DHX29 ATPase

122

最 も 強 力 な 活 性 を 示 し た 化 合 物 8 7 お よ び 8 8 を 光 学 分 割 し 、 そ れ ぞ れ の 光 学 活 性 体 (8 9 a -b お よ び 9 0 a - b) の プ ロ フ ァ イ ル を 評 価 し た ( Ta b l e 3 - 1 0 )。 ( 3S3 'R5 'S) -異 性 体 8 9 a お よ び 9 0 a が よ り 強 い 活 性 を 示 す 異 性 体 ( eu t o m e r ) で あ る こ と 、 活 性 が 弱 い 異 性 体 ( d i s t o m e r ) 8 9 b お よ び 9 0 b よ り も 3 0 0 0 倍 以 上 強 い 活 性 を 示 す こ と が 判 明 し た 。 E u t o m e r 8 9 a お よ び 9 0 a

は 、AT P a s eア ッ セ イ に お い てe I F 4 A 1 , e I F 4 A3 , お よ び D H X 2 9と い っ た 他 の ヘ リ カ ー ゼ に 対

し て 阻 害 活 性 を 示 さ ず 、 優 れ た B r r 2 選 択 性 を 有 し て い る こ と も 明 ら か と な っ た 。 ま た 、 化

合 物 8 9 a お よ び 9 0 a は 、 サ ブ マ イ ク ロ モ ー ラ ー の I C5 0値 で B r r 2の ヘ リ カ ー ゼ 活 性 を 阻 害 し

た (8 9 a: I C5 0 = 0 . 4 8 M お よ び 9 0 a: I C5 0 = 0 . 3 5 M , F i g u r e 3 - 9 )、 一 方 で d i s t o m e r 8 9 b お

よ び 9 0 b は 1 0 0 M の 化 合 物 濃 度 で も B r r 2 の ヘ リ カ ー ゼ 活 性 を 阻 害 し な か っ た 。 加 え て 、

化 合 物 8 9 a お よ び 9 0 a は 優 れ た 溶 解 性 と 膜 透 過 性 を 示 し た 。

T a b l e 3 - 1 0 . 光 学 活 性 体 8 9 a–b お よ び 9 0 a–b の 活 性 、 選 択 性 、 物 性 プ ロ フ ァ イ ル

Compound

Brr2

123

A) B)

F i g u r e 3 - 9 . 化 合 物 8 9 a お よ び 9 0 a の ヘ リ カ ー ゼ 阻 害 活 性 ( R N A u n w i n d i n g 阻 害 活 性)

( A ) B r r 2 の R N A ヘ リ カ ー ゼ 活 性 は 蛍 光 ラ ベ ル 化 し た R N A を 用 い て 測 定 し た 。 単 鎖 お よ び 二

本 鎖 R N A を 電 気 泳 動 で 分 離 し 、 バ ン ド の 蛍 光 シ グ ナ ル を 検 出 し た 。 化 合 物 8 9 a お よ び 9 0 a

の 用 量 依 存 的 な ヘ リ カ ー ゼ 阻 害 活 性 の 評 価 ( l a n e s 4–8 )、 ネ ガ テ ィ ブ コ ン ト ロ ー ル 8 9 b も し く は 9 0 b の 1 0 0 µ M で の 評 価 ( l a n e 9 )、 化 合 物 非 添 加 ( 1 0 0 % co n t r o l、l a n e 3 )、 酵 素 非 添 加 ( 0 % co n t r o l、l a n e 1 0 )、 二 本 鎖 R N A ( l a n e 1 )、 単 鎖 R N A ( l a n e 2 )、A T P 非 添 加 ( l a n e

1 1 ) ( B ) ヘ リ カ ー ゼ 活 性 に 対 す る 化 合 物 8 9 a お よ び 9 0 a のI C5 0値 は 、 バ ン ド の 蛍 光 シ グ ナ ル

強 度 を 検 出 し 、 阻 害 率 と し て グ ラ フ に プ ロ ッ ト す る こ と で 算 出 し た 。

124 3 . 2 評 価 化 合 物 の 合 成

< 4 , 6 -ジ ヒ ド ロ ピ リ ド[ 4 , 3 - d ]ピ リ ミ ジ ン- 2 , 7 ( 1 H , 3 H ) -ジ オ ン 誘 導 体>

化 合 物 5 1–5 4 の 合 成 を S c h e m e 3 - 1 に 示 し た 。 既 知 の 中 間 体 9 1 a ( W a l l a c e e t a l. , 2 0 0 6 ) お よ び 9 1 b ( K a i e t a l. , 2 0 1 2 ) を ア ジ ド 化 し 、 エ ス テ ル 基 を 加 水 分 解 し て ア ジ ド 酸 9 2 a お よ び 9 2 b を 得 た 。9 2 a お よ び 9 2 bの カ ル ボ キ シ 基 を W e i n r e b ア ミ ド ( N a h m e t a l. , 1 9 8 1 ) に 変 換 し 、 続 く L i A l H4 に よ る 還 元 に よ り ア ミ ノ ア ル デ ヒ ド 9 3 a–b を 得 た 。9 3 a–b と 9 4 a–b ( O g i n o e t a l. , 2 0 1 4 ) の 還 元 的 カ ッ プ リ ン グ 反 応 を 行 い 、 続 い て 1 , 1 ' -カ ル ボ ニ ル ジ イ ミ ダ ゾ

ー ル ( C D I ) で 処 理 す る こ と で 化 合 物 5 1, 5 2, お よ び 5 4 を 得 た 。 化 合 物 5 2の 環 状 ウ レ ア の 窒

素 原 子 を メ チ ル 化 し て 化 合 物 5 3へ と 誘 導 し た 。

S c h e m e 3 - 1 . 化 合 物 5 1–5 4 の 合 成 ^a

a R e a g e n t s a n d c o n d i t i o n s : ( a ) ( i ) N a N3, D M F , 5 5 ° C – 6 0 ° C ; ( i i ) L i O H · H2O , E t O H ( o r E t O H a n d T H F ) , H2O , r t , 7 1 % – 9 5 % f o r 2 s t e p s ; ( b ) ( i ) M e N H ( O M e ) · H C l , T3P , D I P E A , D M F , 0 ° C t o r t ; ( i i ) L i A l H4, T H F , 0 ° C t o r t , 2 4 % f o r 2 s t e p s ; ( c ) ( i ) M e N H ( O M e ) · H C l , E D C · H C l , H O B t , D I P E A , D M F , r t ; ( i i ) L i A l H4, T H F , 0 ° C , 5 8 % f o r 2 s t e p s ; ( d ) ( i ) 9 4 a o r 9 4 b, T i (i- P r O )4, T H F , 5 0 ° C , 1 6 h ; ( i i ) N a B H ( O A c )3, 5 0 ° C ; ( i i i ) C D I , D B U , T H F , r t , 6 % – 2 7 % f o r 3 s t e p s ; ( e ) N a H , M e I , D M F , 0 ° C t o r t , 7 3 % .

125

化 合 物 5 7–6 1の 合 成 を S c h e m e 3 - 2 に 示 し た 。 中 間 体 9 3 bを 市 販 の ア ミ ン 9 5 a お よ び 9 5 b と カ ッ プ リ ン グ し 、C D I で 処 理 す る こ と で 化 合 物 5 7 お よ び 9 6を 得 た 。 化 合 物 9 6 の p -メ ト キ シ ベ ン ジ ル 基 を T F A 処 理 に よ り 除 去 し 、 続 く ア ル キ ル 化 反 応 に よ り 化 合 物 5 8, 5 9, お よ び 6 0 を 得 た 。 塩 化 ス ズ と ポ リ メ チ ル ヒ ド ロ シ ロ キ サ ン ( P M H S ) を 用 い た 9 3 b と 9 5 c の 還 元 ア ミ ノ 化 反 応 、 続 く C D I 処 理 に よ る 閉 環 反 応 に よ り 化 合 物 6 1を 得 た 。

S c h e m e 3 - 2 . 化 合 物 5 7–6 1 の 合 成 ^a

a R e a g e n t s a n d c o n d i t i o n s : ( a ) ( i ) 9 5 a o r 9 5 b, T i (i- P r O )4, T H F , 5 0 ° C , 1 6 h ; ( i i ) N a B H ( O A c )3, 5 0 ° C ; ( i i i ) C D I , D B U , T H F , r t , 3 4 % – 6 7 % f o r 3 s t e p s ; ( b ) T F A , a n i s o l e , r t , q u a n t . ; ( c ) 9 8 a o r 9 8 b, K2C O3, D M F , r t , 1 3 % – 3 6 % ; ( d ) 9 8 c, K2C O3, K I , N M P , r t , 2 7 % ; ( d ) ( i ) 9 5 c, P M H S , S n C l2· M e O H , r t , 3 1 % ; ( i i ) C D I , D B U , T H F , r t , 8 1 % .

126

<ス ピ ロ[イ ン ド ー ル- 3 , 2 ’ -ピ ロ リ ジ ン] - 2 ( 1 H ) -オ ン 誘 導 体>

化 合 物 5 0 お よ び 7 0–8 6 の 合 成 を S c h e m e 3 - 3 に 示 し た 。 複 雑 な ス ピ ロ 環 構 造 を 有 す る こ れ ら の 誘 導 体 は 、 立 体 選 択 的 な 三 成 分 反 応 ( R e h n e t a l. , 2 0 0 4 ) と 続 く ピ ロ リ ジ ン 環 窒 素 原 子 の ア シ ル 化 反 応 に よ り 効 率 的 に 合 成 で き る 。 イ サ チ ン 誘 導 体 9 9 a – g, ア ク リ ル 酸 メ チ ル, お よ び D L -ア ミ ノ 酸 の 三 成 分 反 応 に よ り ラ セ ミ 体 ( 3S^*3 'R^*5 'S^*) の 中 間 体 1 0 0 a – iを 得 た 。 続 い て 、 ピ ロ リ ジ ン 環 1 ' 位 を 様 々 な 条 件 で ア シ ル 化 し て 化 合 物 5 0, 7 0 お よ び 7 2 – 8 6を 得 た 。 化 合 物

7 1 は 、1 0 0 a と ピ リ ジ ン- 2 -カ ル バ ア ル デ ヒ ド の 還 元 ア ミ ノ 化 反 応 に よ り 合 成 し た 。 合 成 し た

化 合 物 の 構 造 が 比 較 的 複 雑 で あ る た め 、 一 部 の 化 合 物 (7 2, 7 3 お よ び 7 1) に 関 し て は 、 一 般

的 な N M Rと M Sに よ る 分 析 に 加 え 、 単 結 晶 X 線 構 造 解 析 に よ り 構 造 を 確 認 し た 。

127 S c h e m e 3 - 3 . 化 合 物 5 0 お よ び 7 0–8 6 の 合 成 ^a

a R e a g e n t s a n d c o n d i t i o n s : ( a ) m e t h y l a c r y l a t e , D L - l e u c i n e ( f o r 1 0 0 a, 1 0 0 b, a n d 1 0 0 e–i) o r D L -a l -a n i n e ( f o r 1 0 0 c) o r D L - p h e n y l a l a n i n e ( f o r 1 0 0 d) , T H F – H2O , r e f l u x , 4 2 – 8 7 % ; ( b ) c o r r e s p o n d i n g a c i d c h l o r i d e s , D I P E A , T H F , 0 ° C t o r t , 1 9 – 9 6 % ; ( c ) 1 - m e t h y l - 1H- i m i d a z o l e - 2 - c a r b o x y l i c a c i d , H A T U , D I P E A , D M F , 9 0 ° C , 3 1 % ; ( d ) 1 - m e t h y l - 1H- i m i d a z o l e - 4 - c a r b o x y l i c a c i d , P y B r o P ( F r é r o t e t a l. , 1 9 9 1 ) , D I P E A , D M A , 1 0 0 ° C , 7 2 % ; ( e ) ( i ) 1 - t r i t y l - 1H- i m i d a z o l e - 4 - c a r b o x y l i c a c i d , 1 -c h l o r o -N,N, 2 - t r i m e t h y l - 1 - p r o p e n y l a m i n e ( D e v o s e t a l. , 1 9 7 9 ) , D I P E A , T H F , 0 ° C t o r t ; ( i i ) T F A , M e C N – H2O , 0 ° C , 3 1 % f o r 2 s t e p s ; ( f ) 1 - b e n z y l - 1H- i m i d a z o l e - 4 - c a r b o x y l i c a c i d , P y C l U ( C o s t e e t a l. , 1 9 9 1 ) , D I P E A , D M A , 8 0 ° C , 5 6 % ; ( g ) p y r i d i n e - 2 - c a r b a l d e h y d e , N a B H ( O A c )3, A c O H , M e O H , 0 ° C t o r t , 5 7 % .

128

化 合 物 6 2 a–b お よ び 6 3 a–b は 、S c h e m e 3 - 4 に 示 し た 方 法 で 合 成 し た 。 ラ セ ミ 体 5 0 を 、 キ ラ ルH P L Cに よ り 光 学 分 割 し 、 エ ナ ン チ オ マ ー 6 2 a ( 3S3 'R5 'S) お よ び6 2 b ( 3R3 'S5 'R) を そ れ ぞ れ 得 た 。 化 合 物 の 絶 対 立 体 配 置 はX線 結 晶 構 造 解 析 に よ り 確 認 し た 。 ま た 化 合 物 5 0 の3 ’ 位 を ナ ト リ ウ ム メ ト キ シ ド を 用 い て 異 性 化 さ せ 、 キ ラ ルH P L Cに よ り 光 学 分 割 し 、 エ ナ ン チ オ マ ー6 3 a ( ( + ) - ( 3S^*3 'S^*5 'S^*) ) お よ び 6 3 b ( ( − ) - ( 3S^*3 'S^*5 'S^*)) を 得 た (こ れ ら の 化 合 物6 3 aお よ

び6 3 bの 絶 対 立 体 配 置 は 未 決 定 で あ る)。

S c h e m e 3 - 4 . 化 合 物 6 2 a–b お よ び 6 3 a–b の 合 成^a

a R e a g e n t s a n d c o n d i t i o n s : ( a ) c h i r a l H P L C , 9 8 % t o q u a n t . ; ( b ) ( i ) N a O M e , M e O H , 5 0 ° C ; ( i i ) c h i r a l H P L C , 1 4 – 1 5 % f o r 2 s t e p s .

129

化 合 物 6 4–6 9 は 、S c h e m e 3 - 5 に 示 し た 様 に 合 成 し た 。 イ サ チ ン9 9 a、 ア ク リ ル 酸 t e r t-ブ チ ル 、D L -ロ イ シ ン の 三 成 分 反 応 に よ り 中 間 体 1 0 1 を 立 体 選 択 的 に 得 た 。 続 い て 、t e r t-ブ チ ル 基 をT F Aを 用 い て 除 去 す る こ と で 、 カ ル ボ ン 酸 6 4 へ と 誘 導 し 、 さ ら に ア ミ ド 化 に よ り カ ル ボ キ サ ミ ド 6 5 を 得 た 。 化 合 物 5 0 の エ ス テ ル 基 をN a B H4 と C a C l2を 用 い て 還 元 し 、 ア ル コ ー ル 体 6 6 を 得 た 、 続 く 脱 酸 素 的 フ ッ 素 化 反 応 に よ り 化 合 物 6 7 へ と 誘 導 し た 。 ま た 化 合 物 6 6 を メ シ ル 化 お よ び 続 く ク ロ ロ 化 反 応 に 付 す こ と に よ り 、 ク ロ ラ イ ド 6 8 へ と 誘 導 化 し た 。 化 合 物 6 9 は 、5 0 の エ ス テ ル 基 の 還 元 、 得 ら れ た ア ル コ ー ル の メ シ ル 化 、 ヨ ウ 素 化 、 お よ び P d ( e n ) (H a t t o r i e t a l. , 2 0 0 0 ; S a j i k i e t a l. , 1 9 9 8) を 用 い た 還 元 的 脱 ヨ ウ 素 化 (F e n g e t a l., 2 0 1 4 ; S e i j a s e t a l. , 1 9 9 2) の4工 程 に よ り 合 成 し た 。 鍵 と な る 化 合 物 (6 6 お よ び 6 9) の 構 造 に 関 し て は 、X 線 結 晶 構 造 解 析 に よ り 確 認 し た 。

S c h e m e 3 - 5 . 化 合 物 6 4–6 9 の 合 成 ^a

a R e a g e n t s a n d c o n d i t i o n s : ( a ) ( i ) t e r t- b u t y l a c r y l a t e , D L - l e u c i n e , T H F – H2O , 6 0 ° C , 6 0 % ; ( i i ) p y r i d i n e - 2 - c a r b o n y l c h l o r i d e h y d r o c h l o r i d e , D I P E A , T H F , 0 ° C t o r t , 7 1 % ; ( b ) ( i ) T F A , r t ; ( i i ) 4 M H C l i n E t O A c , r t , 7 6 % f o r 2 s t e p s ; ( c ) E D C · H C l , H O B t · N H3, D I P E A , D M F , r t , 7 7 % ; ( d ) N a B H4, C a C l2, E t O H , 0 ° C t o r t , 9 7 % ; ( e ) b i s ( 2 - m e t h o x y e t h y l ) a m i n o s u l f u r t r i f l u o r i d e ( S i n g h e t a l. , 2 0 0 2 ) , T H F , 0 ° C t o r t , 2 2 % ; ( f ) ( i ) M s C l , E t3N , T H F , 0 ° C ; ( i i ) L i C l , D M F , 1 0 0 ° C , 4 3 % f o r 2 s t e p s ; ( g ) ( i ) M s C l , E t3N , T H F 0 ° C ; ( i i ) L i I , D M F , 1 0 0 ° C ; ( i i i ) H2, P d / C ( e n ) , a q . N a H C O3, M e O H – T H F , r t , 5 4 % f o r 3 s t e p s .

130

化 合 物 8 7–8 8, 8 9 a–b, お よ び 9 0 a–b は 、 以 下 の 方 法 で 合 成 し た ( S c h e m e 3 - 6 )。 化 合 物 8 4 お よ び 8 6 の エ ス テ ル 基 を 、 化 合 物6 9 と 同 様 に し て メ チ ル 基 に 変 換 し た (8 7–8 8)。 続 い て 、 化 合 物 8 7 お よ び 8 8 を 光 学 分 割 し 、 エ ナ ン チ オ マ ー 8 9 a–b お よ び 9 0 a–b を そ れ ぞ れ 得 た 。 こ れ ら の 化 合 物 の 絶 対 立 体 配 置 は X線 結 晶 構 造 解 析 に よ り 決 定 し た 。

S c h e m e 3 - 6 . 化 合 物 8 7–8 8, 8 9 a–b お よ び 9 0 a–bの 合 成 ^a

a R e a g e n t s a n d c o n d i t i o n s : ( a ) ( i ) N a B H4, C a C l2, E t O H , 0 ° C t o r t ; ( i i ) M s C l , E t3N , T H F – D M A , 0 ° C ; ( i i i ) L i I , D M A , 1 0 0 ° C ; ( i v ) H2, P d / C ( e n ) , a q . N a H C O3, M e O H – T H F , r t , 5 3 – 6 0 % f o r 4 s t e p s ; ( b ) c h i r a l H P L C o r S F C , 4 2 – 4 5 % .

