-KG6 の合成

(Boc/tfa)-K3-KG6（320 mg, 2.7 µmol）に対して「Boc基の脱保護」を行い、tfa-K3-KG6･

128TFAを得た（320 mg, 2.8 µmol, 101%）。

K3-KG6の調製

微量のtfa-K3-KG6に対して「tfa基の脱保護」を行い、K3-KG6･512TFAを得た。

表 4-5  α-Boc/ε-tfa 保護デンドリティックポリリジンの理論分৕量 

4-4-2  単分৕オリゴ核酸キャリアの合成とその基礎物性の評価  PEG-Kn-KG6の合成

PEG-KG6あるいは PEG-tfaKn-KG6（n = 1 ~3）の合成

KG6またはtKn-KG6 (0.48 µmol) と、PEG5K-NHS (310 mg, 61 µmol)、TEA (25 µl, 180 µmol) をDMF 5 mlに溶解し、室温で72時間揺とう攪拌してPEGを修飾した。tKn-KG6 については、Ac2O (200 µl, 2.1 mmol)、TEA (280 µl, 2.1 mmol) を添加してさらに2時間 振とうし、未反応の"アミノ基をアセチル化した。溶媒を留去した後、水に再溶解して

10 mlにメスアップした。うち未精製サンプル10 µlをGPCにて分析した。水を溶出溶

媒として、MWCO. 100,000の限外濾過膜で精製した。計1/5,000量まで濃縮と再分散を α-position ε-position withTFAsalt withoutTFAsalt

KG6 64NH2 64NH2 30,950 16,350

Boc-tfaK1-KG6 128Boc 128tfa 57,860

tfaK1-KG6 128NH2 128tfa 59,640 45,040

Boc-tfaK2-KG6 128Boc 256tfa 86,550

tfaK2-KG6 128NH2 256tfa 88,330 73,740

Boc-tfaK3-KG6 128Boc 384tfa 115,200

tfaK3-KG6 128NH2 384tfa 117,000 102,400 Numberoffunctionalgroup Mol.weight Entry

第４章  "/#!オルソゴナルデンドリティックポリリジンの合成とその応用

152

繰り返し、フィルタ濾過した後に、再度10 mlにメスアップした。10 µlを精製サンプル としてGPCにて分析し、残りを凍結乾燥してPEG-KG6あるいはPEG-tfaKn-KG6（n = 1

~ 3）を得た。

未精製サンプルと精製サンプルの GPC スペクトルから得た、質量濃度当たりの屈 折率変化を利用して、PEG導入率を算出した。例として、PEG-tfaK3-KG6の算出過程を 以下に示す。

1. 精製サンプルのGPCスペクトルのピーク面積値と分析対象分の質量から、目的物

の質量当たりの屈折率変化を算出した。

[GPC分析した精製サンプル] : 70.6 µg

[目的物に相当するピークの面積値] : 3.69 & 10⁶

[質量当たりの屈折率変化] : 3.69 & 10⁶ / 70.6 µg = 5.10 & 10⁴ µg^–1

2. GPC分析した未精製サンプルに含まれる、PEG及びtK3-KG6の質量を算出した。

[GPC分析した未精製サンプル中のPEG] : 102.8 µg [GPC分析した未精製サンプル中のtK3-KG6] : 16.4 µg

3. 「1」で求めた [質量当たりの屈折率変化] を利用して、未精製サンプル中の目的 物の質量を算出した。

[未精製サンプル中の目的物の量] : 3.84 & 10⁶ / 5.10 & 10⁴ µg^–1 = 75.2 µg

4. PEG修飾率には、以下の関係が成立する。

[修飾率] = ([未精製サンプル中の目的物の量] –[未精製サンプル中のtK3-KG6])

/ [未精製サンプル中のPEG]

「2」「3」で算出した各値を代入し、PEG導入率を算出した。

[PEG修飾率] = (75.2 µg – 16.4 µg) / 102.8 µg & 100 = 57.2 mol%

5. この値を利用して、PEGの本数、平均分子量、収率を算出した。

以上の計算結果に基づく各サンプルの収率は、PEG-KG6･57 TFA : 31%、PEG-tfaK1- KG6 : 58%、PEG-tfaK2-KG6 : 89%、PEG-tfaK3-KG6 : 94%であった。尚、世代による収率 の違いは、限外濾過膜の選択と実験手技上の問題であり、Vivaspin (Sartorius Stedim

