下でマウス結合組織型肥満細胞に100 μM

SP，PACAP（6-27）を添加した。脱顆粒は刺激30分後の培養上清を回収して培養上清中に含ま

れるβ-hexosaminidase 活性を指標にして脱顆粒誘導を測定した。（A）肥満細胞内の全

β-hexosaminidase活性を100%とし，培養液中に放出されたβ-hexosaminidase活性の比率を算出し た。（B）化合物非存在下で刺激剤のみ添加時の脱顆粒誘導を100%として，各濃度の化合物存 在下における脱顆粒誘導の比率を算出した。データは3回測定して平均値とSDを算出した（基と なるデータはページ119-120に記載）。

~ 40 ~