131 3 . 3 結 論

筆 者 は R N A 依 存 A T P a s e ア ッ セ イ 、 共 結 晶 構 造 解 析 、S B D D を 駆 使 す る こ と で 、 強 力 か つ 選 択 的 な B r r 2 阻 害 剤 4 , 6 -ジ ヒ ド ロ ピ リ ド[ 4 , 3 -d]ピ リ ミ ジ ン- 2 , 7 ( 1H, 3H) -ジ オ ン 誘 導 体 6 0 を 見 出 し た 。 ま た 、 構 造 的 に 異 な る ス ピ ロ[イ ン ド ー ル- 3 , 2 ’ -ピ ロ リ ジ ン] - 2 ( 1H) -オ ン 誘 導 体 に 関 し て も 最 適 化 を 行 い 、 よ り 強 力 な B r r 2阻 害 活 性 お よ び 優 れ た 選 択 性 を 示 す 8 9 a お よ び 9 0 a を 見 出 し た 。 化 合 物 6 0、8 9 a お よ び 9 0 a は 、 マ イ ク ロ モ ー ラ ー か ら サ ブ マ イ ク ロ モ ー ラ ー の 化 合 物 濃 度 で B r r 2 の ヘ リ カ ー ゼ 活 性 を 阻 害 す る 。 こ れ ら の 化 合 物 は 活 性 お よ び 選 択 性 に 優 れ る だ け で な く 、 良 好 な 物 性 プ ロ フ ァ イ ル も 示 す こ と か ら 、B r r 2 の 分 子 プ ロ ー ブ 創 出 の た め の 優 れ た 出 発 点 と な り 得 る 。

ま た 、 冒 頭 で 述 べ た よ う に 、B r r 2 阻 害 剤 は ス プ ラ イ シ ン グ 変 異 を 有 す る 癌 種 に 対 し て 合 成 致 死 を 誘 導 す る 薬 剤 と な る 可 能 性 や A M L 患 者 の 白 血 病 細 胞 膜 上 に 発 現 し た U 5 - B r r 2 複 合 体 を タ ー ゲ ッ テ ィ ン グ す る の に 利 用 で き る 可 能 性 が あ り 、 筆 者 の 見 出 し た 知 見 や 化 合 物 は B r r 2 を 標 的 と し た 抗 癌 剤 の 研 究 の 礎 に な る と 考 え て い る 。

132 3 . 4 実 験 の 部

B i o l o g y

P r e p a ra t i o n o f e n z y m e s . T h e h u m a n r ec o m b i n an t f u l l - l en g t h B r r 2 a n d f u l l - l en g t h D H X 2 9 w e r e ex p r e s s e d i n S f - 9 i n s e c t c e l l s a s f u s i o n p r o t e i n s w i t h H i s o r F L A G - H i s t a g s a t t h e N t e r m in u s , u s i n g t h e B a c u lo D i r e c t C - t e r m B a c u lo v i r u s e x p r e s s i o n s y s t e m ( T h e r m o F i s h e r S c i e n t i f i c ) . H i s - B r r 2 a n d H i s - F L A G - D H X 2 9 w e r e p u r i f i ed u s i n g N i - N T A s u p er f l o w a f f i n i t y c o lu m n a n d S u p er d ex 2 0 0 g e l - f i l t r a t i o n co l u m n . T h e h u m a n r e co m b i n an t p r o t e i n s , f u l l - l e n g t h eI F 4 A 3 , M L N 5 1 ( r e s i d u e s 1 3 7–2 8 3 ) , f u l l - l en g t h e I F 4 A 1 , f u l l - l e n g th e I F4 B , a n d e I F 4 G ( r e s i d u e s 7 1 2–1 4 5 1 ) w e r e e x p r e s s e d i n E s c h e r i c h i a c o l i B L 2 1 ( D E 3 ) a s f u s i o n p r o t e i n s w i t h 6 × H i s - S U M O o r H i s t ag s f o l l o w ed b y a T E V p r o t e a s e c l e a v ag e s i t e a t t h e N t e r m i n u s , an d p u r i f i c a t i o n u s i n g N i - N T A su p e r f l o w a f f i n i ty co l u m n ( Q I A G E N ) a n d S u p e r d ex 2 0 0 g e l - f i l t r a t i o n c o lu m n ( G E H e a l t h c ar e ) . T h e H i s - S U M O o r H i s t a g s w e r e c l e a v e d w i t h S U M O p r o t e a s e o r T E V p r o t e a s e . P r o t e i n co n c en t r a t i o n s w e r e d e t e r m i n e d u s i n g a B C A P r o t e i n A s s a y K i t ( T h er m o F i s h e r S c i e n t i f i c ) w i t h b o v i n e s e r u m a l b u m i n a s a s t a n d a r d .

R N A - d e p e n d e n t A T P a s e a s s a y . T h e R N A - d e p en d en t A T P a s e a s s a y w a s p e r f o r m ed u s i n g t h e A D P - G l o a s s a y s y s t e m ( P r o m e g a) . S i n g l e - s t r a n d e d R N A p o ly ( U ) w a s p u r ch a s e d f r o m M P B i o m e d i c a l s , L L C . T h e a s s a y b u f f er c o m p r i s e d 2 0 m M T r i s–H C l ( p H 7 .5 ) , 2 .5 m M M g C l2, 1 0 0 m M K C l , 1 m M d i th i o t h r e i t o l ( D T T ) , a n d 0 . 0 1 % ( v / v ) T w e en 2 0 . A f t e r th e a d d i t i o n o f 2 0 μ M A T P , 2 .5 μ g / m L p o l y ( U ) , a n d t e s t c o m p o u n d s , A T P a s e r e a c t i o n s w e r e s t a r t e d b y t h e a d d i t i o n o f 6 . 2 5 n M B r r 2 . T h e r e s u l t i n g m i x t u r e w a s i n c u b a t e d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 3 0 m i n , f o l lo w e d b y t e r m i n a t i o n o f th e en z y m a t i c r e a c t i o n s b y A D P - G l o r e ag e n t . F o l l o w i n g a d d i t i o n o f A D P - G l o d e t e c t i o n r e a g en t , lu m i n e s c e n t s i g n a l s w er e m e a s u r e d u s i n g a n E n V i s i o n 2 1 0 2 M u l t i l a b e l P l a t e R e a d e r ( P er k i n E l m er ) . W e d ef i n e d l u m i n e s c e n t s i g n a l s o f t h e r e a c t i o n w i t h o u t en z y m e a s 1 0 0 % in h i b i t o r y a c t i v i ty a n d t h o s e o f t h e co m p l e t e r e a c t i o n m i x t u r e a s 0 % i n h i b i t o r y a c t iv i t y . C u r v e f i t t i n g s a n d c a l c u l a t i o n s o f I C5 0 v a l u e s w e r e p e r f o r m e d u s i n g t h e p r o g r am X L f i t v er s i o n 5 ( I D B u s i n e s s S o l u t i o n s L t d . ) . F o r ev a l u a t i n g t h e s e l e c t i v i t y , w e a l s o co n d u c t e d an A T P a s e a s s a y o f eI F 4 A 1 , e I F 4 A3 , a n d D H X 2 9 . T o e n h a n c e A T P a s e a c t i v i t y f o r e I F 4 A , t h e e q u i v a l en t m o l a r

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c o n c e n tr a t i o n o f M L N 5 1 f o r 1 5 0 n M eI F 4 A 3 o r e I F 4 B an d e I F 4 G f o r 1 0 0 n M e I F 4 A1 o r e I F 4 A2 w e r e a d d e d . R e g ar d i n g t h e A T P a s e a s s a y s f o r D H X 2 9 , t h e o p t i m a l c o n c e n tr a t i o n s w e r e 6 .3 n M . C o n c e n t r a t i o n s o f A T P o r R N A w er e s e t a t t h e Km v a l u e o f e a ch s u b s t r a t e f o r e a c h e n zy m e a s f o l l o w s : 3 5 μ M A T P an d 1 . 5 μ g /m L p o l y ( U ) f o r e I F 4 A1 an d e I F 4 A3 , a n d 3 0 μ M A T P a n d 1 . 8 μ g / m L po l y ( U ) f o r D H X 2 9 . D e t e c t i o n o f l u m in e s c e n t s i g n a l s o r e s t i m a t i o n o f I C5 0 v a l u e s w a s p e r f o r m e d a s d e s c r i b ed a b o v e .

S u b s t r a t e - co m p e t i t io n a s s a y . A T P o r R N A c o m p e t i t i o n a s s a y s f o r B r r 2 w e r e p er f o r m e d u s i n g th e A D P - G l o a s s a y s y s t e m ( P r o m eg a ) . T h e e n zy m a t i c r e a c t i o n s w e r e p er f o r m e d u n d er i d e n t i c a l c o n d i t i o n s t o t h o s e u s e d f o r R N A - d e p en d en t A T P a s e a s s a y , e x c ep t f o r s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n s . A T P o r R N A c o n c en t r a t i o n s w e r e s e t a t th e Km v a l u e s— 2 5 μ M o r 2 . 5 μ g/ m L , r e s p e c t i v e ly—a n d 5 0 0 , 2 0 0 , o r 2 .5 μ M A T P a n d 5 0 μ g/m L o r 0 .2 5 μ g/m L p o l y ( U ) w er e u s ed t o e x am i n e A T P o r R N A co m p e t i t i v e i n h ib i t i o n . T h e en z y m a t i c r e a c t io n s w e r e p e r f o r m e d a t r o o m t e m p e r a tu r e f o r 3 0 m i n , ex c e p t f o r 4 5 m i n at 2 5 μ M A T P / 0 .2 5 μ g/ m L p o ly ( U ) . C u r v e f i t t i n g s a n d c a l c u l a t io n s o f I C5 0 v a l u e s w e r e p er f o r m e d , a s p r e v i o u s l y d e s c r ib e d i n t h e s e c t i o n o f R N A - d ep e n d e n t A T P a s e a s s a y .

R N A u n w i n d i n g a s s a y (H e l i c a s e a s s a y). R N A u n w i n d i n g a s s a y w e r e p er f o r m e d i n a n a s s a y b u f f e r c o n t a in i n g 4 0 m M T r i s–H C l ( p H 7 . 5 ) , 2 m M M g C l2, 3 0 m M N a C l , 1 m M D T T , a n d 0 .0 1 % ( v / v ) T w e e n 2 0 . D u p l ex R N A s w e r e g en e r a t e d u s i n g f l u o r e s c e n c e l a b e l e d 1 4

-m er ( 5 ' - [ F I T C ] - U U C C C C U G C A U A A C - 3 ') a n d 3 6 - m er ( 5

'-G U U A U '-G C A '-G '-G '-G '-G A A C C A A C '-G C A U A U C A '-G U '-G A '-G '-G A U U - 3 ') o l i g o R N A s ( L e d o u x e t a l., 2 0 1 6 ) p u r c h a s e d f r o m I n t e g r a t e d D N A T e ch n o lo g i e s , I n c . . T h e R N A s i n a s s a y b u f f e r ( 3 0 n M ) w e r e a n n e a l e d b y h ea t i n g a t 9 5 ° C f o r 5 m in a n d co o l i n g t o 4 ° C a t 0 . 1 ° C / s . H e l i c a s e a c t i v i t y w a s i n i t i a t e d w i t h 3 0 n M d u p l e x R N A s , 2 0 0 n M B r r 2 , an d 2 0 µ M A T P a t 3 7 ° C f o r 1 0 m i n . U n l ab e l e d 1 4 - m e r o l i g o R N A ( 1 . 5 µ M ; 5 ' - U U C C C C U G C A U A A C - 3 ') w a s i n c lu d e d t o c a p tu r e a n y f r e e 3 6 - m e r o l i g o R N A s . R e a c t i o n s w e r e t e r m i n a t e d w i t h 4 0 m M E D T A , 3 .2 % ( w / v ) S D S , a n d 4 0 % ( v /v ) g l y c e r o l . T h e r e ac t i o n s o l u t i o n s w e r e e l e c t r o p h o r e s e d u s i n g 1 5 % p o l y a c r y l a m i d e g e l ( A T T O ) a t 1 0 . 5 m V f o r 4 5 m in u n d er n a t iv e r u n n in g b u f f e r ( 2 5 m M T r i s a n d 1 9 2 m M g l y c i n e) . T h e f l u o r e s c e n t l y l a b e l e d R N A s w e r e v i s u a l i z e d u s i n g a T y p h o o n 9 4 0 0 ( G E H e a l t h c ar e ) . I n t e n s i t i e s o f s i n g l e - s t r an d e d

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R N A s a s p r o d u c t s o f t h e e n zy m a t i c r e a c t i o n w er e n o r m a l i z e d w i t h to t a l i n t en s i t i e s o f s i n g l e - an d d o u b l e - s t r a n d e d R N A s , a n d t h e b a c k g r o u n d w a s s u b t r a c t ed . W e d e f in e d f lu o r e s c e n t s i g n a l s o f t h e r e a c t i o n w i t h o u t e n z y m e a s 1 0 0 % i n h ib i t o r y a c t i v i t y , a n d t h o s e o f t h e co m p l e t e r e a c t i o n m i x t u r e a s 0 % i n h i b i t o r y a c t iv i t y . C u r v e f i t t i n g s a n d c a l c u l a t i o n s o f I C5 0 v a l u e s w er e p e r f o r m e d u s i n g t h e p r o g r am G r ap h f i t P r i s m v e r s i o n 5 .0 3 ( G r ap h P a d S o f t w ar e ) .

C r y s t a l l o g ra p h y

P r e p a ra t i o n o f p r o t e i n f o r c ry s t a l l o g r a p h y . T h e c D N A e n c o d i n g a m i n o a c i d r e s i d u e s 3 9 5 - 2 1 2 9 o f h u m a n S N R N P 2 0 0 / B r r 2 ( G e n B a n k A B 0 1 8 3 3 1 , G E H e a l t h ca r e) w a s a m p l i f i e d u s i n g t h e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n a n d e n g i n e e r e d w i t h a s e q u e n c e e n c o d i n g a n N -t e r m i n a l 6 × H i s f u s e d t o a r e c o g n i t i o n s i t e f o r t h e T E V p r o t e a s e . T h e c D N A e n c o d i n g B r r 2 w a s c l o n e d i n t o a m o d i f i e d p F a s t B a c 1 v e c t o r . R e c o m b i n a n t v i r u s w a s g e n e r a t e d u s i n g t h e B a c - t o - B a c b a c u l o v i r u s e x p r e s s i o n s y s t e m ( T h e r m o F i s h e r S c i e n t i f i c I n c . ) . P r o t e i n w a s e x p r e s s e d i n i n s e c t c e l l s ( S f 9 ) a n d c e l l s w e r e h a r v e s t e d 4 8 h p o s t - i n f e c t i o n . C e l l s w e r e i s o l a t e d b y b r i e f c e n t r i f u g a t i o n a n d p e l l e t s w e r e f r o z e n a n d s t o r e d a t −8 0° C.

T h e c e l l p e l l e t w a s t h a w e d a n d s u s p e n d e d i n b u f f e r c o m p o s e d o f 5 0 m M T r i s p H 8 . 0 , 5 0 0 m M N a C l , 1 0 % g l y c e r o l , 2 0 m M i m i d a z o l e ( b u f f e r c o m p o n e n t s w e r e r o u t i n e l y p u r c h a s e d f r o m S i g m a - A l d r i c h ) , a n d 0 . 5 m M T C E P ( T h e r m o F i s h e r S c i e n t i f i c I n c . ) s u p p l e m e n t e d w i t h E D T A - f r e e p r o t e a s e i n h i b i t o r s ( R o c h e , B a s e l , S w i t z e r l a n d ) . T h e c e l l s w e r e l y s e d b y b r i e f s o n i c a t i o n ( S o n i c s V i b r a - C e l l , S o n i c s a n d M a t e r i a l s , I n c . , N e w t o w n , C T , U S A ) a n d u s i n g a m i c r o f l u i d i z e r ( M i c r o f l u i d i c s M - 1 1 0 P , M i c r o f l u i d i c s C o r p . , W e s t w o o d , M A , U S A ) . T h e l y s a t e w a s c l a r i f i e d b y c e n t r i f u g a t i o n a n d t h e s u p e r n a t a n t w a s a f f i n i t y p u r i f i e d u s i n g N i c k e l - c h e l a t i n g r e s i n ( P r o b o n d , T h e r m o F i s h e r S c i e n t i f i c I n c . ) , f o l l o w e d b y e l u t i o n w i t h b u f f e r c o m p o s e d o f 5 0 m M T r i s p H 8 . 0 , 5 0 0 m M N a C l , 1 0 % g l y c e r o l , 2 5 0 m M i m i d a z o l e , a n d 0 . 5 m M T C E P . T h e N - t e r m i n a l 6 × H i s - t a g w a s r e m o v e d b y t r e a t m e n t w i t h T E V p r o t e a s e d u r i n g o v e r n i g h t d i a l y s i s i n b u f f e r ( 5 0 m M T r i s p H 8 . 0 , 5 0 m M N a C l , 1 0 % g l y c e r o l , a n d 0 . 5 m M T C E P ) a t 4 ° C . T h e p r o t e i n s o l u t i o n w a s p a s s e d o v e r a N i - a f f i n i t y c o l u m n a n d t h e f l o w-t h r o u g h w a s c o l l e c t e d , f o l l o w e d b y d i a l y s i s i n t o t h e f i n a l d e l i v e r y b u f f e r ( 2 0 m M T r i s p H 7 . 6 , 2 0 0 m M N a C l , a n d 1 m M T C E P ) . P r o t e i n s o l u t i o n w a s

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c o n c e n t r a t e d w i t h A m i c o n C e n t r i f u g a l F i l t e r s ( E M D M i l l i p o r e , B i l l e r i c a , M A , U S A ) t o 1 4 m g / m L . T h e c o n c e n t r a t e d p r o t e i n w a s i m m e d i a t e l y f l a s h f r o z e n w i t h l i q u i d n i t r o g e n i n 5 0 µL a l i q u o t s f o r s t o r a g e a t −8 0° C. P r o t e i n c o n c e n t r a t i o n w a s e s t i m a t e d u s i n g a N a n o D r o p i n s t r u m e n t .

C r y s t a l l i z a t i o n a n d X - ra y s t r u c t u r e a n a l y s i s . P r i o r t o c r y s t a l l i z a t i o n , th e p u r i f i ed B r r 2 w a s d i l u t e d to 1 0 m g / m L u s i n g d e l i v e r y b u f f e r ( 2 0 m M T r i s p H 7 . 6 , 2 0 0 m M N a C l , 1 m M T C E P ) , a n d c o m p l e x e s w e r e g e n e r a t ed b y a d d i t i o n o f s t o c k D M S O s o l u t i o n s o f l i g an d s t o t h e p r o t e in s o l u t i o n a t a f i n a l c o n c e n t r a t io n o f 1 m M ( t h e f i n a l D M S O c o n c en t r a t i o n s w e r e 1 0 % f o r c o m p o u n d 5 5, an d 1 % f o r c o m p o u n d 5 2 an d B r r 2 - c o m p o u n d 5 7) . A f t er a d d i t i o n o f c o m p o u n d s , t h e m i x t u r e w a s p l a c e d o n i c e f o r 3 0 m i n t o p r o m o t e c o m p l e x f o r m a t i o n . C r y s t a l l i z a t i o n o f B r r 2 w a s p e r f o r m ed u s i n g t h e h a n g in g d r o p v a p o r d i f f u s i o n m e th o d u s i n g a p u b l i s h e d p r o to c o l ( S a n t o s e t a l., 2 0 1 2 ) . B r i e f l y , t h e c r y s t a l l i z a t i o n w a s p er f o r m e d w i t h a r e s e r v o i r s o l u t io n co m p o s e d o f 0 . 1 M s o d i u m c i t r a t e ( p H 5 .0–5 . 3 ) a n d 1 . 2–1 . 6 M s o d i u m m a l o n a t e ( p H 7 . 0 ) ( H a m p t o n R e s e a r c h , A l i s o V i e j o , C A , U S A ) . C r y s t a l t r i a l s w e r e s e t u p a n d s t o r e d a t r o o m t e m p er a t u r e , w i th c r y s t a l s a p p e a r in g o v er n i g h t an d r e a ch i n g m a x i m u m s i z e a f t er o n e t o t wo w e e k s . C r y s t a l s w e r e h a r v e s t e d d i r e c t l y f r o m th e d r o p s ( w i t h th e h i g h c o n c e n t r a t i o n o f s o d i u m m a l o n a t e f u n c t i o n i n g a s a c r y o p r o t e c t a n t ) a n d f l a s h - co o l e d in t o A L S - s t y l e p u c k s s u b m e r g e d i n l iq u i d n i t r o g e n . D i f f r a c t io n d a t a w e r e c o l l e c t ed a t A d v an c e d L i g h t S o u r c e b ea m l i n e 5 . 0 . 2 ( c o m p o u n d 5 2) a n d 5 . 0 .3 ( co m p o u n d 5 7) ( L a w r e n c e B e r k e l e y ’ s N a t i o n a l L a b o r a t o r y , B e r k e l e y , C A ) a n d a t t h e D i a m o n d L i g h t S o u r c e b ea m l i n e I 0 4 ( D i d c o t, U K ) ( c o m p o u n d 5 5) . D i f f r a c t i o n d a t a w er e p r o c e s s e d w i t h X D S ( K a b s c h e t a l., 2 0 1 0 ) a n d A i m l e s s ( E v a n s e t a l. , 2 0 1 3 ) . T h e s t r u c tu r e s w e r e s o l v e d b y m o l e cu l a r r ep l a c e m e n t w i t h P h a s e r ( M c C o y e t a l. , 2 0 0 7 ) u s i n g t h e co o r d i n a t e s o f h u m a n B r r 2 ( P D B c o d e : 4 F 9 1 ) a s a s e a r c h m o d e l . T h e g r ap h i c s p r o g r am C O O T ( E m s l e y e t a l. , 2 0 0 4 ) w a s u s e d f o r m o d e l b u i l d i n g an d r e f i n e m en t w a s p e r f o r m ed w i t h R E F M A C 5 ( M u r s h u d o v e t a l. , 1 9 9 7 ) a n d P H E N I X ( Ad a m s e t a l., 2 0 1 0 ) . P h a s e r an d R E F M A C 5 a r e d i s t r i b u t e d a s p a r t o f C C P 4 ( C o l l a b o r a t i v e c o m p u t a t i o n a l p r o j e c t , N o . 4 , 1 9 9 4 ) . S t r u c tu r e v a l i d a t i o n w a s p e r f o r m ed u s i n g M o l p r o b i t y ( C h e n e t a l., 2 0 1 0 ) . X - r ay d if f r a c t i o n d a t a c o l l e c t i o n a n d r e f in e m e n t s t a t i s t i c s a r e r e p o r t e d i n T a b l e 3 - 1 1 , an d o m i t e l e c t r o n d e n s i t y f o r th e l i g a n d s a r e s h o wn i n F i g u r e 3 - 1 0 , 3 - 1 1 a n d 3 - 1 2 . T h e c o o r d in a t e s

136

o f th e th r e e c o - co m p l e x s t r u c tu r e s w e r e d ep o s i t e d in th e P D B u n d e r t h e a c c e s s i o n co d e s : 5 U R J , 5 U R K a n d 5 U R M co r r e s p o n d i n g t o c o m p l e x e s w i t h c o m p o u n d s 5 2, 5 7, an d 5 5, r e s p e c t iv e l y .