Biotech 社) の利用により、90%程度の収率で回収可能である。尚、以下のGPC 測定条

件において、PEG修飾デンドリマーが約38分に、未反応PEGが約48分に溶出した。

GPC測定 

各サンプルをGPC bufferに希釈して測定した。条件は以下の通りである。

・カラム：TSK GEL G5000 PWXL + TSK GEL G6000 PWXL ※直列式

・溶出溶媒：0.5 M AcOH-AcNa buffer, 0.1 M NaNO3 pH 4.0（3&GPC buffer）

・流速：0.45 ml/min

・測定サンプル量：0.1 mg程度。

・備考：インジェクターループ体積の 1.5倍相当量（150 µl）をロードし、測定間の誤 差を低減させた。

PEG-Kn-KG6（n = 1 ~ 3）の合成

PEG-tfaK1-KG6 (100 mg, 0.20 µmol)、PEG-tfaK2-KG6 (130 mg, 0.30 µmol) または PEG-tfaK3-KG6 (190 mg, 0.40 µmol) に対して「tfa基の脱保護」を行い、PEG-K1-KG6･

128TFA (92 mg, 0.18 µmol, 88%)、PEG-K2-KG6･256TFA (120 mg, 0.27 µmol, 90%)、

PEG-K3- KG6･384TFA (190 mg, 0.41 µmol, 102%) を得た。

PEG-Kn-KG6と核酸の相互作用の評価・EtBr滴定実験

キャリアストック溶液の調製

キャリアストック溶液を以下の様に調製した。

表 4-6  キャリアストック溶液の濃度

EtBr滴定実験

dsDNAあるいはpDNA 0.3 µgとEtBr 0.125 µgを超純水42.5 µlに溶解し、5分間静 置した。キャリアストック溶液の段階希釈7.5 µlと300 mM NaCl水溶液50 µlを添加し、

15分間静置した。キャリアストック溶液の原液がC/A比32に対応する。プレートリー

ダーで530 nmの蛍光を測定した。dsDNA、pDNA及びキャリアを含まないサンプルを

ブランクとし、相対蛍光強度を算出した。

動的光散乱測定によるPEG-Kn-KG6と核酸の相互作用の評価・動的光散乱測定 動的光散乱測定

キャリアストック溶液を以下の様にdsDNAあるいはpDNAと混合して動的光散乱 を測定した。測定はHellma社の微量分析用セル（光路長3 mm、体積 50 µl）で行い、3 回の測定値の平均値とした。測定結果はIntensityに基づく分布で示した。

表 4-7  動的光散乱測定時の Carrier/DNA 溶液の調製表

Carrier PEG-KG6 PEG-K1-KG6 PEG-K2-KG6 PEG-K3-KG6

10 carriersol.(mg/ml) 26.6 16.6 6.91 4.97

C/Aૻ 16 8 4 2 1 0.5

Carriersol.(μl) 5 5 5 5 5 5

1.5MNaCl(μl) 5 5 5 5 5 5

[a]dsDNAorpDNA(μl) 40 40 40 40 40 40

※DNAweight(μg) 0.4 0.8 1.6 3.2 6.4 12.8

[a]事前に※のDNA含量となるように段階希釈したもの

第４章  "/#!オルソゴナルデンドリティックポリリジンの合成とその応用

154

PEG-Kn-KG6と核酸の相互作用の評価・ゲル電気泳動遅延実験

サンプル調製

0.04 µg/µl dsDNAまたはpDNA水溶液5 µlに、前述のキャリアストック溶液の段階

希釈5 µlを添加し、15分間静置した。キャリアストック原液がC/A比32に対応する。

20%ポリアクリルアミドゲル電気泳動 

10&TBE buffer (90 mM Tris-borate, 2 mM EDTA, pH 8.5)、2&ポリアクリルアミド溶液

（AAm/Bis = 19/1, 40% (w/v)）を作製した。10&TBE buffer 1 ml、2&ポリアクリルアミド 溶液 5 ml、超純水3.9 ml, TEMED 29 'l、20 wt% APS 50 µlを混合し、4℃で一晩冷却し て20%ポリアクリルアミドゲルを作成した。サンプル10 'lと0.05 wt% BPB溶液2 'l を混合してゲルにロードした。定圧電流 100 V を 60 分間印加して核酸を泳動した。

1&SYBR Gold TBE bufferに15 分間浸漬して核酸を染色し、UVゲルイメージャーで撮 像した。

アガロースゲル電気泳動

1& TAE buffer (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA, pH 8.5) に終濃度1 wt%または2.5

wt%のAgalose Sを加熱溶解した。型に導入し、室温で一晩冷却してアガロースゲルを

作製した。サンプル10 'lと6 & Orange G 2 'lを混合してゲルにロードした。定圧電流 100 Vを30分間印加して核酸を泳動した。1&SYBR Gold TAE bufferに15 分間浸漬して 核酸を染色し、UVゲルイメージャーで撮像した。