X - ra y d a t a co l l e c t i o n a n d r e f i n em e n t s t a t i s t i c s

T a b l e 3 - 1 1 . X - r ay d a t a c o l l e c t io n an d r e f i n e m e n t s t a t i s t i c s X - R a y s t r u c t u r e C o m p o u n d

5 2/ 5 U R J C o m p o u n d

5 7/ 5 U R K C o m p o u n d

5 5/ 5 U R M D a ta c o l l e c t i o n

R e s o l u t i o n r a n g e ( Å ) 4 8 . 4–2 .7 5 ( 2 .8 1–

2 . 7 5 ) 4 8 . 7–2 .9 5 ( 3 .0 3–

2 . 9 5 ) 2 9 . 5–2 .8 0 ( 2 .8 5–

2 . 8 0 )

S p a c e g r o u p C 1 2 1 C 1 2 1 P 1

C e l l d i m e n s i o n s :

a , b , c ( Å ) 1 4 4 .9 , 1 5 4 . 0 , 1 4 2 .5

1 4 5 .5 , 1 5 4 . 1 , 1 4 3 .5

1 0 3 .9 , 1 0 5 . 9 , 1 3 5 . 3

, ,  () 9 0 . 0 0 , 1 0 2 . 5 0 ,

9 0 . 0 0 9 0 . 0 0 , 1 2 0 . 7 4 ,

9 0 . 0 0 7 1 . 1 4 , 7 0 .4 8 , 8 9 .8 3

Rs y m 4 . 4 ( 1 3 7 . 3 ) 6 . 4 ( 1 0 5 . 4 ) 7 . 5 ( 1 1 0 . 2 )

< I /I > 1 5 . 6 ( 1 .1 ) 1 2 . 3 ( 1 .2 ) 8 . 1 ( 1 . 0 )

C C1 / 2 0 . 9 9 9 ( 0 . 5 3 6 ) 0 . 9 9 9 ( 0 . 6 0 4 ) 0 . 9 9 7 ( 0 . 5 6 6 ) C o m p l e t en e s s ( % ) 9 9 . 4 ( 9 9 . 9 ) 9 9 . 8 ( 9 9 . 9 ) 9 8 . 2 ( 9 8 . 0 )

R e d u n d an c y 3 . 4 ( 3 . 5 ) 3 . 4 ( 3 . 5 ) 2 . 3 ( 2 . 4 )

S t r u c tu r e r e f i n e m e n t

R e s o l u t i o n ( Å ) 4 8 . 4–2 .7 5 4 8 . 7–2 .9 5 2 9 . 5–2 .8 0

N o . r e f l e c t io n s 6 9 , 3 1 4 5 7 , 0 1 9 1 2 3 ,3 2 9

N o . r e f l e c t io n s R f r e e

t e s t s e t 3 4 9 8 2 8 2 9 6 2 0 1

R w o r k / R f r e e 2 3 . 7 /2 8 .6 2 3 . 3 /2 7 .7 2 1 . 2 /2 6 .0

N o . a t o m s : 1 3 , 7 4 5 1 3 , 6 5 7 2 7 , 5 5 8

P r o t e in 1 3 , 6 8 8 1 3 , 6 1 8 2 7 , 3 9 2

L i g an d 3 7 3 3 6 4

G l y c er o l 6 6 0

W a t e r 1 4 0 1 0 2

M e a n B v a l u e ( Ų) 1 0 5 .6 1 0 5 .7 7 8 . 8

P r o t e in B v a l u e ( Ų) 1 0 5 .7 1 0 5 .8 7 8 . 8

L i g an d B v a l u e ( Ų) 7 0 . 1 7 2 . 4 8 2 . 7

G l y c er o l B v a l u e ( Ų) 7 0 . 4 7 2 . 1 -

W a t e r B v a l u e ( Ų) 6 8 . 8 - 5 9 . 5

R M S b o n d l e n g t h s ( Å ) 0 . 0 0 5 0 . 0 0 7 0 . 0 0 6

R M S b o n d an g l e s ( ° ) 1 . 0 1 1 . 3 1 1 . 1 6

R a m a c h an d r o n s t a t i s t i c s :

F a v o r e d 9 6 . 1 % 9 4 . 8 % 9 5 . 5 %

O u t l i e r s 0 . 2 9 % 1 . 0 0 % 0 . 3 2 %

* V a l u e s i n p ar e n t h e s e s a r e f o r h ig h e s t - r e s o l u t i o n s h e l l .

O m i t e l e c t r o n d e n s i t y o f B r r 2 i n h i b i t o r s a n d t h e l i g a n d i n t e r a c t i o n s

137

F i g u r e 3 - 1 0 . O m i t e l e c t r o n d e n s i t y F o - F c m a p ( r e n d e r e d a s m e s h ) w a s g e n e r a t e d b y o m i t t i n g a t o m s c o r r e s p o n d i n g t o c o m p o u n d 5 2 ( d i s p l a y e d a s g r e e n s t i c k s ) . M a p i s c o n t o u r e d a t ± 3 . 0 σ . F i g u r e w a s c r e a t e d u s i n g P y m o l ( S c h r o d in g e r ) .

F i g u r e 3 - 1 1 . O m i t e l e c t r o n d e n s i t y F o - F c m a p ( r e n d e r e d a s m e s h ) w a s g e n e r a t e d b y o m i t t i n g a t o m s c o r r e s p o n d i n g t o c o m p o u n d 5 7 ( d i s p l a y e d a s g r e e n s t i c k s ) . M a p i s c o n t o u r e d a t ± 3 . 0 σ . F i g u r e w a s c r e a t ed u s i n g P y m o l ( S c h r o d i n g er ) .

F i g u r e 3 - 1 2 . O m i t e l e c t r o n d e n s i t y F o - F c m a p ( r e n d e r e d a s m e s h ) w a s g e n e r a t e d b y o m i t t i n g a t o m s c o r r e s p o n d i n g t o c o m p o u n d 5 5 ( d i s p l a y e d a s g r e e n s t i c k s ) . M a p i s c o n t o u r e d a t ± 3 . 0 σ . F i g u r e w a s c r e a t ed u s i n g P y m o l ( S c h r o d i n g er ) .

138 C o m p u t a t io n a l C h e m i s t r y

M o l e c u l a r d o ck i n g m o d e l o f co m p o u n d 6 0 w i t h B r r 2 . M o d e l in g an d d o c k in g c a l c u l a t io n s w e r e p e r f o r m e d b y u s i n g I n d u c e d F i t D o c k i n g i n t h e S c h r ö d i n g e r s o f t w a r e s u i t e ( R e l e a s e 2 0 1 6 - 3 ) . T h e c r y s t a l s t r u c t u r e o f t h e h u m an B r r 2 - co m p o u n d 5 7 c o m p l ex ( P D B I D : 5 U R K ) a s a t e m p l a t e f o r d o c k i n g . T h e co m p o u n d s t r u c t u r e w a s p r e p ar e d b y u s i n g L i g P r ep f o l l o w e d b y g en e r a t i o n o f s t a b l e c o n f o r m a t i o n b y u s i n g O M E G A 2 .5 . 1 .4 . ( Op e n E y e ) T h e d o c k ed p o s e w a s s e l e c t e d b a s e d o n I F D s c o r e .

C h e m i s t ry

P r o t o n n u c l e a r m ag n e t i c r e s o n a n c e (¹H N M R ) s p e c t r a w e r e r e co r d e d o n B r u k e r A V A N C E -3 0 0 ( -3 0 0 M H z ) , B r u k e r A V A N C E - 4 0 0 ( 4 0 0 M H z ) , a n d B r u k er A V A N C E - 6 0 0 ( 6 0 0 M H z ) , a n d ca r b o n n u c l e ar m a g n e t i c r e s o n an c e (^{1 3}C N M R ) s p e c tr a w e r e r e c o r d ed o n B r u k e r A V A N C E - 3 0 0 ( 7 5 M H z ) , B r u k er A V A N C E - 4 0 0 ( 1 0 1 M H z ) , a n d B r u k e r A V A N C E - 6 0 0 ( 1 5 1 M H z ) i n C D C l3 o r D M S O -d6 so l u t i o n . C h e m i c a l s h if t s a r e g iv e n in p a r t s p e r m i l l i o n ( p p m ) w i t h t e t r a m e th y l s i l a n e a s a n i n t e r n a l s t a n d a r d . Ab b r ev i a t i o n s a r e u s e d a s f o l l o w s : s

= s i n g l e t , d = d o u b l e t, t = t r i p l e t , q = q u ar t e t , m = m u l t i p l e t , d d = d o u b l e t o f d o u b l e t s , d d d = d o u b l e t o f d o u b l e t o f d o u b l e t s ; d t = d o u b l e t o f t r i p l e t s , t d = t r ip l e t o f d o u b l e t s , b r s

= b r o ad s i n g l e t . C o u p l i n g c o n s t a n t s (J v a l u e s ) a r e g i v en i n h e r t z ( H z ) . L o w - r e s o l u t i o n m a s s s p e c t r a ( M S ) w e r e a c q u i r e d u s i n g a n A g i l e n t L C / M S s y s t e m ( Ag i l e n t 1 2 0 0 S L / A g i l e n t 6 1 3 0 M S , A g i l en t 1 2 0 0 S L / A g i l e n t1 9 5 6 M S , o r A g i l e n t1 2 0 0 S L / A g i l e n t 6 1 1 0 M S ) o r S h i m ad z u U F L C / M S ( P r o m i n en c e U F L C h ig h p r e s s u r e g r a d i e n t s y s t e m / L C M S - 2 0 2 0 ) o p er a t i n g i n an e l e c t r o n s p r ay i o n i z a t i o n m o d e ( E S I + ) . T h e c o lu m n u s e d w a s a n L -c o lu m n 2 O D S ( 3 . 0 × 5 0 m m I . D ., 3 μ m , C E R I ) w i t h a t e m p e r a tu r e o f 4 0 ° C a n d a f l o w r a t e o f 1 .2 o r 1 . 5 m L / m in . C o n d i t i o n 1 : M o b i l e p h a s e s A a n d B u n d er a n a c id i c co n d i t i o n w e r e 0 .0 5 % T F A i n w a t e r a n d 0 . 0 5 % T F A i n M e C N , r e s p e c t i v e l y . T h e r a t io o f m o b i l e p h a s e B w a s in c r e a s e d l i n e a r l y f r o m 5 % to 9 0 % o v e r 0 . 9 m i n , 9 0 % o v e r t h e n e x t 1 .1 m i n . C o n d i t i o n 2 : M o b i l e p h a s e s A a n d B u n d e r a n eu t r a l co n d i t i o n w e r e a m ix t u r e o f 5 m m o l / L A c O N H4 a n d M e C N ( 9 /1 , v / v ) a n d a m i x t u r e o f 5 m m o l / L A c O N H4

a n d M e C N ( 1 / 9 , v /v ) , r e s p e c t iv e l y . T h e r a t i o o f m o b i l e p h a s e B w a s i n c r e a s e d l i n e ar l y f r o m 5 % t o 9 0 % o v e r 0 . 9 m i n , 9 0 % o v er t h e n ex t 1 .1 m i n . S p e c i f i c r o t a t i o n v a lu e s w e r e

139

c a r r i e d o u t b y S u m i k a C h e m i c a l A n a l y s i s S e r v i c e an d o b s e r v e d i n M e O H ( 0 .5 w /v % ) . T h e p u r i t i e s o f a l l s y n t h e s i z ed co m p o u n d s t e s t e d i n b io l o g i c a l s y s t e m s w e r e a s s e s s e d a s b e in g

> 9 5 % u s i n g e l e m e n t a l a n a l y s i s o r a n a l y t i c a l H P L C . E l e m e n t a l a n a l y s e s w e r e c a r r i e d o u t b y Su m i k a C h e m i c a l A n a ly s i s S e r v i c e o r T o r a y R e s e a r c h C e n t e r a n d w e r e w i t h i n 0 . 4 % o f t h e t h e o r e t i c a l v a l u e s . A n a ly t i c a l H P L C w e r e c a r r i e d o u t u s i n g H P L C w i t h N Q A D ( N a n o Q u a l i t y A n a ly t e D e t e c t o r ) o r C o r o n a C A D ( C h ar g ed A er o s o l D e t e c t o r ) . T h e co l u m n w a s a n L - co l u m n 2 O D S ( 3 0 × 2 . 1 m m I . D . , C E R I ) o r a C a p c e l l P a k C 1 8 A Q ( 5 0 m m × 3 .0 m m I . D . , S h i s e i d o ) w i t h a t e m p e r a t u r e o f 5 0 ° C a n d a f lo w r a t e o f 0 . 5 m L / m i n . M o b i l e p h a s e s A an d B u n d e r a n e u t r a l c o n d i t i o n w e r e a m ix t u r e o f 5 0 m m o l / L A c O N H4, w a t e r a n d M e C N ( 1 / 8 /1 , v / v /v ) a n d a m i x tu r e o f 5 0 m m o l / L A c O N H4 a n d M e C N ( 1 /9 , v / v ) , r e s p e c t iv e l y . T h e r a t i o o f m o b i l e p h a s e B w a s i n cr e a s e d l i n e ar l y f r o m 5 t o 9 5 % o v e r 3 m in , 9 5 % o v er t h e n e x t 1 m i n .

R e a c t i o n p r o g r e s s w a s d e t er m i n ed b y t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y ( T L C ) a n a l y s i s o n M er c k K i e s e l g e l 6 0 F 2 5 4 p l a t e s o r F u j i S i l y s i a N H p l a t e s . C h r o m a t o g r a p h i c p u r i f i ca t i o n w a s c a r r i e d o u t o n s i l i c a g e l c o lu m n s ( M e r ck K i e s e l g e l 6 0 , 7 0 ‒ 2 3 0 m e s h o r 2 3 0 ‒ 4 0 0 m e s h , M e r ck ; C h r o m a to r ex N H -D M 1 0 2 0 , 1 0 0 ‒ 2 0 0 me s h , F u j i S i l y s i a C h e m i c a l ; I n j e c t c o l u m n a n d Un i v e r s a l co l u m n , Y A M A Z E N , h t t p : / /y a m a z en u s a . co m / p r o d u c t s / c o lu m n s / ; o r P u r i f -P a c k S i o r N H , S h o k o S c i e n t i f i c , h t t p : / / s h o k o - s c . c o . jp / e n g l i s h 2 / ) . -P r ep a r a t i v e T L C w a s c a r r i e d o u t o n M e r ck K i e s e l g e l 6 0 P L C p l a t e s . P r e p a r a t i v e H P L C w a s a c q u i r e d u s i n g a G i l s o n P r ep a r a t i v e H P L C S y s t e m ( c o n d i t i o n s 1 a n d 2 ) o r M a s s L y n x U V P r e p S y s t e m ( co n d i t i o n 3 ) w i t h U V d e t e c t o r ( 2 2 0 a n d 2 5 4 n m ) . C o n d i t i o n 1 : Mo b i l e p h a s e s A a n d B u n d er a b a s i c co n d i t i o n w e r e 0 . 0 5 % aq u eo u s a m m o n i a s o l u t i o n a n d M e C N , r e s p e c t iv e l y . C o n d i t i o n 2 : M o b i l e p h a s e s A an d B u n d e r a n a c i d i c co n d i t io n w e r e 0 . 2 2 5 % f o r m i c a c id i n w a t e r a n d M e C N , r e s p e c t i v e ly . C o n d i t i o n 3 : M o b i l e p h a s e s A a n d B u n d e r a n a c i d i c c o n d i t i o n w er e 0 . 1 % T F A i n w a t e r a n d 0 . 1 % T F A i n M e C N , r e s p e c t i v e ly . T h e r a t i o o f m o b i l e p h a s e B w a s i n cr e a s e d l i n e a r ly b e t w e en 7 a n d 1 2 m i n . T h e c o lu m n u s e d w a s a G e m i n i C 1 8 ( 2 5 × 1 5 0 m m I . D . , 1 0 μ m o r 1 5 0 × 2 5 m m I . D . , 5 μ m , P h e n o m en e x ) f o r c o n d i t i o n 1 , a S y n e r g i C 1 8 ( [ 3 0 × 1 5 0 m m I . D ., 4 μ m ] o r [ 2 5 × 1 5 0 m m I . D . , 1 0 μ m ] , P h en o m en e x ) f o r c o n d i t i o n 2 , a n L -C o l u m n 2 O D S ( 2 0 × 1 5 0 m m I . D . , 5 μ m , C E R I ) f o r c o n d i t i o n 3 , an d a f l o w r a t e o f 2 5 m L /m i n ( c o n d i t i o n 1 a n d 2 ) o r 2 0 m L / m in ( c o n d i t i o n 3 ) .

140

A l l c o m m e r c i a l l y av a i l a b l e s o lv e n t s a n d r e a g e n t s w e r e u s e d w i t h o u t f u r t h er p u r i f i c a t i o n . Y i e l d s w e r e n o t o p t i m i z ed . C o m p o u n d 4 8 ( O g i n o e t a l. , 2 0 1 4 ) w a s u s e d f r o m th e T a k ed a c o m p o u n d l i b r a r y ( >9 5 % p u r i t y w a s co n f i r m e d b y e l e m e n t an a l y s i s ) . C o m p o u n d s 4 9, 5 5, a n d 5 6 w e r e p u r c h a s e d f r o m C h em D i v .

( ± ) - M e t h y l ( 3S, 3 'R,5 'S) 5 ' i s o b u t y l 2 o x o 1 ' ( p y r i d i n 2 y l c a r b o n y l ) 1 ,2 -d i h y -d r o s p i r o [ i n -d o l e - 3 , 2 ' - p y r r o l i -d i n e ] - 3 '- c a r b o x y l a t e ( 5 0 ) . T o a s o l u t i o n o f 1 0 0 a ( 1 .6 0 g , 5 . 2 9 m m o l ) in T H F ( 4 m L ) w a s a d d e d DI P E A ( 3 . 6 9 m L , 2 1 .2 m m o l ) an d p y r i d i n e 2 -c a r b o n y l -c h lo r i d e h y d r o -ch l o r id e ( 1 . 8 8 g , 1 0 . 6 m m o l ) a t 0 ° C . T h e m i x tu r e w a s s t i r r e d a t 0 ° C t o t e m p e r a t u r e f o r 2 h . T h e m i x tu r e w a s p o u r e d in t o w a t e r a t r o o m t e m p e r a t u r e an d e x tr a c t e d w i t h E t O A c . T h e o r g an i c l ay e r w a s s e p ar a t e d , w a s h e d w i t h w a t e r a n d b r i n e, d r i e d o v e r N a2S O4 a n d c o n c e n t r a t ed . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i e d b y s i l i c a g e l c o lu m n c h r o m a to g r ap h y ( h e x a n e / E t O A c = 9 / 1 to 0 /1 0 ) to g iv e 5 0 ( 2 . 0 6 g , 9 6 % ) a s a w h i t e s o l i d . m .p . 2 0 5–2 0 7 ° C . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l3) δ 0 .7 3 ( d , J = 6 . 5 H z , 3 H) , 0 . 7 9 ( d , J = 6 . 6 H z , 3 H) , 0 .9 5–1 . 0 9 ( m , 1 H) , 1 .3 8–1 . 5 0 ( m , 1 H ) , 1 . 5 2–1 . 6 9 ( m , 1 H ) , 2 .3 4–2 .5 6 ( m , 1 H ) , 2 . 6 3–2 .7 6 ( m , 1 H ) , 3 . 2 7 ( s , 3 H ) , 3 .6 9 ( d d , J = 1 2 . 7 , 7 . 4 H z , 1 H ) , 5 .1 5–5 .3 7 ( m , 1 H ) , 6 . 8 7 ( d , J = 7 .7 H z , 1 H ) , 6 . 9 6–7 .0 7 ( m , 1 H ) , 7 . 1 4–7 .2 6 ( m , 2 H ) , 7 . 3 2–7 .4 1 ( m , 1 H ) , 7 .6 7 ( d , J = 7 . 8 H z , 1 H ) , 7 . 7 0–7 .8 0 ( m , 1 H ) , 7 .9 0 ( s , 1 H ) , 8 .6 1 ( d , J = 4 . 7 H z , 1 H) . ^{1 3}C N M R ( 1 5 1 M H z , C D C l3) δ 2 1 . 0 , 2 4 . 2 , 2 5 .6 , 3 3 .9 , 4 7 . 5 , 5 1 . 2 , 5 1 . 8 , 5 7 . 8 , 7 1 .0 , 1 0 9 . 8 , 1 2 2 . 4 , 1 2 3 . 9 , 1 2 4 .6 , 1 2 5 .3 , 1 2 7 . 1 , 1 2 9 . 5 , 1 3 6 . 9 , 1 4 1 . 4 , 1 4 8 . 1 , 1 5 3 .2 , 1 6 5 .5 , 1 6 9 . 6 , 1 7 5 . 8 . M S m/z 4 0 8 ( M + H)⁺. A n a l . C a l c d f o r C2 3H2 5N3O4: C , 6 7 . 8 0 ; H , 6 .1 8 ; N , 1 0 .3 1 . F o u n d : C , 6 7 . 7 6 ; H , 6 . 2 3 ; N, 1 0 . 2 9 .

( ± ) - 3 - ( 2 - ( 3 - F l u o ro p y r i d i n - 2 - y l ) - 6 - m et h y l - 3 , 4 - d i h y d r o - 2H c h r o m e n 7 y l ) 6 m e t h y l 4 ,6 -d i h y -d r o p y r i -d o [ 4 , 3 -d] p y r im i d i n e - 2 ,7 ( 1H, 3H) - d i o n e ( 5 1 ) . T o a m i x t u r e o f 9 3 a ( 1 2 0 m g , 0 . 7 8 9 m m o l ) a n d 9 4 a ( O g i n o e t a l. , 2 0 1 4 ) ( 2 2 4 m g , 0 . 8 6 8 m m o l ) i n T H F ( 1 0 m L ) w a s a d d e d T i (i- P r O)4 ( 0 . 4 7 m L , 1 . 6 m m o l ) a t r o o m t e m p e r a t u r e u n d e r N2. T h e r e a c t io n m ix t u r e w a s h e a t e d to 5 0 ° C a n d s t i r r e d f o r 1 6 h . T o t h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s a d d e d N a B H ( O A c )3 ( 6 6 9 m g , 3 . 1 5 m m o l ) an d t h e r e a c t i o n m ix t u r e w a s s t i r r e d a t 5 0 ° C f o r 4 8 h . T h e r e a c t io n m ix t u r e w a s q u e n ch e d w i t h s a t u r a t e d a q u e o u s N a H C O3 a n d t h e m i x tu r e w a s e x tr a c t e d w i t h C H2C l2/ M e O H ( 1 0 / 1 ) . T h e o r g a n i c l a y e r w a s s e p a r a t ed , w a s h e d w i t h b r i n e , d r i e d o v e r an h y d r o u s N a2S O4, a n d co n c en t r a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i ed b y p r ep a r a t i v e

141

T L C o n s i l i c a g e l ( C H2C l2/ M e O H = 1 0 / 1 ) t o a f f o r d ( ± ) 4 a m i n o 5 ( ( ( 2 ( 3 f l u o r o p y r i d in 2 -y l) - 6 - m e t h -y l - 3 ,4 - d ih -y d r o - 2H- c h r o m e n - 7 - y l ) a m i n o ) m e th y l ) - 1 - m e th y l p y r i d i n - 2 ( 1H) - o n e ( 7 0 m g , 2 3 % ) a s a y e l l o w s o l id . M S m/z 3 9 5 ( M + H )⁺.

A m i x t u r e o f ( ± ) -4 - a m i n o - 5 - ( ( ( 2 - ( 3 - f l u o r o p y r i d i n - 2 - y l) - 6 - m e t h y l - 3 ,4 - d i h y d r o - 2H -c h r o m en - 7 - y l ) am i n o ) m e t h y l ) - 1 - m e t h y l p y r i d i n - 2 ( 1H) - o n e ( 7 0 m g , 0 .1 8 m m o l ) , C D I ( 9 5 . 0 m g , 0 .5 8 6 m m o l ) , a n d D B U ( 8 8 L , 0 . 5 9 m m o l ) in T H F ( 1 0 m L ) w a s s t i r r e d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 1 6 h u n d e r N2. T h en th e r e a c t i o n m ix t u r e w a s a l lo w e d t o w a r m to r o o m t e m p e r a t u r e a n d s t i r r e d f o r 2 0 h . T o t h e r ea c t i o n m i x tu r e w a s a d d ed C D I ( 8 6 . 3 m g , 0 . 5 3 2 m m o l ) a n d t h e r ea c t i o n m i x t u r e w a s s t i r r e d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 2 0 h . T h e r ea c t i o n m ix t u r e w a s d i l u t e d w i t h w a t e r ( 2 0 m L ) a n d t h e m i x tu r e w a s e x t r a c t e d w i t h C H2C l2/ M e O H ( 1 0 / 1 ) . T h e o r g a n i c l a y e r w a s s e p a r a t e d , w a s h e d w i t h b r in e , d r i e d o v e r an h y d r o u s N a2S O4, a n d c o n c e n tr a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i e d b y p r e p a r a t i v e H P L C ( co n d i t i o n 1 , 0 . 0 5 % a q u e o u s a m m o n i a s o l u t i o n / M e C N = 7 0 /3 0 t o 5 1 /4 9 ) t o af f o r d 5 1 ( 4 4 m g , 5 9 % ) a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 4 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 2 . 0 4 ( s , 3 H ) , 2 . 1 3 –2 .2 4 ( m , 1 H) , 2 .3 2–2 .3 6 ( m , 1 H) , 2 . 7 6–2 .8 6 ( m , 1 H) , 2 . 8 8–3 . 0 2 ( m , 1 H ) , 3 . 3 2 ( s , 3 H ) , 4 . 2 3 ( d d , J = 1 3 .6 , 4 . 8 H z , 1 H ) , 4 . 6 0 ( d , J = 1 3 .6 H z , 1 H ) , 5 . 4 2 ( d , J = 1 0 .0 H z , 1 H) , 5 .6 8 ( s , 1 H ) , 6 . 7 6 ( s , 1 H ) , 7 .0 2 ( s , 1 H) , 7 .4 8–7 . 6 2 ( m , 2 H ) , 7 . 7 6–7 .8 4 ( m , 1 H ) , 8 . 4 8 ( d , J = 4 . 4 H z , 1 H ) , 9 .8 2 ( b r s , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 1 0 1 M H z , D M S O -d6, T = 9 0 ° C ) δ 1 5 . 9 , 2 3 .2 , 2 4 . 8 , 3 5 .4 , 4 7 . 3 , 7 3 .0 ( d , JC–F = 1 . 8 H z , 1 C ) , 9 5 . 7 , 1 0 0 . 7 , 1 1 4 . 4 , 1 2 0 . 9 , 1 2 3 .5 ( d , JC–F = 1 9 .1 H z , 1 C ) , 1 2 4 . 9 ( d , JC–F = 4 . 4 H z, 1 C ) 1 2 6 .5 , 1 3 0 . 6 , 1 3 4 . 8 , 1 3 9 . 4 , 1 4 4 .7 ( d , JC–F = 5 . 1 H z , 1 C ) , 1 4 6 . 2 ( d , JC–F = 1 2 . 1 H z , 1 C ) , 1 4 7 .8 , 1 5 1 . 0 , 1 5 2 .6 , 1 5 6 . 9 ( d , JC–F = 2 5 8 . 6 H z , 1 C ) , 1 6 1 . 5 . M S m/z 4 2 1 ( M + H )⁺. A n a l . C a l c d f o r C2 3H2 1F N4O3·0 . 5 H2O : C , 6 4 .3 3 ; H , 5 . 1 6 ; N , 1 3 . 0 5 . F o u n d : C , 6 4 .4 9 ; H , 5 . 1 8 ; N, 1 3 . 0 5 .

( ± ) - 6 - B e n z y l - 3 - ( 2 - ( 3 - f l u o ro p y r i d i n - 2 - y l ) - 6 - m e t h y l - 3 ,4 - d i h y d r o - 2H c h r o m e n 7 y l ) 4 , 6 -d i h y -d r o p y r i -d o [ 4 , 3 -d] p y r im i d i n e - 2 ,7 ( 1H, 3H) - d i o n e ( 5 2 ). T o a m i x tu r e o f 4 a m in o 1 -b en z y l - 6 - o x o - 1 ,6 - d ih y d r o p y r i d i n e - 3 - c ar -b a ld e h y d e 9 3 b ( 3 0 m g , 0 .1 3 m m o l ) a n d 9 4 a ( 3 4 . 0 m g , 0 .1 3 m m o l ) i n T H F ( 3 m L ) w a s a d d e d T i (i- P r O )4 ( 5 9 L , 0 . 2 0 m m o l ) a t r o o m t e m p e r a t u r e u n d e r N2. T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s h e a t e d to 5 0 ° C a n d s t i r r ed f o r 1 6 h . T o t h e r e a c t i o n m ix t u r e w a s a d d e d N a B H ( O A c )3 ( 1 1 1 m g , 0 . 5 2 m m o l) a n d t h e r e a c t i o n m ix t u r e w a s s t i r r ed a t 5 0 ° C f o r 1 8 h . T h e r e a c t i o n m i x tu r e w a s c o n c e n t r a t e d , an d t h e

142

r e s i d u e w a s p u r i f i ed b y p r e p a r a t iv e T L C ( C H2C l2/ M e O H = 2 0 / 1 ) t o a f f o r d ( ± ) -4 a m i n o 1 -b en z y l - 5 - ( ( ( 2 - ( 3 - f l u o r o p y r i d in - 2 - y l ) - 6 - m e th y l - 3 , 4 - d i h y d r o - 2H ch r o m e n 7

-y l) a m i n o ) m e t h -y l ) p -y r i d i n - 2 ( 1H) - o n e ( 1 0 m g , 1 6 % ) a s a y e l l o w s o l i d . M S m/z 4 7 1 ( M + H)⁺. A m i x t u r e o f ( ± ) -4 a m in o 1 b en z y l 5 ( ( ( 2 ( 3 f l u o r o p y r id i n 2 y l) 6 m e t h y l 3 , 4 d i h y d r o -2H- c h r o m e n - 7 - y l ) a m i n o ) m e t h y l ) p y r i d i n - 2 ( 1H) - o n e ( 3 0 m g , 0 .0 6 4 m m o l ) , C D I ( 5 2 m g , 0 . 3 2 m m o l) a n d D B U ( 4 8 L , 0 .3 2 m m o l ) in T H F ( 3 m L ) w a s s t i r r e d a t r o o m t e m p e r a tu r e f o r 1 8 h . T h e r e a c t i o n m ix t u r e w a s c o n c e n t r a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i ed b y p r ep a r a t i v e H P L C ( c o n d i t i o n 2 , 0 . 2 2 5 % a q u e o u s f o r m i c a c i d s o l u t i o n / M e C N = 5 5 / 4 5 t o 3 4 / 6 6 ) t o a f f o r d 5 2 ( 1 2 m g , 3 8 % ) a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 4 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 2 . 0 3 ( s , 3 H ) , 2 . 1 1–2 .2 2 ( m , 1 H ) , 2 . 2 7–2 .3 4 ( m , 1 H ) , 2 . 7 5–2 . 8 5 ( m , 1 H ) , 2 . 8 7–3 . 0 4 ( m , 1 H ) , 4 . 2 0–4 . 3 1 ( m , 1 H ) , 4 . 5 3–4 . 6 5 ( m , 1 H ) , 4 . 9 1–5 . 0 9 ( m , 2 H ) , 5 . 3 6–5 . 4 6 ( m , 1 H ) , 5 .7 1 ( s , 1 H ) , 6 . 7 5 ( s , 1 H) , 7 .0 0 ( s , 1 H ) , 7 . 2 3–7 . 2 9 ( m , 3 H ) , 7 . 3 0–7 . 3 6 ( m , 2 H ) , 7 . 4 8–7 . 5 6 ( m , 1 H ) , 7 . 6 5 ( s , 1 H ) , 7 . 7 4–7 .8 5 ( m , 1 H ) , 8 . 4 7 ( d , J = 4 . 4 H z , 1 H ) , 9 . 8 7 ( s , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 1 0 1 M H z , D M S O -d6, T = 9 0 ° C ) δ 1 5 . 9 , 2 3 . 2 , 2 4 .7 , 4 7 . 2 , 5 0 .0 , 7 2 . 9 ( d , JC–F = 1 .8 H z , 1 C ) , 9 5 . 9 , 1 0 1 . 3 , 1 1 4 . 3 , 1 2 0 .8 , 1 2 3 . 4 ( d , JC–F = 1 9 . 4 H z, 1 C ) , 1 2 4 . 8 ( d , JC–F = 4 . 4 H z , 1 C ) , 1 2 6 . 5 , 1 2 6 . 8 , 1 2 7 .1 ( 2 C ) , 1 2 8 . 0 ( 2 C ) , 1 3 0 .5 , 1 3 4 .0 , 1 3 7 .3 , 1 3 9 . 2 , 1 4 4 . 6 ( d , JC–F = 5 . 1 H z , 1 C ) , 1 4 6 .1 ( d , JC–F = 1 2 . 5 H z , 1 C ) , 1 4 7 . 8 , 1 5 0 .8 , 1 5 2 . 5 , 1 5 6 .8 ( d , JC–F = 2 5 8 .6 H z , 1 C ) , 1 6 1 . 1 . M S m/z 4 9 7 ( M + H )⁺. A n a l. C a l c d f o r C2 9H2 5F N4O3·2 . 5 H2O : C , 6 4 . 3 2 ; H , 5 . 5 8 ; N , 1 0 . 3 5 . F o u n d : C , 6 4 . 3 4 ; H , 5 . 2 3 ; N , 1 0 . 3 6 .

( ± ) - 6 - B e n z y l - 3 - ( 2 - ( 3 - f l u o ro p y r i d i n - 2 - y l ) - 6 - m e t h y l - 3 ,4 - d i h y d r o - 2H c h r o m e n 7 y l ) 1 -m e t h y l - 4 , 6 - d i h y d r o p y r i d o [ 4 , 3 -d] p y r im i d i n e - 2 ,7 ( 1H, 3H) - d i o n e ( 5 3 ) .T o a s o l u t i o n o f 5 2 ( 6 0 m g , 0 . 1 2 m m o l ) i n D M F ( 2 m L ) w a s a d d e d N a H ( 6 0 % , 1 0 m g , 0 . 2 5 m m o l ) a t 0 ° C u n d er N2. T h e r e a c t i o n m i x tu r e w a s s t i r r e d a t 0 ° C f o r 0 . 5 h . T o t h e r e a c t io n m i x tu r e w a s a d d e d i o d o m e th a n e ( 3 4 .3 m g , 0 . 2 4 m m o l ) a t 0 ° C . T h e r e a c t i o n m ix t u r e w a s a l l o w e d t o w a r m t o r o o m t e m p er a t u r e a n d s t i r r e d f o r 2 h . T h e r e a c t i o n m i x tu r e w a s q u e n ch e d w i t h w a t e r a t 0 ° C a n d t h e m i x tu r e w a s e x t r a c t e d w i t h E t O A c . T h e o r g an i c l a y er w a s s e p a r a t ed , w a s h e d w i t h b r i n e , d r i e d o v e r N a2S O4, a n d c o n c e n tr a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i ed b y p r e p a r a t i v e H P L C ( c o n d i t i o n 2 , 0 .2 2 5 % a q u e o u s f o r m i c a c i d s o l u t i o n / M e C N = 5 5 / 4 5 to 2 5 / 7 5 ) t o a f f o r d 5 3 ( 4 5 m g , 7 3 % ) a s a w h i t e s o l id . ¹H N M R ( 4 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 2 .0 0 ( s , 3 H ) , 2 . 1 1–2 .2 2 ( m , 1 H) , 2 .2 8–2 .3 5 ( m , 1 H ) , 2 . 7 3–2 . 8 6 ( m , 1 H ) , 2 . 8 8–3 . 0 3 ( m , 1 H ) ,

143

3 . 1 5 ( s , 3 H ) , 4 .1 5–4 . 3 3 ( m , 1 H ) , 4 . 5 0–4 .6 5 ( m , 1 H) , 4 .9 0–5 . 1 7 ( m , 2 H ) , 5 . 4 1 ( d , J = 1 0 . 0 H z , 1 H ) , 5 . 8 6 ( s , 1 H ) , 6 . 7 4 ( s , 1 H) , 7 . 0 0 ( s , 1 H ) , 7 .2 3–7 . 3 8 ( m , 5 H ) , 7 . 4 9–7 . 5 6 ( m , 1 H ) , 7 . 6 5 ( s , 1 H ) , 7 .7 6–7 .8 4 ( m , 1 H ) , 8 . 4 6 ( d , J = 4 .0 H z , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 1 0 1 M H z , D M S O -d6, T = 9 0 ° C ) δ 1 5 . 9 , 2 3 . 1 , 2 4 . 7 , 2 9 . 6 , 4 6 . 6 , 5 0 . 0 , 7 2 . 9 ( d , JC–F = 2 . 2 H z , 1 C ) , 9 7 . 0 , 1 0 2 .5 , 1 1 4 .0 , 1 2 0 . 8 , 1 2 3 .4 ( d , JC–F = 1 9 . 1 H z, 1 C ) , 1 2 4 .9 ( d , JC–F = 4 .0 H z , 1 C ) , 1 2 6 .2 , 1 2 6 . 9 , 1 2 7 .1 ( 2 C ) , 1 2 8 . 0 ( 2 C ) , 1 3 0 .5 , 1 3 3 .0 , 1 3 7 .1 , 1 3 9 . 8 , 1 4 4 . 6 ( d , JC–F = 5 .1 H z , 1 C ) , 1 4 6 . 1 ( d , JC–F = 1 2 . 1 H z , 1 C ) , 1 4 8 . 9 , 1 5 1 .4 , 1 5 2 . 5 , 1 5 6 .8 ( d , JC–F = 2 5 8 .6 H z , 1 C ) , 1 6 1 . 2 . M S m/z 5 1 1 ( M + H )⁺. A n a l. C a l c d f o r C3 0H2 7F N4O3·1 .8 H2O : C , 6 3 . 3 6 ; H , 5 . 6 8 ; N , 1 0 . 3 2 . F o u n d : C , 6 3 . 4 9 ; H , 5 . 5 5 ; N , 1 0 . 4 4 .

( ± ) 6 B e n z y l 3 ( 2 ( 3 f l u o ro p y r i d i n 2 y l ) 3 ,4 d i h y d r o 2 H c h r o m e n 7 y l ) 4 ,6

-d i h y -d r o p y r i -d o [ 4 , 3 -d] p y r im i d i n e - 2 ,7 ( 1H, 3H) - d i o n e ( 5 4 ) . T o a m i x t u r e o f 9 3 b ( 3 0 m g , 0 . 1 3 m m o l) a n d 9 4 b ( O g i n o e t a l. , 2 0 1 4 ) ( 3 2 m g , 0 . 1 3 m m o l ) in T H F ( 3 m L ) w a s a d d ed T i (i- P r O )4 ( 5 9 L , 0 . 2 0 m m o l ) a t r o o m t e m p e r a tu r e u n d er N2. T h e r e a c t io n m ix t u r e w a s h ea t e d t o 5 0 ° C a n d s t i r r ed f o r 1 6 h . T o th e r e a c t i o n m ix t u r e w a s a d d e d N a B H ( O A c )3 ( 1 1 1 m g , 0 . 5 2 m m o l ) an d t h e r e ac t i o n m i x tu r e w a s s t i r r ed a t 5 0 ° C f o r 1 8 h . T h e r e a c t i o n m ix t u r e w a s c o n c e n t r a t ed , a n d t h e r e s i d u e w a s p u r i f i e d b y p r e p a r a t iv e T L C ( C H2C l2/ M e O H = 2 0 / 1 ) to a f f o r d ( ± ) 4 a m in o 1 b en z y l 5 ( ( ( 2 ( 3 f l u o r o p y r i d in 2 y l ) 3 ,4 -d ih y -d r o - 2H- c h r o m en - 7 - y l) a m i n o ) m e t h y l ) p y r i d i n - 2 ( 1H) - o n e ( 3 0 m g , 5 0 % ) a s a y e l l o w s o l i d . M S m/z 4 5 7 ( M + H )⁺.