4-4-3  抗がん剤キャリアへの適৷とその特性の評価  DOX内包能の評価

PEG-KG6のアセチル化（アミノ基のアセチル化）

4-2-2にて作成したPEG-KG6･57TFA (110 mg, 0.30 µmol) をDMF 10 mlに溶解し、

Ac2O (140 µl, 1.5 mmol)、TEA (280 µl, 2.1 mmol) を添加して2時間振とうし、未反応の"

アミノ基をアセチル化した。MWCO. 10,000 の透析膜で透析精製し、凍結乾燥を経て PEG-KG6 (100 mg, 0.28 µmol, 92%) を得た。

PEG-pynK3-KG6の合成

Pyn-COOH (17 mg, 60 µmol), HOAt (18 mg, 120 µmol)、HATU (46 mg, 120 µmol) を DMF 3 mlに溶解した。さらにDIEA (50 µl, 270 µmol)、DMF 2 mlに溶解したPEG-K3- KG6･384TFA (38 mg, 0.081 µmol) を添加し、室温で72時間攪拌した。Ac2O (100 µl, 1.1 mmol)、TEA (200 µl, 1.4 mmol) を添加してさらに2時間攪拌し、未反応の"アミノ基を アセチル化した。DMF を溶出溶媒とし、MWCO. 70,000 の限外濾過膜で精製した。計

1/10,000 量まで濃縮と再分散を繰り返した後、溶出溶媒を水に変更してDMFを除去し

た。凍結乾燥を経てPEG-pynK3-KG6を得た。質量増分よりpynの修飾率は45% ~ 100%

であると考えられる。簡単のため、全ての反応点がpyn化されたと仮定して以後の検討 に使用した (40 mg, 0.076 µmol, 94%)。

PEG-AcK3-KG6の合成

PEG-K3-KG6･384TFA (20 mg, 0.043 µmol) に対して「アミノ基のアセチル化」を 行い、PEG-AcK3-KG6 (19 mg, 0.043 µmol, 100%) を得た。

DOX の内包 

DOX･HCl (20 mg, 34 µmol) をDMSO 20 mlに溶解し、TEA (10 µl, 69 µmol) を添加 して 1 mg/ml DOX baseを調製した。1 mg/ml DOX base 2.5 mlと 5 mg/mlに調製した各

キャリアDMSO溶液2.5 mlを混合し、室温で3時間静置した。MWCO. 1,000の透析膜

で24時間透析し、内包されていないDOXを除去した。途中、0.5、1.5、3、5時間後に 外水相を交換した。凍結乾燥を経てDOX内包キャリアを得た。

内包 DOX量の定量

各DOX内包キャリアをDMSO 1 mlに溶解し、495 nmにおけるDOXの吸収スペク トルを測定した。モル吸光係数#495 nm, DMSO = 8,030として、内包DOX量を定量した。

PEG/PR-tfaK3-KG6の合成

未反応点のアセチル化を行わない事を除き、「PEG-tfaKn-KG6（n = 1 ~ 3）の合成」

と同様にしてtfaK3-KG6･128TFA (51 mg, 0.43 µmol)をPEG修飾した。GPC測定の結果か ら、目的物は平均分子量515,000、PEG導入本数82であった。凍結乾燥を経て、PEG-tfaK3- KG6･36TFAを得た (220 mg, 0.42 µmol, 98%)。carboxy-PROXYL (0.074 mg, 0.4 µmol)、

HOBt･H2O (0.061 mg, 0.4 µmol)、HBTU (0.15 mg, 0.4 µmol) をDMF 16 µlに溶解した。さ らにTEA (6 µl, 4 µmol)、DMF 1 mlに溶解させたPEG-tfaK3- KG6･36TFA (9.3 mg, 0.018

µmol) を添加し、室温で48時間攪拌した。微量のAc2Oを添加してさらに2時間攪拌し、

未反応の"アミノ基をアセチル化した。MWCO. 10,000の透析膜で透析精製し、凍結乾

燥を経てPEG/PR-tfaK3-KG6を得た (8.1 mg)。

PEG/PR-tfaK3-KG6の ESRスペクトル測定

水に溶解して3.0 mg/ml PEG/PR-tfaK3-KG6に調製し、セル厚1.0 mmのディスポー サブル偏平セルを用いて、修飾したPRのESRスペクトルを測定した。装置の測定条件 は、以下の通りである。