A m ix t u r e o f ( ± ) -4 - a m i n o - 1 - b e n zy l - 5 - ( ( ( 2 - ( 3 - f l u o r o p y r id i n - 2 - y l ) - 3 , 4 - d i h y d r o - 2 H-c h r o m en - 7 - y l ) am i n o ) m e t h y l ) p y r i d in - 2 ( 1H) - o n e ( 1 4 0 m g , 0 . 3 0 7 m m o l ) , C D I ( 2 4 9 m g , 1 . 5 3 m m o l ) a n d D B U ( 0 .2 3 m L , 1 . 5 4 m m o l ) i n T H F ( 5 m L ) w a s s t i r r e d a t r o o m t e m p er a t u r e f o r 1 8 h . T h e r ea c t i o n m i x t u r e w a s c o n c e n t r a t ed , a n d t h e r e s i d u e w a s p u r i f i ed b y p r e p ar a t i v e H P L C ( c o n d i t i o n 2 , 0 . 2 2 5 % a q u e o u s f o r m i c a c i d s o l u t i o n / M e C N = 6 5 / 3 5 t o 3 5 / 6 5 ) t o a f f o r d 5 4 ( 8 0 m g , 5 4 % ) a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 4 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 2 . 1 3–2 .2 3 ( m , 1 H) , 2 .2 7–2 . 3 6 ( m , 1 H ) , 2 . 7 5–2 . 8 7 ( m , 1 H) , 2 . 9 0–3 . 0 4 ( m , 1 H ) , 4 . 5 5 ( s , 2 H ) , 5 .0 0 ( s , 2 H) , 5 . 4 4 ( d d , J = 1 0 . 0 , 2 . 0 H z , 1 H ) , 5 . 7 1 ( s , 1 H ) , 6 . 7 4–6 .7 8 ( m , 1 H) , 6 . 8 4 ( d d , J = 8 . 4 , 2 .0 H z, 1 H) , 7 . 1 1 ( d , J = 8 .4 H z , 1 H ) , 7 .2 3–7 . 3 7 ( m , 5 H) , 7 . 4 8–7 .5 6 ( m , 1 H ) , 7 .6 7 ( s , 1 H ) , 7 .7 6– 7 . 8 5 ( m , 1 H ) , 8 .4 3 - 8 . 5 1 ( m , 1 H ) , 9 .9 4 ( s , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 1 5 1 M H z , D M S O -d6) δ 2 3 .5 , 2 4 . 8 , 4 6 . 8 , 5 0 . 3 , 7 2 . 9 ( d , JC–F = 2 . 2 H z, 1 C ) 9 6 . 1 , 1 0 1 .8 , 1 1 3 . 0 , 1 1 7 . 3 , 1 1 9 . 5 , 1 2 4 .0 ( d ,

144

JC–F = 1 8 . 8 H z , 1 C ) 1 2 5 . 5 ( d , JC–F = 4 . 4 H z , 1 C ) 1 2 7 .3 , 1 2 7 .4 ( 2 C ) , 1 2 8 .4 ( 2 C ) , 1 2 9 .2 , 1 3 4 .6 , 1 3 7 . 6 , 1 4 0 . 9 , 1 4 5 . 2 ( d , JC–F = 5 . 0 H z , 1 C ) 1 4 6 . 1 ( d , JC–F = 1 2 . 2 H z , 1 C ) , 1 4 7 .8 , 1 5 1 .8 , 1 5 4 . 1 , 1 5 7 . 1 ( d , JC–F = 2 5 8 . 2 H z , 1 C ) , 1 6 1 .3 4 . M S m/z 4 8 3 ( M + H )⁺. A n a l . C a l c d f o r C2 8H2 3F N4O3·2 . 6 H2O : C , 6 3 . 5 3 ; H , 5 . 3 7 ; N , 1 0 .5 8 . F o u n d : C , 6 3 . 8 5 ; H, 5 .0 5 ; N , 1 0 . 6 4 . 6 - B e n z y l - 3 - ( 3 - ( b e n z y l o x y ) p h e n y l ) - 4 , 6 - d i h y d r o py r i d o [ 4 ,3 -d] p y r im i d i n e - 2 ,7 ( 1H, 3H) -d i o n e ( 5 7 ) . T o a m i x t u r e o f 9 5 a ( 3 0 . 0 m g , 0 .1 5 1 m m o l ) an d 9 3 b ( 3 4 . 4 m g , 0 . 1 5 1 m m o l) i n T H F ( 3 m L ) w a s a d d ed T i (i- P r O)4 ( 6 8 L , 0 . 2 3 m m o l ) a t r o o m t e m p e r a tu r e u n d e r N2. T h e r e a c t io n m i x tu r e w a s h e a t e d to 5 0 ° C a n d s t i r r ed f o r 1 6 h . T o t h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s a d d e d N a B H ( O A c )3 ( 1 2 8 m g , 0 . 6 0 3 m m o l ) , a n d t h e r e a c t i o n m ix t u r e w a s s t i r r e d a t 5 0 ° C f o r 1 8 h . T h e r e a c t i o n m ix t u r e w a s c o n c e n t r a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i ed b y p r ep a r a t i v e T L C ( C H2C l2/ M e O H = 2 0 / 1 ) t o af f o r d 4 a m i n o 1 b e n z y l 5 ( ( ( 3 -( b e n zy l o x y ) p h e n y l ) a m i n o ) m e th y l ) p y r id i n - 2 -( 1H) - o n e ( 4 0 .0 m g , 6 5 % ) a s a y e l l o w s o l i d . M S m/z 4 2 1 ( M + H )⁺.

A m i x t u r e o f 4 - a m i n o - 1 - b e n zy l - 5 - ( ( ( 3 - ( b e n z y lo x y ) p h e n y l) a m i n o ) m e t h y l ) p y r i d in - 2 ( 1H) -o n e ( 1 6 0 m g , 0 . 3 9 m m -o l) , C D I ( 3 1 5 m g , 1 . 9 4 m m -o l ) , an d D B U ( 0 .2 9 0 m L , 1 . 9 4 m m -o l) i n T H F ( 1 0 m L ) w a s s t i r r e d a t r o o m t e m p er a t u r e f o r 1 8 h . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s c o n c e n tr a t e d , a n d t h e r e s i d u e w a s p u r i f i ed b y p r ep a r a t i v e H P L C ( c o n d i t i o n 2 , 0 . 2 2 5 % a q u e o u s f o r m i c ac i d s o lu t i o n / M e C N = 5 0 /5 0 to 2 9 / 7 1 ) to af f o r d 5 7 ( 9 0 m g , 5 3 % ) a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 4 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 4 .5 9 ( s , 2 H ) , 5 . 0 1 ( s , 2 H ) , 5 . 0 9 ( s , 2 H ) , 5 . 7 5 ( s , 1 H ) , 6 . 8 7–6 .9 6 ( m , 2 H) , 7 .0 0–7 .0 5 ( m , 1 H ) , 7 . 2 3–7 . 3 0 ( m , 4 H ) , 7 . 3 1–7 . 3 6 ( m , 3 H ) , 7 . 3 7–7 .4 2 ( m , 2 H) , 7 . 4 3–7 .4 8 ( m , 2 H) , 7 . 6 8 ( s , 1 H ) , 1 0 . 0 0 ( s , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 1 5 1 M H z , D M S O -d6) δ 4 6 . 8 , 5 0 .3 , 6 9 . 3 , 9 6 . 2 , 1 0 1 .8 , 1 1 1 . 9 , 1 1 2 . 1 , 1 1 7 . 6 , 1 2 7 . 3 , 1 2 7 .5 ( 2 C ) , 1 2 7 . 6 ( 2 C ) , 1 2 7 .8 , 1 2 8 .3 ( 2 C ) , 1 2 8 . 4 ( 2 C ) , 1 2 9 .2 , 1 3 4 . 6 , 1 3 6 . 8 , 1 3 7 . 6 , 1 4 3 .2 , 1 4 7 . 7 , 1 5 1 . 8 , 1 5 8 .4 , 1 6 1 . 4 . M S m/z 4 3 8 ( M + H )⁺. A n a l . C a l c d f o r C2 7H2 3N3O3·1 .9 H2O : C , 6 8 . 7 5 ; H , 5 . 7 3 ; N , 8 .9 1 . F o u n d : C , 6 8 . 8 4 ; H , 5 . 6 0 ; N , 9 . 0 9 .

6 - B e n z y l - 3 - ( 3 - ( p y r i d i n - 2 - y lm e t h o x y ) p h e n y l ) - 4 , 6 - d i h y d r o p y r i d o [ 4 ,3 -d] p y r im i d i n e -2 , 7 ( 1H, 3H) - d i o n e ( 5 8 ) . A m i x tu r e o f 9 7 ( 2 0 0 m g , 0 .5 7 6 m m o l) , 2 - ( b r o m o m e th y l ) p y r i d in e h y d r o b r o m i d e 9 8 a, 1 6 0 m g , 0 .6 3 8 m m o l ) , a n d K2C O3 ( 3 1 8 m g , 2 .3 0 m m o l ) in D M F ( 5 m L ) w a s s t i r r ed a t r o o m t e m p er a t u r e f o r 1 5 h . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s d i l u t ed w i t h w a t e r a n d e x tr a c t e d w i t h C H2C l2/ M e O H ( 1 0 / 1 ) . T h e o r g a n i c l a y e r w a s s e p a r a t ed , w a s h e d w i t h b r i n e ,

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d r i e d o v e r a n h y d r o u s N a2S O4, an d c o n c e n tr a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i ed b y p r ep a r a t i v e T L C ( C H2C l2/ M e O H = 1 2 / 1 ) , a n d s u b s e q u en t l y b y p r e p ar a t i v e H P L C ( c o n d i t i o n 1 , 0 . 0 5 % a q u e o u s a m m o n i a s o l u t i o n / M e C N = 7 5 /2 5 t o 4 5 /5 5 ) t o af f o r d 5 8 ( 9 1 m g , 3 6 % ) a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 4 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 4 . 5 9 ( s , 2 H ) , 5 .0 1 ( s , 2 H ) , 5 .1 7 ( s , 2 H ) , 5 .7 5 ( s , 1 H) , 6 . 9 0 ( d d , J = 8 .0 , 2 . 0 H z, 1 H ) , 6 .9 4 ( d d , J = 8 . 0 , 1 .2 H z , 1 H ) , 7 . 0 5–7 . 0 6 ( m , 1 H ) , 7 . 2 5–7 .3 6 ( m , 7 H ) , 7 . 5 2 ( d , J = 7 .6 H z , 1 H ) , 7 . 6 8 ( s , 1 H ) , 7 .8 2–7 .8 6 ( m , 1 H ) , 8 . 5 5–8 .6 0 ( m , 1 H ) , 1 0 . 0 0 ( b r s , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 7 5 M H z , D M S O -d6) δ 4 7 . 3 , 5 0 .8 , 7 0 .9 , 9 6 . 8 , 1 0 2 . 3 , 1 1 2 . 4 , 1 1 2 . 7 , 1 1 8 . 3 , 1 2 2 . 2 , 1 2 3 . 5 , 1 2 7 . 9 , 1 2 8 . 0 ( 2 C ) 1 2 9 .0 ( 2 C ) 1 2 9 . 8 , 1 3 5 . 2 , 1 3 7 . 5 , 1 3 8 . 2 , 1 4 3 .7 , 1 4 8 . 3 , 1 4 9 . 6 , 1 5 2 .4 , 1 5 7 .0 , 1 5 8 . 8 , 1 6 1 . 9 . M S m/z 4 3 9 ( M + H )⁺. A n a l . C a l c d f o r C2 6H2 2N4O3·1 . 0 H2O : C , 6 8 . 4 1 ; H , 5 . 3 0 ; N , 1 2 . 2 7 . F o u n d : C , 6 8 .5 0 ; H , 5 .4 1 ; N , 1 2 .3 1 . 6 - B e n z y l - 3 - ( 3 - ( p y r i d i n - 3 - y lm e t h o x y ) p h e n y l ) - 4 , 6 - d i h y d r o p y r i d o [ 4 ,3 -d] p y r im i d i n e -2 , 7 ( 1H, 3H) - d i o n e ( 5 9 ) . A m i x tu r e o f 9 7 ( 2 0 0 m g , 0 . 5 7 6 m m o l) , 9 8 b ( 1 6 0 m g , 0 . 6 3 8 m m o l ) , an d K2C O3 ( 3 1 8 m g , 2 . 3 0 m m o l) i n D M F ( 2 m L ) w a s s t i r r e d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 1 4 h u n d e r N2. T h e r e a c t i o n m ix t u r e w a s p o u r e d i n to w a t e r a n d e x t r a c t ed w i t h C H2C l2/ M e O H ( 1 0 / 1 ) . T h e o r g an i c l ay e r w a s s ep a r a t e d , w a s h ed w i t h b r i n e , d r i ed o v e r N a2S O4, an d co n c en t r a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i ed b y p r ep a r a t i v e T L C ( C H2C l2/ M e O H = 2 0/1 ) a n d s u b s e q u e n t l y b y p r e p ar a t i v e H P L C ( co n d i t i o n 1 , 0 . 0 5 % aq u e o u s a m m o n i a s o l u t i o n / M e C N = 6 8 / 3 2 t o 4 0 /6 0 ) t o af f o r d 5 9 ( 3 3 m g , 1 3 % ) a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 4 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 4 .5 9 ( s , 2 H ) , 5 .0 1 ( s , 2 H ) , 5 . 1 4 ( s , 2 H ) , 5 . 7 5 ( s , 1 H ) , 6 . 8 7–6 .9 8 ( m , 2 H ) , 7 .0 1–7 .0 8 ( m , 1 H ) , 7 . 2 5–7 .3 5 ( m , 6 H ) , 7 . 3 8–7 . 4 8 ( m , 1 H ) , 7 . 6 8 ( s , 1 H) , 7 . 8 2– 7 . 9 1 ( m , 1 H ) , 8 . 5 0–8 . 5 9 ( m , 1 H ) , 8 . 6 4–8 . 7 1 ( m , 1 H ) , 9 .9 9 ( b r s , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 7 5 M H z , D M S O -d6) δ p p m 4 7 . 4 , 5 0 .8 , 6 7 .5 , 9 6 .8 , 1 0 2 . 3 , 1 1 2 .5 , 1 1 2 . 7 , 1 1 8 . 4 , 1 2 4 . 1 , 1 2 7 . 9 , 1 2 8 .0 ( 2 C ) , 1 2 9 . 0 ( 2 C ) , 1 2 9 . 8 , 1 3 3 .0 , 1 3 5 . 2 , 1 3 6 .2 , 1 3 8 . 2 , 1 4 3 . 8 , 1 4 8 . 3 , 1 4 9 . 6 , 1 4 9 . 7 , 1 5 2 .4 , 1 5 8 .7 , 1 6 1 . 9 . M S m/z 4 3 9 ( M + H)⁺. A n a l . C a l c d f o r C2 6H2 2N4O3·1 . 5 H2O : C , 6 7 . 0 8 ; H , 5 . 4 1 ; N, 1 2 . 0 4 . F o u n d : C , 6 7 . 2 2 ; H , 5 . 3 0 ; N , 1 2 . 0 8 .

6 - B e n z y l - 3 - ( 3 - ( 1 ,3 - t h i a zo l - 5 - y lm e t h o x y ) p h e n y l ) - 4 ,6 - d i h y d r o p y r i d o [ 4 ,3 -d] p y r i m i d i n e -2 , 7 ( 1H, 3H) - d i o n e ( 6 0 ) . T o a s o lu t i o n o f 9 7 ( 8 2 m g , 0 . 2 4 m m o l ) a n d 9 8 c ( 6 0 m g , 0 . 3 5 m m o l ) in N M P ( 3 m L ) w a s a d d e d K2C O3 ( 1 4 7 m g , 1 .0 6 m m o l ) an d K I ( 5 .9 m g , 0 . 0 3 6 m m o l ) a t r o o m t em p e r a tu r e . T h e m ix t u r e w a s s t i r r ed a t r o o m t e m p e r a t u r e o v er n i g h t , d i lu t e d w i t h E t O A c an d 5 % aq u eo u s c i t r i c a c i d , a n d ex t r a c t e d w i t h E t O A c . T h e o r g a n i c

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l a y er w a s s e p a r a t e d , w a s h ed w i t h w a t e r a n d b r i n e , d r i ed o v er N a2S O4, a n d c o n c e n t r a t ed . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i e d b y s i l i c a g e l co l u m n ch r o m a t o g r a p h y ( E t O A c / M e O H = 1 0 0 / 0 t o 8 8 / 1 2 ) a n d s u b s e q u en t l y b y p r e p a r a t iv e H P L C ( co n d i t i o n 3 , 0 . 1 % T F A i n w a t e r / 0 . 1 % T F A i n M e C N = 8 0 / 2 0 to 0 / 1 0 0 ) to g i v e 6 0 ( 2 8 m g , 2 7 % ) a s a w h i t e s o l id . ¹H N M R δ ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) 4 .5 9 ( s , 2 H ) , 5 .0 1 ( s , 2 H ) , 5 . 3 9 ( s , 2 H) , 5 . 7 5 ( s , 1 H ) , 6 .8 8–6 .9 8 ( m , 2 H ) , 7 . 0 4 ( s , 1 H ) , 7 . 2 3–7 . 3 8 ( m , 6 H ) , 7 . 6 8 ( s , 1 H ) , 8 .0 1 ( s , 1 H ) , 9 . 1 2 ( s , 1 H ) , 1 0 . 0 0 ( s , 1 H ) .

1 3C N M R ( 1 5 1 M H z , D M S O -d6) δ 4 6 . 8 , 5 0 . 3 , 6 1 . 7 , 9 6 . 2 , 1 0 1 . 8 , 1 1 2 . 1 , 1 1 2 . 3 , 1 1 8 . 1 , 1 2 7 .3 , 1 2 7 . 5 ( 2 C ) , 1 2 8 . 4 ( 2 C ) , 1 2 9 . 2 , 1 3 3 . 8 , 1 3 4 . 7 , 1 3 7 . 6 , 1 4 2 . 9 , 1 4 3 . 2 , 1 4 7 . 7 , 1 5 1 .8 , 1 5 5 .2 , 1 5 7 .6 , 1 6 1 . 3 . M S m/z 4 4 5 ( M + H)⁺. A n a l . C a l c d f o r C2 4H2 0N4O3S·0 . 5 H2O : C , 6 3 . 5 6 ; H , 4 . 6 7 ; N, 1 2 . 3 5 . F o u n d : C , 6 3 . 8 4 ; H , 4 . 8 9 ; N , 1 2 . 5 2 .

6 - B e n z y l - 3 - ( 2 - ( b e n z y l o x y ) p h e n y l ) - 4 , 6 - d i h y d r o py r i d o [ 4 ,3 -d] p y r im i d i n e - 2 ,7 ( 1H, 3H) -d i o n e ( 6 1 ) . T o a s o l u t i o n o f 4 - a m in o - 1 - b en z y l - 6 - o x o - 1 , 6 - d i h y d r o p y r i d in e - 3 - c a r b a l d e h y d e 9 3 b ( 1 0 0 m g , 0 . 4 3 8 m m o l ) , 2 - ( b e n zy l o x y ) a n i l i n e 9 5 c ( 0 . 0 8 5 m L , 0 . 4 8 1 m m o l ) , a n d S n C l2· 2 H2O ( 2 0 m g , 0 . 0 8 9 m m o l ) i n M e O H ( 1 0 m L ) w a s a d d e d p o l y m e t h y lh y d r o s i l o x an e ( 8 1 µ L ) a t r o o m t e m p e r a t u r e . T h e m i x t u r e w a s s t i r r e d a t r o o m t em p e r a t u r e f o r 3 d , d i l u t ed w i t h E t O A c , p a s s e d s h o r t c o lu m n ( N a2S O4 a n d s i l i c a g e l , E t O A c ) , a n d co n c e n tr a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r if i e d b y s i l i c a g e l c o lu m n c h r o m a to g r ap h y ( E t O A c / M e O H = 1 0 0 / 0 to 8 8 / 1 2 ) to g i v e 4 - a m i n o - 1 - b e n zy l - 5 - ( ( ( 2 - ( b e n z y lo x y ) p h e n y l) a m i n o ) m e t h y l ) p y r i d in - 2 ( 1H) -o n e ( 5 5 m g , 3 1 % ) a s a c -o l-o r l e s s -o i l . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 4 . 0 3 ( d , J = 6 .7 H z , 2 H) , 4 .8 9 ( s , 2 H ) , 5 . 1 0 ( s , 2 H) , 5 .3 2 ( s , 1 H ) , 5 . 3 8 ( t , J = 5 .8 H z , 1 H ) , 6 . 1 1 ( s , 2 H ) , 6 .4 5– 6 . 5 4 ( m , 1 H ) , 6 .6 0 ( s , 1 H ) , 6 . 6 5–6 . 7 3 ( m , 1 H ) , 6 . 8 6 ( d , J = 8 . 1 H z , 1 H ) , 7 . 1 3–7 . 2 0 ( m , 2 H) , 7 . 2 2–7 .4 0 ( m , 6 H ) , 7 . 4 7 ( d , J = 9 . 9 H z , 3 H ) . M S m/z 4 1 2 ( M + H )⁺.

T o 4 - am i n o - 1 - b e n zy l - 5 - ( ( ( 2 - ( b e n z y lo x y ) p h e n y l ) a m in o ) m e t h y l) p y r i d i n - 2 ( 1H) - o n e ( 5 2 m g , 0 . 1 3 m m o l) a n d C D I ( 1 0 2 m g , 0 . 6 3 m m o l) i n T H F ( 1 0 m L) w a s a d d e d D B U ( 9 5 μL , 0 .6 3 m m o l ) a t r o o m t e m p e r a t u r e . T h e m i x tu r e w a s s t i r r ed a t r o o m t e m p er a t u r e f o r 4 h , d i l u t e d w i t h E t O A c , a c i d i f i e d w i t h 5 % c i t r i c a c i d , a n d e x t r a c t ed w i t h E t O A c . T h e o r g an i c l a y er w a s s e p a r a t ed , w a s h e d w i t h w a t e r a n d b r in e , d r i ed o v e r N a2S O4, an d c o n c e n tr a t e d . T h e r e s i d u a l s o l i d w a s s u s p e n d e d in E t O A c , co l l e c t e d b y f i l t r a t i o n , w a s h e d w i t h E t O A c a n d d r i e d t o g i v e 6 1 ( 4 5 m g , 8 1 % ) a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 4 . 4 5 ( 2 H , s ) , 5 . 0 0 ( 2 H , s ) , 5 . 1 4 ( 2 H , s ) , 5 . 7 3 ( 1 H , s ) , 6 . 9 8 ( 1 H , t , J = 7 .5 H z ) , 7 . 1 6 ( 1 H , d , J = 8 . 3

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H z ) , 7 .2 1–7 . 4 1 ( 1 2 H , m ) , 7 .6 4 ( 1 H , s ) , 9 . 9 1 ( 1 H , s ) . ^{1 3}C N M R ( 1 5 1 M H z , D M S O -d6) δ p p m 4 7 . 2 , 5 0 . 3 , 6 9 . 4 , 9 6 . 2 , 1 0 1 . 7 , 1 1 3 . 7 , 1 2 0 . 8 , 1 2 6 . 9 ( 2 C ) 1 2 7 . 3 , 1 2 7 . 4 ( 2 C ) , 1 2 7 . 6 , 1 2 8 . 2 ( 2 C ) , 1 2 8 .4 ( 2 C ) , 1 2 8 . 5 , 1 2 9 . 0 , 1 3 0 . 7 , 1 3 4 .6 , 1 3 6 . 9 , 1 3 7 .6 , 1 4 8 .2 , 1 5 1 . 7 , 1 5 3 .9 , 1 6 1 . 3 . M S m/z 4 3 8 ( M + H )⁺. A n a l . C a l c d f o r C2 7H2 3N3O3·0 .2 H2O : C , 7 3 .5 2 ; H , 5 . 3 5 ; N, 9 .5 3 . F o u n d : C , 7 3 . 6 4 ; H , 5 . 2 8 ; N , 9 .5 3 .

M e t h y l ( 3S,3 'R, 5 'S) 5 ' i s o b u t y l 2 o x o 1 ' ( p y r i d i n 2 y l c a r bo n y l ) 1 , 2 -d i h y -d r o s p i r o [ i n -d o l e - 3 , 2 ' - p y r r o l i -d i n e ] - 3 '- c a r b o x y l a t e ( 6 2 a ) a n -d m e t h y l ( 3R, 3 'S, 5 'R) 5 ' i s o b u t y l 2 o x o 1 ' ( p y r i d i n 2 y l c a r bo n y l ) 1 ,2 d i h y d r o s p i r o [ i n d o l e 3 , 2 ' py r r o l i d i n e ] -3 '- c a r b o x y l a t e ( 6 2 b ) . R a c e m a t e 5 0 ( 1 2 0 m g ) w a s s e p a r a t e d b y H P L C ( Y M C K - p r ep s y s t e m , C H I R A L C E L O D ( D a i c e l ) 5 0 m m I . D . × 5 0 0 m m , 2 0 μ m , h ex a n e / E t O H = 1 /1 ( v / v ) , f lo w r a t e o f 6 0 m L / m i n .) t o g iv e 6 2 a ( 5 9 m g , 4 9 % , > 9 9 . 9 % e e , r e t e n t i o n t i m e 9 . 2 m i n ) a s a w h i t e s o l i d a n d 6 2 b ( 6 0 m g , 5 0 % , 9 9 . 9 % e e , r e t en t i o n t i m e 1 6 .2 m i n ) a s a w h i t e s o l i d . 6 2 a : m . p . 2 2 3–2 2 5 ° C . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l3) δ 0 . 7 4 ( d , J = 6 .5 H z , 3 H ) , 0 . 7 9 ( d , J = 6 . 6 H z , 3 H ) , 0 . 9 2–1 . 0 8 ( m , 1 H ) , 1 .3 5–1 .5 0 ( m , 1 H) , 1 . 5 5–1 .6 4 ( m , 1 H ) , 2 . 3 6–2 . 5 3 ( m , 1 H ) , 2 . 6 1–2 .7 6 ( m , 1 H ) , 3 . 2 8 ( s , 3 H ) , 3 . 6 9 ( d d , J = 1 2 . 7 , 7 . 5 H z , 1 H ) , 5 .1 8–5 .3 8 ( m , 1 H ) , 6 . 8 7 ( d , J = 7 .7 H z , 1 H ) , 6 . 9 8–7 . 0 6 ( m , 1 H) , 7 .1 6–7 . 2 5 ( m , 2 H ) , 7 . 3 2–7 . 4 0 ( m , 1 H ) , 7 . 6 7 ( d , J

= 7 . 5 H z , 2 H) , 7 .7 1–7 . 8 0 ( m , 1 H ) , 8 . 6 1 ( d , J = 4 . 8 H z , 1 H) . ^{1 3}C N M R ( 1 5 1 M H z , C D C l3) δ 2 1 . 0 , 2 4 . 2 , 2 5 .6 , 3 3 . 9 , 4 7 . 5 , 5 1 . 2 , 5 1 .8 , 5 7 . 8 , 7 1 .0 , 1 0 9 .7 , 1 2 2 .4 , 1 2 3 . 9 , 1 2 4 . 6 , 1 2 5 . 3 , 1 2 7 .1 , 1 2 9 . 5 , 1 3 6 . 9 , 1 4 1 . 4 , 1 4 8 . 1 , 1 5 3 .2 , 1 6 5 . 5 , 1 6 9 .5 , 1 7 5 . 7 . M S m/z 4 0 8 ( M + H)⁺. A n a l.

C a l c d f o r C2 3H2 5N3O4: C , 6 7 .8 0 ; H , 6 .1 8 ; N, 1 0 . 3 1 . F o u n d : C , 6 7 . 8 8 ; H , 6 . 4 3 ; N , 1 0 .0 6 . []D2 5 = + 4 2 . 4 ° ( c = 0 .5 , M e O H ) . 6 2 b : m . p . 2 2 3–2 2 5 ° C . M S m/z 4 0 8 ( M + H )⁺. A n a l . C a l c d f o r C2 3H2 5N3O4·0 . 2 H2O : C , 6 7 . 2 0 ; H , 6 .2 3 ; N , 1 0 . 2 2 . F o u n d : C , 6 7 . 3 8 ; H , 6 . 4 6 ; N , 1 0 . 0 2 . []D2 5 = − 4 1 . 6 ° ( c = 0 .5 , M e O H ) .

A n a ly t i c a l H P L C c o n d i t i o n f o r d e t e r m in a t i o n o f % e e v a lu e s o f 6 2 a a n d 6 2 b, W a t e r s s y s t e m , C H I R A L C E L O D - H ( D a i c e l ) 4 . 6 m m I . D . × 2 5 0 m m , 5 μ m , h ex a n e / E t O H = 1 / 1 ( v / v ) , f l o w r a t e o f 0 . 5 m L / m in . A b s o l u t e s t e r e o ch e m i s t r y w a s d e t e r m i n ed b y X - r a y c r y s t a l s t r u c tu r e an a l y s i s ( X - r a y c r y s t a l s t r u c tu r e o f 6 2 b i s a v a i l a b l e , C C D C 1 5 3 9 9 6 1 ) .

( + ) - M e t h y l ( 3S *,3 'S *, 5 'S *) 5 ' i s o b u t y l 2 o x o 1 ' ( p y r i d i n 2 y l ca r b o n y l) 1 , 2 -d i h y -d r o s p i r o [ i n -d o l e - 3 , 2 ' - p y r r o l i -d i n e ] - 3 '- c a r b o x y l a t e ( 6 3a ) a n d ( − )- M e t h y l ( 3S *, 3 'S *, 5 'S *) 5 ' i s o b u t y l 2 o x o 1 ' ( p y r i d i n 2 y l c a r bo n y l ) 1 , 2 d i h y d r o s p i r o [ i n d o l e

-148

3 , 2 ' - p y r ro l i d i n e ] - 3 ' - ca r b o x y l a t e ( 6 3 b ) . T o a so l u t i o n o f 5 0 ( 2 4 0 m g , 0 . 5 8 9 m m o l ) in M e O H ( 1 2 m L ) w a s a d d ed N a O M e ( 1 5 9 m g , 2 .9 5 m m o l ) a t r o o m t e m p er a t u r e. T h e m i x tu r e w a s s t i r r e d a t 5 0 ° C f o r 5 h u n d e r N2. T h e m ix t u r e w a s p o u r e d i n t o s a t u r a t e d a q u eo u s N H4C l a t r o o m t e m p e r a t u r e , a n d ex t r a c t e d w i t h E t O A c . T h e o r g a n i c l a y er w a s s e p a r a t e d , w a s h e d w i t h w a t e r an d b r i n e , d r i e d o v er M g S O4 a n d c o n c e n t r a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i ed b y N H - s i l i c a g e l c o lu m n ch r o m a to g r a p h y ( E t O A c / M e O H = 1 0 /0 t o 8 / 2 ) t o g i v e a m ix t u r e o f r a c e m i c p r o d u c t s . T h e m i x t u r e w a s p u r i f i ed b y c h i r a l H P L C t w i c e ( 1 s t : Y M C K - p r e p s y s t e m , C H I R A L C E L O D ( D a i c e l ) 5 0 m m I . D . × 5 0 0 m m , 2 0 μ m , h ex a n e / E t O H = 1 /1 ( v / v ) , f l o w r a t e o f 6 0 m L /m i n ; 2 n d : Y M C K - p r e p s y s t e m , C H I R A L P A K I C ( D a i c e l ) 5 0 m m I . D . × 5 0 0 m m , 2 0 μ m , h e x a n e /E t O H = 1 / 4 ( v / v ) , f lo w r a t e o f 6 0 m L / m in . ) t o g i v e 6 3 a ( 3 5 m g , 1 5 % , 9 9 .8 % e e , r e t e n t i o n t im e 9 .7 m i n ) a s a w h i t e s o l i d a n d 6 3 b ( 3 4 m g , 1 4 % , 9 7 . 8 % e e , r e t e n t i o n t i m e 1 1 . 0 m i n ) a s a w h i t e s o l i d . ( A b s o l u t e s t e r e o ch e m i s t r i e s o f 6 3 a a n d 6 3 b h a v e n o t b e en d e t er m i n ed . ) 6 3 a : m .p . 1 0 0–1 0 2 ° C . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z, C D C l3) δ 0 . 9 2 ( d , J = 6 . 4 H z , 3 H ) , 0 .9 7 ( d , J = 6 . 4 H z, 3 H) , 1 . 6 0–1 .7 5 ( m , 2 H ) , 2 . 1 1–2 . 2 8 ( m , 2 H ) , 2 . 8 0 ( td , J = 1 2 .6 , 7 .5 H z , 1 H ) , 3 . 5 2–3 . 6 6 ( m , 4 H ) , 4 . 9 5–5 . 0 7 ( m , 1 H ) , 6 . 8 7 ( d , J = 7 .6 H z , 1 H) , 7 . 0 4 ( t , J = 7 . 5 H z , 1 H ) , 7 . 1 8–7 .2 5 ( m , 2 H ) , 7 .3 0–7 .3 7 ( m , 1 H ) , 7 . 4 6 ( b r s , 1 H ) , 7 .7 3 ( td , J = 7 .7 , 1 .8 H z , 1 H ) , 7 . 8 2 ( d , J = 8 . 1 H z , 1 H ) , 8 . 5 6 ( d , J = 4 . 7 H z , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 1 5 1 M H z , C D C l3) δ 2 1 . 4 , 2 4 . 1 , 2 6 .3 , 3 1 . 4 , 4 4 . 5 , 5 2 .0 , 5 2 . 2 , 5 8 .5 , 6 9 . 7 , 1 0 9 . 8 , 1 2 2 .0 , 1 2 2 .5 , 1 2 5 .0 , 1 2 5 .1 , 1 2 9 . 1 , 1 3 0 . 2 , 1 3 6 . 7 , 1 4 2 . 0 , 1 4 7 . 5 , 1 5 2 . 9 , 1 6 5 . 1 , 1 7 0 . 1 , 1 7 5 . 8 . M S m/z 4 0 8 ( M + H)⁺. []D2 5 = +7 8 .0 ° ( c = 0 .5 , M e O H ) . A n a l . C a l c d f o r C2 3H2 5N3O4·0 . 6 H2O : C , 6 6 . 0 4 ; H, 6 .3 1 ; N , 1 0 . 0 5 . F o u n d : C , 6 6 . 2 5 ; H , 6 . 2 0 ; N , 9 .9 5 . 6 3 b : m .p . 1 0 0–1 0 2 ° C . M S m/z 4 0 8 ( M + H )⁺. []D2 5 = −7 7 . 4 ° ( c = 0 . 5 , M e O H ) . A n a l . C a l c d f o r C2 3H2 5N3O4·1 . 2 H2O : C , 6 4 .3 8 ; H , 6 . 4 4 ; N , 9 . 7 9 . F o u n d : C , 6 4 . 4 6 ; H , 6 . 2 5 ; N, 9 .8 2 .

A n a ly t i c a l H P L C c o n d i t i o n f o r d e t er m i n a t i o n o f % e e v a lu e s o f 6 3 a a n d 6 3 b, W a t e r s s y s t e m , C H I R A L C E L O D - H ( D a i c e l ) 4 . 6 m m I . D . × 2 5 0 m m , 5 μ m , h e x a n e / E t O H = 1 / 1 ( v / v ) , f l o w r a t e o f 0 .5 m L / m in .

( ± ) - ( 3S, 3 'R, 5 'S) 5 ' I s o b u t y l 2 o x o 1 ' ( p y r i d i n 2 y l c a r bo n y l ) 1 , 2 d i h y d r o s p i r o [ i n d o l e -3 , 2 ' - p y r ro l i d i n e ] - -3 ' - ca r b o x y l i c a c i d h y d r o c h l o r i d e ( 6 4 ) . A m ix t u r e o f 1 0 1 ( 2 3 0 m g , 0 . 5 1 1 m m o l ) a n d T F A ( 3 . 1 5 m L , 4 0 . 9 m m o l ) w a s s t i r r e d a t r o o m t e m p e r a tu r e f o r 3 h . T h e m ix t u r e w a s n e u tr a l i z e d w i t h s a t u r a t e d aq u eo u s N a H C O3 a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d

149

e x tr a c t e d w i t h E t O A c–iP r O H . T h e o r g an i c l a y er w a s s e p ar a t e d , w a s h ed w i t h b r in e , d r i e d o v e r M g S O4, an d co n ce n t r a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i ed b y s i l i c a g e l c o lu m n c h r o m a to g r ap h y ( E t O A c / M e O H = 1 / 0 t o 1 /1 ) t o g iv e a w h i t e s o l i d ( 3 9 0 m g ) a s a c r u d e p r o d u c t . T h e c r u d e ( 1 9 0 m g ) w a s p u r i f i e d b y p r e p a r a t i v e H P L C ( c o n d i t i o n 2 , 0 .1 % T F A i n w a t e r / 0 . 1 % T F A i n M e C N = 6 0 /4 0 t o 0 / 1 0 0 ) , t r e a t ed w i t h 4 M H C l i n E t O A c , a n d c o n c e n tr a t e d t o g iv e 6 4 ( 7 4 m g , 7 6 % ) a s a w h i t e s o l i d . m . p . 1 6 8–1 7 0 ° C . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 0 . 5 5–0 .7 7 ( m , 7 H ) , 1 . 3 1–1 . 5 9 ( m , 2 H) , 2 .1 5–2 . 3 4 ( m , 1 H) , 2 .5 5–2 . 6 8 ( m , 1 H ) , 3 .3 8 ( d d , J = 1 3 . 1 , 7 .1 H z , 1 H ) , 4 . 8 3–4 . 9 6 ( m , 1 H ) , 6 . 8 0 ( d , J = 7 . 5 H z, 1 H ) , 6 . 8 7–6 .9 8 ( m , 1 H ) , 7 .1 5–7 .3 2 ( m , 2 H ) , 7 .4 5–7 .6 0 ( m , 2 H) , 7 . 9 1 ( t d , J = 7 . 7 , 1 . 7 H z , 1 H ) , 8 . 6 1 ( d , J = 4 .1 H z , 1 H) , 1 0 . 5 4 ( s , 1 H ) . 1 H w a s n o t o b s e r v e d . ^{1 3}C N M R ( 1 5 1 M H z, D M S O -d6) δ 2 0 . 8 , 2 3 . 8 , 2 4 .9 , 3 3 . 3 , 4 6 . 6 , 5 1 .0 , 5 6 . 9 , 7 0 . 1 , 1 0 9 . 1 , 1 2 1 .0 , 1 2 3 . 6 , 1 2 3 . 8 , 1 2 5 .4 , 1 2 7 . 5 , 1 2 8 . 7 , 1 3 7 . 5 , 1 4 3 .0 , 1 4 8 .0 , 1 5 3 . 1 , 1 6 4 . 5 , 1 6 9 . 9 , 1 7 5 . 1 . M S m/z 3 9 4 ( M + H )⁺. A n a l . C a l c d f o r C2 2H2 4N3O4C l · 1 . 3 H2O : C , 5 8 .2 9 ; H , 5 . 9 1 ; N , 9 . 2 7 . F o u n d : C , 5 8 .3 7 ; H , 6 . 0 6 ; N , 9 . 2 1 .