・ 装置：Bruker EMX-Plus ESR spectrometer

・ パラメータ・・・Microwave frequency : 9.8 GHz、Microwave Power : 0.502 mW、center field : 3511 G, sweep width : 100 G, receiver gain : 3.99 10³, modulation frequency : 100 KHz, modulation amplitude : 1 G, time constant : 10.24 msec, conversion time : 24 msec

CDDP担持能の評価

PEG-Kn-KG6（n = 1 ~ 3）のカルボキシル誘導体の合成

PEG-Kn-KG6（n = 1 ~ 3, 0.1 µmol）とεアミノ基に対して50 等量の無水コハク酸あ

るいはcis-アコニット酸を10 mlのDMFに溶解し、εアミノ基に対して100等量のTEA

を添加して4時間攪拌した。Kaiserテストが陰性である事から、反応の終結を確認した。

MWCO. 50,000の透析膜で4日間透析した。1、2日目は0.5 wt% NaHCO3/waterを外水

第４章  "/#!オルソゴナルデンドリティックポリリジンの合成とその応用

156

相に透析を行い、カルボン酸加水分解物を除去した。3、4日目は外水相を0.05% TEA/

waterに変更して脱塩した。凍結乾燥を経てTEA塩として目的物を得た。具体的な仕込

み量及び収量・収率は以下の通りである。

表 4-8  PEG-Kn-KG6（n = 1 ˜ 3）のカルボキシル化誘導体の仕込み及び収量

PEG-Kn-KG6（n = 1 ~ 3）のカルボキシル化誘導体への CDDPの担持

PEG-Kn-KG6（n = 1 ~ 3）のコハク酸の誘導体をカルボキシル基濃度2 mM、cis-ア コニット酸の誘導体をカルボキシル基濃度4 mMとなるように調製し、CDDPキャリア ストック水溶液とした。2.2 mM CDDP水溶液1.5 mlとキャリアストック溶液1.5 mlを 混合し、37℃で72時間インキュベートした。0.05% TEA水溶液を溶出溶媒とし、MWCO.

10,000の限外濾過膜で精製した。計1/10,000量まで濃縮と再分散を繰り返し、未結合の

CDDPを除去した。フィルタ濾過した溶液を凍結乾燥し、CDDP担持キャリアを得た。

ICP-MS 測定

各サンプルは0.1% HNO3で希釈して終濃度50 ppb以下に調整し、内部標準として

終濃度10 ppbの硝酸タリウムを添加して測定した。測定条件は以下の通りである。

・測定機種：Agilent 7500c

・測定メソッド：Pt-Tl ※10~50 ppb付近の検出用にプログラムを調整した。

CDDP担持 PEG-sucK2-KG6、PEG-cacK2-KG6の動的光散乱測定

0.75 mg/ml CDDP担持PEG-sucK2-KG6あるいは1.4 mg/ml CDDP担持PEG-cacK2- KG6 45 µlと1.5 M NaCl 5 µlを混合し、動的光散乱を測定した。

cis-アコニット酸アミドの pH応答的切断の評価

PEG-sucK2-KG6あるいはPEG-cacK2-KG6キャリアストック溶液2 mlに、DMF 2 ml に溶解したTEMPO-NH2 (0.34 mg, 2 µmol) 及びWSC (1.9 mg, 10 µmol) を添加し、37℃

で一晩インキュベートした。DMFを溶出溶媒とし、MWCO. 7,000の限外濾過膜で精製

した。計 1/10,000 量まで濃縮と再分散を繰り返して未結合の TEMPO-NH2を除去し、

PEG-(TM)sucK2-KG6及びPEG-(TM)cacK2-KG6を得た。1 mlのDMF溶液として回収し た各サンプルを、100 mMクエン酸緩衝液 (pH 4.0) または100 mMリン酸緩衝液 (pH

tK_n-KG6 (mg)

Carboxylic

anhydride(mg) TEA(μl) (mg) (μmol) (%)

PEG-sucK₁-KG6 52.2 64 180 59.5 0.11 110

PEG-cacK1-KG6 52.2 100 180 61.0 0.11 110

PEG-sucK₂-KG6 43.6 128 360 59.6 0.13 129

PEG-cacK2-KG6 43.6 200 360 64.4 0.13 128

PEG-sucK3-KG6 46.8 192 540 57.0 0.12 120

PEG-cacK₃-KG6 46.8 300 540 54.6 0.10 102

[a]全てのアミノ基がカルボキシル化され、TEA塩として得られたと仮定。

Entry

Sourcesamplesandreagents Prodectyield^[a]

ドキュメント内 九州大学大学院システム生命科学府  システム生命科学専攻  (ページ 155-170)