( ± ) - ( 3S, 3 'R, 5 'S) 5 ' I s o b u t y l 2 o x o 1 ' ( p y r i d i n 2 y l c a r bo n y l ) 1 , 2 d i h y d r o s p i r o [ i n d o l e -3 , 2 ' - p y r ro l i d i n e ] - -3 ' - ca r b o x a m i d e ( 6 5 ) . A m i x tu r e o f 1 0 1 ( 1 . 4 8 g , 3 . 2 9 m m o l ) a n d T F A ( 2 0 .3 m L , 2 6 3 m m o l) w a s s t i r r e d a t r o o m t e m p er a t u r e f o r 4 h . T h e m i x t u r e w a s c o n c e n tr a t e d , t r e a t e d w i t h 4 M H C l in E t O A c , a n d co n c en t r a t e d t o g iv e 6 4 ( 1 . 4 1 g ) a s a c r u d e p r o d u c t . A m i x t u r e o f t h e c r u d e 6 4 ( 1 . 0 0 g ) , H O B t · N H3 ( 1 .5 9 g , 1 0 . 5 m m o l) , D I P E A ( 1 . 8 2 m L , 1 0 .4 m m o l) , a n d E D C · H C l ( 7 9 9 m g , 4 . 1 7 m m o l ) in D M F ( 1 5 m L ) w a s s t i r r e d a t r o o m t e m p er a t u r e o v e r n ig h t . T h e m i x t u r e w a s p o u r e d i n t o w a t e r a t r o o m t em p e r a tu r e a n d e x tr a c t e d w i t h E t O A c . T h e o r g an i c l ay e r w a s s e p ar a t e d , w a s h e d w i t h w a t e r a n d b r i n e, d r i e d o v e r Mg S O4, a n d co n c e n tr a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i e d b y N H - s i l i c a g e l co l u m n c h r o m a to g r ap h y ( E t O A c / M e O H = 1 0 / 0 t o 9 / 1 ) t o g i v e 6 5 ( 6 3 0 m g , 7 7 % f o r 2 s t e p s ) a s a w h i t e s o l i d . m .p . 1 6 2–1 6 4 ° C . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l3) δ 0 .6 9 ( d , J = 6 . 5 H z, 3 H ) , 0 .7 6 ( d , J = 6 . 6 H z , 3 H) , 0 . 8 6–1 . 0 1 ( m , 1 H ) , 1 . 3 6–1 . 5 1 ( m , 1 H) , 1 .5 3–1 .6 7 ( m , 1 H) , 2 .5 1–2 .6 3 ( m , 2 H ) , 3 .4 7 ( d d , J = 1 1 . 5 , 8 . 3 H z , 1 H ) , 5 .1 1–5 . 3 4 ( m , 2 H ) , 5 . 8 8 ( b r s , 1 H ) , 6 . 7 8 ( d , J = 7 . 7 H z , 1 H ) , 6 .9 8–7 . 0 8 ( m , 1 H ) , 7 . 1 9 ( t d , J = 7 .7 , 1 . 1 H z , 1 H ) , 7 . 2 3–7 . 3 0 ( m , 1 H ) , 7 .3 7 ( d d d , J = 7 .5 , 4 .9 , 1 . 2 H z , 1 H ) , 7 . 6 4 ( d , J = 7 .8 H z , 1 H) , 7 . 7 2–7 . 8 2 ( m , 1 H) , 8 . 6 0 ( d , J = 4 . 8 H z , 1 H ) , 8 . 8 3 ( s , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 1 5 1 M H z , C D C l3) δ 2 1 . 0 , 2 4 .2 , 2 5 . 5 , 3 4 .2 , 4 7 . 4 , 5 1 .7 ,

150

5 7 . 7 , 7 2 .0 , 1 1 0 .5 , 1 2 2 . 6 , 1 2 4 . 5 , 1 2 4 . 8 , 1 2 5 . 3 , 1 2 6 .7 , 1 2 9 .4 , 1 3 7 . 1 , 1 4 1 .2 , 1 4 8 .2 , 1 5 3 .2 , 1 6 5 .6 , 1 6 9 . 3 , 1 7 7 .1 . M S m/z 3 9 3 ( M + H)⁺. A n a l . C a l c d f o r C2 2H2 4N4O3·0 .9 H2O : C , 6 4 .6 6 ; H , 6 . 3 6 ; N , 1 3 . 7 1 . F o u n d : C , 6 4 .7 2 ; H , 6 .5 6 ; N , 1 3 .9 5 .

( ± ) - ( 3S, 3 'R, 5 'S) 3 ' ( H y d ro x y m e t h y l) 5 ' i s o b u t y l 1 ' ( py r i d i n 2

-y l ca r b o n -y l ) s p i r o [ i n d o l e - 3 , 2 '- p -y r r o l i d i n ] - 2 ( 1H) - o n e ( 6 6 ) . A m ix t u r e o f 5 0 ( 2 .0 6 g , 5 .0 6 m m o l ) , C a C l2 ( 1 . 1 2 g , 1 0 . 1 m m o l ) , a n d N a B H4 ( 7 6 5 m g , 2 0 . 2 m m o l ) i n E t O H ( 3 0 m L ) w a s s t i r r e d a t 0 ° C t o r o o m t em p e r a tu r e f o r 6 h . T h e m i x t u r e w a s p o u r ed i n t o s a t u r a t e d a q u e o u s N H4C l a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d e x t r a c t ed w i t h E t O A c . T h e o r g an i c l a y e r w a s s e p a r a t ed , w a s h e d w i t h w a t e r a n d b r i n e , d r i e d o v e r N a2S O4, an d c o n c e n tr a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i e d b y s i l i c a g e l co l u m n c h r o m a t o g r a p h y ( E t O A c / M e O H = 1 0 /0 t o 8 / 2 ) to g i v e 6 6 ( 1 . 5 3 g , 8 0 % ) a s a w h i t e s o l i d . m .p . 2 1 9–2 2 0 ° C . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l3) δ 0 .7 1 ( d , J

= 6 .4 H z , 3 H ) , 0 . 7 6 ( d , J = 6 .5 H z , 3 H ) , 0 . 8 9–1 . 0 4 ( m , 1 H ) , 1 . 3 0–1 . 4 1 ( m , 1 H ) , 1 . 4 8–1 . 6 2 ( m , 1 H ) , 1 .6 8–1 . 8 1 ( m , 1 H ) , 2 .0 9 ( b r s , 1 H ) , 2 . 5 3–2 . 7 0 ( m , 1 H ) , 2 .8 9–3 . 0 6 ( m , 1 H ) , 3 .1 7– 3 . 4 4 ( m , 2 H ) , 5 .1 3–5 . 2 7 ( m , 1 H ) , 6 .8 8 ( d , J = 7 .7 H z , 1 H ) , 6 . 9 6–7 . 0 6 ( m , 1 H ) , 7 .1 3–7 . 2 5 ( m , 2 H ) , 7 . 3 1–7 .4 0 ( m , 1 H ) , 7 . 6 5 ( d , J = 7 .8 H z , 1 H ) , 7 . 6 9–7 . 7 8 ( m , 1 H) , 8 .4 2 ( s , 1 H ) , 8 . 6 0 ( d , J = 4 .5 H z , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 7 5 M H z , C D C l3) δ 2 1 .0 , 2 4 .2 , 2 5 . 6 , 3 5 .6 , 4 7 . 5 , 4 9 . 7 , 5 8 . 2 , 6 1 .6 , 7 2 .0 , 1 1 0 . 7 , 1 2 2 . 0 , 1 2 3 .9 , 1 2 4 . 5 , 1 2 5 .1 , 1 2 7 . 5 , 1 2 9 .2 , 1 3 6 . 9 , 1 4 1 . 5 , 1 4 8 .1 , 1 5 3 .4 , 1 6 5 . 6 , 1 7 7 .4 . M S m/z 3 8 0 ( M + H)⁺. A n a l . C a l c d f o r C2 2H2 5N3O3·0 .6 H2O : C , 6 7 .7 1 ; H , 6 . 7 7 ; N , 1 0 .7 7 . F o u n d : C , 6 7 .9 0 ; H , 6 .9 3 ; N , 1 0 . 9 0 . X - r ay c r y s t a l s t r u c t u r e o f 6 6 i s a v a i l a b l e , C C D C 1 5 3 9 9 6 2 .

( ± ) - ( 3S, 3 'R, 5 'S) 3 ' ( F l u o ro m et h y l ) 5 ' i s o b u t y l 1 ' ( py r i d i n 2 y l ca r b o n y l ) s p i r o [ i n d o l e -3 , 2 ' - p y r ro l i d i n ] - 2 ( 1H) - o n e ( 6 7 ) . T o a s o l u t i o n o f 6 6 ( 1 5 0 m g , 0 . 3 9 5 m m o l ) i n T H F ( 4 m L ) w a s a d d e d b i s ( 2 - m e t h o x y e t h y l ) am i n o s u l f u r t r i f l u o r i d e ( 0 . 2 4 3 m L , 1 . 1 9 m m o l ) a t 0 ° C u n d er N2. T h e m i x t u r e w a s s t i r r e d a t 0 ° C t o r o o m t e m p e r a tu r e o v e r n i g h t . T h e r e ac t i o n m ix t u r e w a s p o u r ed i n to w a t e r a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d e x t r a c t e d w i t h E t O A c . T h e o r g an i c l a y er w a s s e p a r a t ed , w a s h ed w i t h w a t e r a n d b r i n e , d r i e d o v e r N a2S O4, a n d c o n c e n tr a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r if i e d b y s i l i c a g e l c o l u m n ch r o m a t o g r a p h y ( h e x an e / E t O A c = 9 5 / 5 t o 2 0 / 8 0 ) a n d N H - s i l i c a g e l c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y ( E t O A c / M e O H

= 1 0 / 0 t o 9 / 1 ) t o g iv e 6 7 ( 3 3 m g , 2 2 % ) a s a w h i t e s o l i d . m . p . 2 2 1–2 2 3 ° C . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l3) δ 0 .7 5 ( d , J = 6 . 5 H z , 3 H ) , 0 . 7 9 ( d , J = 6 .6 H z , 3 H ) , 0 .9 9–1 . 1 0 ( m , 1 H ) ,

151

1 . 3 2–1 .4 4 ( m , 1 H ) , 1 . 4 9–1 .6 6 ( m , 1 H ) , 1 . 7 9–1 . 9 3 ( m , 1 H ) , 2 . 5 4–2 . 7 6 ( m , 1 H ) , 3 . 0 9–3 . 3 8 ( m , 1 H) , 3 . 9 2–4 .3 0 ( m , 2 H ) , 5 . 2 0–5 . 4 2 ( m , 1 H ) , 6 .8 9 ( d , J = 7 . 8 H z , 1 H ) , 6 .9 9–7 . 0 7 ( m , 1 H) , 7 .1 4–7 . 2 9 ( m , 2 H ) , 7 . 3 1–7 . 3 9 ( m , 1 H) , 7 . 6 5–7 . 8 1 ( m , 2 H ) , 7 . 9 0 ( b r s , 1 H ) , 8 .6 1 ( d , J

= 4 . 6 H z , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 7 5 M H z , C D C l3) δ 2 1 . 0 , 2 4 . 2 , 2 5 .7 , 3 4 . 7 ( d , JC–F = 6 .1 H z , 1 C ) , 4 6 . 9 ( d , JC–F = 2 0 . 4 H z , 1 C ) , 4 7 .5 , 5 8 . 2 , 7 1 . 5 ( d , JC–F = 3 . 9 H z , 1 C ) , 8 2 . 0 ( d , JC–F = 1 6 8 . 9 H z , 1 C ) , 1 1 0 .5 , 1 2 2 . 2 , 1 2 4 .0 , 1 2 4 . 6 , 1 2 5 .2 , 1 2 6 . 9 , 1 2 9 . 4 , 1 3 6 .9 , 1 4 1 .3 , 1 4 8 . 1 , 1 5 3 . 2 , 1 6 5 .5 , 1 7 6 . 4 . M S m/z 3 8 2 ( M + H)⁺. A n a l . C a l c d f o r C2 2H2 4F N3O2·0 . 2 H2O : C , 6 8 . 6 2 ; H , 6 . 3 9 ; N, 1 0 . 9 1 . F o u n d : C , 6 8 . 6 6 ; H , 6 . 3 5 ; N , 1 0 . 6 2 .

( ± ) - ( 3S, 3 'R, 5 'S) 3 ' ( C h l o r o m e t hy l ) 5 ' i s o b u t y l 1 ' ( py r i d i n 2 y l ca r b o n y l ) s p i r o [ i n d o l e -3 , 2 ' - p y r ro l i d i n ] - 2 ( 1H) - o n e ( 6 8 ) . T o a s o lu t i o n o f 6 6 ( 4 0 m g , 0 . 1 1 m m o l ) i n T H F ( 2 m L ) w e r e a d d ed E t3N ( 0 . 1 4 7 m L , 1 . 0 5 m m o l ) an d m e t h a n e s u lf o n y l c h lo r i d e ( 0 .0 4 1 m L , 0 .5 3 m m o l ) a t 0 ° C . T h e m i x tu r e w a s s t i r r ed a t 0 ° C f o r 0 .5 h . T h e m i x t u r e w a s p o u r ed i n to w a t e r a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d e x t r a c t e d w i t h E t O A c . T h e o r g a n i c l a y er w a s s e p a r a t e d , w a s h e d w i t h w a t e r a n d b r i n e , d r i e d o v e r N a2S O4, a n d c o n c e n tr a t e d . T h e r e s i d u e w a s d i s s o l v ed i n D M F ( 2 m L ) . T o t h e s o l u t i o n w a s a d d ed l i t h i u m c h l o r i d e ( 4 4 . 7 m g , 1 .0 5 m m o l ) a t r o o m t e m p er a t u r e a n d th e m i x t u r e w a s s t i r r e d a t 1 0 0 ° C f o r 7 h . T h e r e a c t io n m ix t u r e w a s p o u r e d in t o s a t u r a t e d a q u e o u s N H4C l a t r o o m t e m p e r a t u r e , an d e x tr a c t e d w i t h E t O A c . T h e o r g an i c l a y e r w a s s e p a r a t e d , w a s h e d w i t h w a t e r an d b r i n e , d r i e d o v e r N a2S O4, a n d co n c en t r a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i e d b y s i l i c a g e l co l u m n c h r o m a t o g r a p h y ( h e x an e / E t O A c = 9 5 / 5 to 2 0 / 8 0 ) t o g i v e 6 8 ( 1 8 m g , 4 3 % ) a s a w h i t e s o l i d . m .p . 1 6 4– 1 6 6 ° C . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l3) δ 0 . 7 5 ( d , J = 6 .5 H z , 3 H ) , 0 . 7 9 ( d , J = 6 .7 H z , 3 H ) , 0 . 9 6–1 .1 3 ( m , 1 H ) , 1 . 2 8–1 .4 4 ( m , 1 H ) , 1 . 5 0–1 . 6 3 ( m , 1 H ) , 1 . 7 5–1 . 9 1 ( m , 1 H ) , 2 . 7 5–2 . 9 0 ( m , 1 H) , 2 . 9 7–3 .2 1 ( m , 3 H ) , 5 . 2 0–5 . 3 6 ( m , 1 H ) , 6 .9 0 ( d , J = 7 . 8 H z , 1 H ) , 7 .0 1–7 . 0 9 ( m , 1 H) , 7 . 1 9 ( d , J = 7 . 3 H z , 1 H ) , 7 .2 7–7 . 4 1 ( m , 2 H ) , 7 .6 5–7 . 8 6 ( m , 3 H) , 8 . 6 1 ( d , J = 4 .6 H z , 1 H) . ^{1 3}C N M R ( 7 5 M H z , C D C l3) δ 2 1 .0 , 2 4 .2 , 2 5 . 6 , 3 7 .6 , 4 2 .9 , 4 7 . 5 , 4 8 . 8 , 5 8 . 1 , 7 2 . 1 , 1 1 0 .6 , 1 2 2 . 4 , 1 2 4 . 0 , 1 2 4 . 5 , 1 2 5 . 3 , 1 2 6 .7 , 1 2 9 . 5 , 1 3 6 .9 , 1 4 1 . 1 , 1 4 8 . 2 , 1 5 3 . 2 ,1 6 5 . 6 , 1 7 6 . 2 . M S m/z 3 9 8 ( M + H )⁺. A n a l . C a l c d f o r C2 2H2 4C l N3O2: C , 6 6 . 4 1 ; H , 6 .0 8 ; N, 1 0 . 5 6 . F o u n d : C , 6 6 . 1 5 ; H , 6 . 1 2 ; N , 1 0 . 5 0 .

( ± ) - ( 3S, 3 'R, 5 'S) 5 ' I s o b u t y l 3 ' m e t h y l 1 ' ( p y r i d i n 2 y l c a r b o n y l ) s p i r o [ i n d o l e 3 ,2 ' -p y r ro l i d i n ] - 2 ( 1H) - o n e ( 6 9 ) . T o a s o lu t i o n o f 6 6 ( 1 5 0 m g , 0 .3 9 5 m m o l ) i n T H F ( 4 m L )

152

w e r e a d d ed E t3N ( 0 . 1 6 5 m L , 1 . 1 9 m m o l ) an d m e t h a n e s u lf o n y l c h lo r i d e ( 0 .0 6 7 m L , 0 .8 7 m m o l ) a t 0 ° C . T h e m i x tu r e w a s s t i r r e d a t 0 ° C f o r 1 h . T h e m ix t u r e w a s p o u r ed i n t o w a t e r a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d e x t r a c t e d w i t h E t O A c . T h e o r g a n i c l a y er w a s s e p a r a t e d , w a s h e d w i t h w a t e r a n d b r i n e , d r i e d o v e r N a2S O4, a n d c o n c e n tr a t e d . T h e r e s i d u e w a s d i s s o l v ed i n D M F ( 4 m L ) . T o t h e s o l u t i o n w a s ad d ed l i t h i u m i o d i d e ( 2 6 5 m g , 1 .9 8 m m o l) a t r o o m t em p e r a tu r e , a n d th e m ix t u r e w a s s t i r r e d a t 1 0 0 ° C f o r 8 h . T h e m i x t u r e w a s p o u r e d in t o w a t e r a t r o o m t e m p e r a t u r e an d e x t r a c t ed w i t h E t O A c . T h e o r g a n i c l a y er w a s s e p a r a t ed , w a s h e d w i t h w a t e r a n d b r i n e , d r i e d o v e r N a2S O4, an d c o n c e n tr a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r if i e d b y s i l i c a g e l co l u m n ch r o m a t o g r a p h y ( h e x an e / E t O A c = 1 0 /0 t o 2 / 8 ) t o g i v e ( ± ) -( 3S,3 'R, 5 'S) 3 ' ( i o d o m e t h y l) 5 ' i s o b u t y l 1 ' ( p y r i d i n 2 y l c a r b o n y l) s p i r o [ i n d o l e 3 , 2 ' -p y r r o l i d i n ] - 2 ( 1H) - o n e ( 1 9 3 m g , q u an t . f o r 2 s t e p s ) a s a p a l e y e l l o w s o l id . M S m/z 4 9 0 ( M + H )⁺.

A m i x t u r e o f ( ± ) -( 3S, 3 'R, 5 'S) 3 ' ( i o d o m e th y l ) 5 ' i s o b u t y l 1 ' ( p y r i d i n 2 -y l c ar b o n -y l ) s p ir o [ in d o l e - 3 , 2 ' - p -y r r o l id i n ] - 2 ( 1H) - o n e ( 1 9 3 m g , 0 .3 9 4 m m o l ) , p a l l a d i u m o n c a r b o n e t h y l e n e d i am i n e co m p l ex ( P d 3 .5–6 . 5 % , 1 0 1 m g ) , a n d s a u t r a t e d a q u e o u s N a H C O3

( 1 m L ) i n M e O H ( 5 m L ) a n d T H F ( 1 m L ) w a s h y d r o g e n a t e d u n d er b a l l o o n p r e s s u r e a t r o o m t e m p e r a t u r e o v e r n ig h t . T h e c a t a l y s t w a s r e m o v e d b y f i l t r a t i o n a n d t h e f i l t r a t e w a s c o n c e n tr a t e d . T h e r e s i d u e w a s w a s p u r i f i e d b y N H - s i l i c a g e l c o l u m n ch r o m a t o g r a p h y ( h e x an e / E t O A c = 9 5 / 5 to 2 0 / 8 0 ) t o g i v e 6 9 ( 7 8 m g , 5 4 % ) a s a w h i t e s o l i d . m .p . 2 2 0– 2 2 2 ° C . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l3) δ 0 . 6 7 ( d , J = 6 .7 H z , 3 H ) , 0 . 7 3 ( d , J = 6 .5 H z , 3 H ) , 0 . 7 7 ( d , J = 6 .6 H z , 3 H ) , 0 .9 3–1 . 0 8 ( m , 1 H ) , 1 .2 3–1 . 4 3 ( m , 1 H ) , 1 .4 6–1 . 6 4 ( m , 1 H ) , 1 .6 5– 1 . 7 9 ( m , 1 H ) , 2 . 5 5 ( d t , J = 1 2 .7 , 6 .4 H z, 1 H ) , 2 . 6 8–2 .8 9 ( m , 1 H ) , 5 .1 1–5 .2 8 ( m , 1 H ) , 6 .8 8 ( d , J = 7 . 7 H z , 1 H) , 6 .9 8–7 .0 6 ( m , 1 H ) , 7 .1 6 ( d , J = 7 . 3 H z , 1 H ) , 7 . 2 3 ( d , J = 7 . 8 H z , 1 H) , 7 . 3 0–7 .3 8 ( m , 1 H ) , 7 .5 9–7 .7 9 ( m , 2 H ) , 7 .9 2 ( s , 1 H ) , 8 . 6 1 ( d , J = 4 . 8 H z , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 7 5 M H z , C D C l3) δ 1 2 . 8 , 2 1 .0 , 2 4 . 3 , 2 5 . 7 , 4 0 . 5 , 4 1 . 8 , 4 7 .4 , 5 8 .5 , 7 3 .7 , 1 1 0 .1 , 1 2 2 .1 , 1 2 3 .9 , 1 2 4 .5 , 1 2 5 . 0 , 1 2 8 . 2 , 1 2 8 . 8 , 1 3 6 . 8 , 1 4 1 . 0 , 1 4 8 .1 , 1 5 3 .6 , 1 6 5 . 6 , 1 7 7 . 1 . M S m/z 3 6 4 ( M + H )⁺. A n a l . C a l c d f o r C2 2H2 5N3O2·0 . 1 H2O : C , 7 2 .3 4 ; H , 6 .9 5 ; N , 1 1 . 5 0 . F o u n d : C , 7 2 . 3 0 ; H , 7 . 1 6 ; N , 1 1 . 4 2 . X - r ay c r y s t a l s t r u c t u r e o f 6 9 i s av a i l a b l e , C C D C 1 5 3 9 9 6 3 . ( ± ) - M e t h y l ( 3S, 3 'R, 5 'S) 5 ' i s o b u t y l 1 m e t h y l 2 o x o 1 ' ( p y r i d i n 2 y l c a r bo n y l ) 1 , 2 -d i h y -d r o s p i r o [ i n -d o l e - 3 , 2 ' - p y r r o l i -d i n e ] - 3 '- c a r b o x y l a t e ( 7 0 ) . C o m p o u n d 7 0 w a s p r ep a r e d

153

f r o m 1 0 0 b i n a s i m i l a r m a n n er t o th a t d e s c r i b ed f o r th e s y n t h e s i s o f c o m p o u n d 5 0 a n d o b t a i n e d i n 6 9 % y i e l d a s a w h i t e s o l i d . m . p . 2 0 3–2 0 5 ° C . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l3) δ 0 . 7 3 ( d , J = 6 . 5 H z , 3 H ) , 0 .7 9 ( d , J = 6 . 6 H z, 3 H) , 0 . 9 0–1 .0 6 ( m , 1 H ) , 1 . 3 4–1 . 5 0 ( m , 1 H ) , 1 . 5 6–1 .6 5 ( m , 1 H ) , 2 .3 5–2 .5 3 ( m , 1 H ) , 2 .6 2–2 .7 5 ( m , 1 H) , 3 . 2 3 ( s , 3 H ) , 3 . 3 3 ( s , 3 H ) , 3 . 6 9 ( d d , J = 1 2 .7 , 7 . 4 H z, 1 H) , 5 . 1 7–5 .4 0 ( m , 1 H ) , 6 .8 7 ( d , J = 7 . 8 H z , 1 H) , 7 . 0 3 ( t , J = 7 . 5 H z , 1 H ) , 7 . 2 1 ( d , J = 6 .8 H z , 1 H ) , 7 . 2 9–7 .3 8 ( m , 2 H ) , 7 . 6 4 ( d , J = 7 . 8 H z , 1 H ) , 7 .6 9–7 .7 7 ( m , 1 H ) , 8 .6 0 ( d , J = 4 . 9 H z , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 7 5 M H z , C D C l3) δ 2 0 . 9 , 2 4 . 2 , 2 5 . 5 , 2 6 . 7 , 3 3 . 9 , 4 7 . 5 , 5 1 . 1 , 5 1 . 8 , 5 7 . 7 , 7 0 . 8 , 1 0 7 .9 , 1 2 2 . 3 , 1 2 3 . 4 , 1 2 4 . 5 , 1 2 5 . 2 , 1 2 6 .7 , 1 2 9 .6 , 1 3 6 .8 , 1 4 4 .4 , 1 4 8 . 1 , 1 5 3 . 2 , 1 6 5 .5 , 1 6 9 . 5 , 1 7 4 . 6 . M S m/z 4 2 2 ( M + H )⁺. A n a l . C a l c d f o r C2 4H2 7N3O4: C , 6 8 . 3 9 ; H , 6 . 4 6 ; N , 9 . 9 7 . F o u n d : C , 6 8 . 3 7 ; H , 6 . 4 5 ; N , 9 . 9 6 .

( ± ) - M e t h y l ( 3S, 3 'R, 5 'S) 5 ' i s o b u t y l 2 o x o 1 ' ( p y r i d i n 2 y l m et h y l ) 1 ,2 -d i h y -d r o s p i r o [ i n -d o l e - 3 , 2 ' - p y r r o l i -d i n e ] - 3 '- c a r b o x y l a t e ( 7 1 ) . T o a s o lu t i o n o f 1 0 0 a ( 1 0 0 m g , 0 .3 3 0 m m o l) , p y r i d in e - 2 - c a r b a l d e h y d e ( 0 .6 2 9 m L , 6 .6 1 m m o l ) a n d a c e t i c a c i d ( 0 . 5 6 8 m L , 9 . 9 2 m m o l ) i n M e O H ( 4 m L ) w a s a d d e d N a B H ( O A c )3 ( 2 .1 0 g , 9 . 9 2 m m o l ) a t 0 ° C . T h e m i x tu r e w a s s t i r r e d a t 0 ° C t o r o o m t e m p er a t u r e o v e r n ig h t . T h e m i x t u r e w a s p o u r e d i n to w a t e r a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d e x t r a c t e d w i t h E t O A c . T h e o r g an i c l a y e r w a s s e p a r a t ed , w a s h e d w i t h w a t e r a n d b r i n e , d r i e d o v e r N a2S O4, an d c o n c e n tr a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i e d b y N H - s i l i c a g e l co l u m n c h r o m a t o g r a p h y ( E t O A c / M e O H = 1 0 / 0 t o 8 / 2 ) t o g iv e 7 1 ( 7 4 m g , 5 7 % ) a s a w h i t e s o l i d . m .p . 2 0 9–2 1 1 ° C . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l3) δ 0 . 8 7 ( d , J = 2 . 1 H z , 3 H ) , 0 .8 9 ( d , J = 2 . 2 H z, 3 H) , 1 . 2 4–1 .4 2 ( m , 2 H ) , 1 . 6 5–1 . 7 2 ( m , 1 H ) , 2 . 0 9–2 .2 8 ( m , 1 H ) , 2 . 3 4–2 . 4 9 ( m , 1 H ) , 3 .1 7 ( s , 3 H ) , 3 . 4 9 ( d d , J = 1 0 .2 , 8 . 0 H z , 1 H ) , 3 . 6 1–3 .7 2 ( m , 1 H ) , 3 . 7 5 ( d , J = 1 5 . 8 H z , 1 H ) , 3 . 9 7 ( d , J = 1 5 .6 H z , 1 H) , 6 . 6 0 ( d , J = 7 . 7 H z , 1 H ) , 6 . 8 3 ( t d , J = 7 . 6 , 0 . 9 H z , 1 H ) , 6 . 8 8–6 . 9 5 ( m , 1 H ) , 7 . 0 2 ( t d , J = 7 .7 , 1 .3 H z , 1 H ) , 7 . 0 8 ( d , J = 7 . 5 H z , 1 H ) , 7 . 2 5–7 . 3 1 ( m , 1 H ) , 7 .3 5–7 . 4 2 ( m , 1 H ) , 7 . 7 4 ( s , 1 H) , 8 .2 4 ( d d , J

= 5 .0 , 0 .7 H z , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 7 5 M H z , C D C l3) δ 2 1 . 9 , 2 4 .5 , 2 6 . 2 , 3 3 .5 , 4 4 . 5 , 5 1 . 4 , 5 1 .6 , 5 4 . 2 , 6 1 .9 , 7 3 .8 , 1 0 9 . 3 , 1 2 1 . 5 , 1 2 2 .2 , 1 2 3 . 2 , 1 2 5 .4 , 1 2 8 . 8 , 1 2 9 .4 , 1 3 5 . 5 , 1 4 0 . 7 , 1 4 7 .9 , 1 6 0 .3 , 1 7 2 . 0 , 1 7 9 .9 . M S m/z 3 9 4 ( M + H)⁺. A n a l . C a l c d f o r C2 3H2 7N3O3·0 .1 H2O : C , 6 9 .8 9 ; H , 6 . 9 4 ; N , 1 0 .6 3 . F o u n d : C , 6 9 .8 0 ; H , 6 .8 7 ; N , 1 0 . 6 3 . X - r ay c r y s t a l s t r u c t u r e o f 7 1 i s a v a i l a b l e , C C D C 1 5 3 9 9 6 0 .

154

( ± ) - M e t h y l ( 3S,3 'R, 5 'S) 5 ' m e t h y l 2 o x o 1 ' ( p y r i d i n 2 y l c a r b o n y l ) 1 ,2 -d i h y -d r o s p i r o [ i n -d o l e - 3 , 2 ' - p y r r o l i -d i n e ] - 3 '- c a r b o x y l a t e ( 7 2 ) . C o m p o u n d 7 2 w a s p r ep a r ed f r o m 1 0 0 c i n a s i m i l a r m a n n e r t o th a t d e s c r i b ed f o r t h e s y n th e s i s o f co m p o u n d 5 0 a n d o b t a i n e d i n 6 5 % y i e l d a s a w h i t e s o l i d . m . p . 2 4 1–2 4 3 ° C . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l3) δ 1 . 0 7 ( d , J = 6 . 0 H z , 3 H ) , 2 . 3 6–2 . 5 6 ( m , 1 H ) , 2 .5 6–2 . 7 3 ( m , 1 H ) , 3 . 2 8 ( s , 3 H) , 3 .6 7 ( d d , J

= 1 2 .9 , 7 . 3 H z , 1 H ) , 5 .1 7–5 . 3 4 ( m , 1 H ) , 6 . 8 8 ( d , J = 7 . 7 H z, 1 H ) , 6 . 9 7–7 . 0 6 ( m , 1 H) , 7 . 1 6–7 .2 9 ( m , 2 H ) , 7 . 3 5 ( d d d , J = 7 . 3 , 4 .9 , 1 . 4 H z , 1 H) , 7 . 6 4–7 .7 8 ( m , 3 H ) , 8 .6 1 ( d , J = 4 . 8 H z , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 7 5 M H z , C D C l3) δ 2 3 . 2 , 3 5 .5 , 5 1 .1 , 5 1 . 8 , 5 4 . 8 , 7 1 .2 , 1 0 9 . 8 , 1 2 2 .4 , 1 2 3 .7 , 1 2 4 .5 , 1 2 5 . 2 , 1 2 7 . 1 , 1 2 9 . 5 , 1 3 6 . 9 , 1 4 1 . 4 , 1 4 8 .2 , 1 5 3 .0 , 1 6 5 . 6 , 1 6 9 . 4 , 1 7 5 . 7 . M S m/z 3 6 6 ( M + H )⁺. A n a l . C a l c d f o r C2 0H1 9N3O4: C , 6 5 . 7 4 ; H , 5 .2 4 ; N, 1 1 .5 0 . F o u n d : C , 6 5 . 6 9 ; H , 5 . 2 6 ; N , 1 1 . 5 5 . X - r ay c r y s t a l s t r u c t u r e o f 7 2 i s av a i l a b l e , C C D C 1 5 3 9 9 5 8 . ( ± ) - M e t h y l ( 3S, 3 'R, 5 'R) 5 ' b e n z y l 2 o x o 1 ' ( p y r i d i n 2 y l c a r b o n y l ) 1 ,2 -d i h y -d r o s p i r o [ i n -d o l e - 3 , 2 ' - p y r r o l i -d i n e ] - 3 '- c a r b o x y l a t e ( 7 3 ) . C o m p o u n d 7 3 w a s p r ep a r e d f r o m 1 0 0 d i n a s i m i l a r m a n n er t o th a t d e s c r i b ed f o r th e s y n t h e s i s o f c o m p o u n d 5 0 a n d o b t a i n e d i n 5 7 % y i e l d a s a w h i t e s o l i d . m . p . 2 4 0–2 4 2 ° C . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l3) δ 2 . 2 9–2 .4 3 ( m , 1 H ) , 2 . 4 8–2 .6 9 ( m , 2 H ) , 2 . 8 7 ( d d , J = 1 2 . 7 , 3 . 5 H z , 1 H ) , 3 . 2 4 ( s , 3 H ) , 3 . 6 2 ( d d , J = 1 1 . 8 , 7 .7 H z , 1 H) , 5 . 4 6–5 . 6 4 ( m , 1 H ) , 6 . 8 7 ( d , J = 7 . 7 H z , 1 H ) , 6 .9 5–7 . 0 1 ( m , 2 H) , 7 . 1 3–7 . 1 9 ( m , 2 H ) , 7 .2 0–7 .3 3 ( m , 4 H) , 7 . 4 2 ( d d d , J = 6 . 8 , 4 . 8 , 2 .0 H z , 1 H) , 7 . 7 0 ( s , 1 H) , 7 .7 4–7 .8 5 ( m , 2 H ) , 8 .7 6 ( d d , J = 4 .7 , 1 . 4 H z, 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 7 5 M H z, D M S O -d6) δ 3 2 . 7 , 4 2 .1 , 5 1 .0 , 5 1 . 9 , 6 0 . 1 , 7 1 .3 , 1 0 9 . 6 , 1 2 1 . 7 , 1 2 4 . 3 , 1 2 4 .6 , 1 2 6 . 4 , 1 2 7 . 1 , 1 2 7 . 5 , 1 2 9 . 0 ( 2 C ) , 1 2 9 .5 , 1 2 9 . 6 ( 2 C ) , 1 3 7 .5 , 1 3 8 .3 , 1 4 3 . 1 , 1 4 8 . 9 , 1 5 3 . 6 , 1 6 5 .2 , 1 6 9 . 4 , 1 7 5 .6 . M S m/z 4 4 2 ( M + H)⁺. A n a l . C a l c d f o r C2 6H2 3N3O4·0 . 1 H2O : C , 7 0 . 4 5 ; H , 5 . 2 8 ; N , 9 .4 8 . F o u n d : C , 7 0 . 5 1 ; H , 5 . 2 5 ; N , 9 . 2 1 . X - r a y c r y s t a l s t r u c tu r e o f 7 3 i s a v a i l ab l e , C C D C 1 5 3 9 9 5 9 .

( ± ) - M e t h y l ( 3S, 3 'R, 5 'S) 4 f l u o ro 5 ' i s o b u t y l 2 o x o 1 ' ( p y r i d i n 2 y l c a r bo n y l ) 1 , 2 -d i h y -d r o s p i r o [ i n -d o l e - 3 , 2 ' - p y r r o l i -d i n e ] - 3 '- c a r b o x y l a t e ( 7 4 ) . C o m p o u n d 7 4 w a s p r ep a r ed f r o m 1 0 0 e i n a s i m i l a r m a n n e r t o th a t d e s c r i b ed f o r t h e s y n th e s i s o f co m p o u n d 5 0 a n d o b t a i n e d i n 1 9 % y i e l d a s a w h i t e s o l i d . m .p . 1 9 8–2 0 0 ° C . ¹H N M R ( 4 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 0 . 3 1–1 .0 7 ( m , 7 H ) , 1 .2 9–1 .5 7 ( m , 2 H ) , 2 .3 7–2 . 4 4 ( m , 1 H ) , 2 . 5 9–2 .6 8 ( m , 1 H ) , 3 . 2 6 ( s , 3 H) , 3 .4 7–3 . 6 0 ( m , 1 H ) , 4 . 7 1–4 .9 7 ( m , 1 H ) , 6 . 5 0–6 . 8 9 ( m , 2 H ) , 7 . 1 6–7 . 3 0 ( m , 1 H ) , 7 . 3 7– 7 . 7 0 ( m , 2 H ) , 7 .8 0–7 . 9 9 ( m , 1 H) , 8 . 6 1 ( s , 1 H) , 1 0 . 5 7 ( b r s , 1 H) . ^{1 3}C N M R ( 7 5 M H z ,

155

C D C l3) δ 2 0 .9 , 2 4 .2 , 2 5 . 5 , 3 4 . 1 ( d , JC–F = 5 . 0 H z, 1 C ) , 4 5 . 1 ( d , JC–F = 2 .8 H z , 1 C ) , 5 1 . 5 , 5 1 . 9 , 5 8 . 9 , 7 0 . 7 , 1 0 6 .2 ( d , JC–F = 2 . 8 H z, 1 C ) , 1 0 9 .9 ( d , JC–F = 2 2 . 0 H z , 1 C ) , 1 1 2 . 8 ( d , J = 1 9 . 8 H z , 1 C ) , 1 2 4 . 3 , 1 2 5 . 2 , 1 3 1 .2 ( d , JC–F = 9 . 4 H z, 1 C ) , 1 3 6 .9 , 1 4 3 . 8 ( d , JC–F = 8 .3 H z, 1 C ) , 1 4 8 .3 , 1 5 3 .3 , 1 5 8 .5 ( d , JC–F = 2 4 7 . 6 H z , 1 C ) 1 6 6 .2 , 1 6 9 . 5 , 1 7 5 . 7 . M S m/z 4 2 6 ( M + H )⁺. A n a l . C a l c d f o r C2 3H2 4F N3O4·1 . 1 H2O : C , 6 2 . 0 4 ; H , 5 . 9 3 ; N , 9 . 4 4 . F o u n d : C , 6 2 .3 2 ; H , 5 . 9 5 ; N, 9 .4 8 .

( ± ) - M e t h y l ( 3S, 3 'R, 5 'S) 5 f l u o ro 5 ' i s o b u t y l 2 o x o 1 ' ( p y r i d i n 2 y l c a r bo n y l ) 1 , 2 -d i h y -d r o s p i r o [ i n -d o l e - 3 , 2 ' - p y r r o l i -d i n e ] - 3 '- c a r b o x y l a t e ( 7 5 ) . C o m p o u n d 7 5 w a s p r ep a r e d f r o m 1 0 0 f i n a s i m i l a r m an n e r to t h a t d e s c r i b ed f o r t h e s y n th e s i s o f c o m p o u n d 5 0 a n d o b t a i n e d i n 8 8 % y i e l d a s a w h i t e s o l i d . m . p . 1 9 1–1 9 3 ° C . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l3) δ 0 . 7 4 ( d , J = 6 . 5 H z , 3 H ) , 0 .8 0 ( d , J = 6 . 6 H z, 3 H) , 0 . 9 5–1 .0 8 ( m , 1 H ) , 1 . 3 3–1 . 4 4 ( m , 1 H ) , 1 . 5 3–1 . 6 6 ( m , 1 H ) , 2 .2 7–2 .4 8 ( m , 1 H ) , 2 .6 1–2 .8 0 ( m , 1 H ) , 3 .3 2 ( s , 3 H ) , 3 . 6 9 ( d d , J = 1 2 .8 , 7 . 4 H z , 1 H ) , 5 . 1 7–5 .3 6 ( m , 1 H ) , 6 .8 0 ( d d , J = 8 .4 , 4 .5 H z , 1 H) , 6 .9 0–6 . 9 9 ( m , 2 H ) , 7 . 3 7 ( d d d , J = 7 . 5 , 4 . 8 , 1 . 3 H z , 1 H ) , 7 . 6 8 ( d , J = 7 . 8 H z , 1 H) , 7 .7 4–7 . 8 0 ( m , 1 H ) , 7 .9 8 ( s , 1 H ) , 8 . 6 1 ( d , J = 4 .8 H z , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 7 5 M H z , C D C l3) δ 2 0 .9 , 2 4 .2 , 2 5 . 6 , 3 3 .9 , 4 7 . 5 , 5 1 . 2 , 5 1 . 9 , 5 7 . 9 , 7 1 .3 , 1 1 0 .4 ( d , JC–F = 7 . 7 H z , 1 C ) , 1 1 1 .9 ( d , JC–F = 2 5 . 3 H z , 1 C ) , 1 1 5 .8 ( d , JC– F = 2 3 .7 H z , 1 C ) , 1 2 4 . 5 , 1 2 5 . 4 , 1 2 8 .5 ( d , JC–F = 7 . 7 H z , 1 C ) , 1 3 7 . 0 , 1 3 7 .6 ( d , JC–F = 2 . 2 H z , 1 C ) , 1 4 8 .2 , 1 5 2 . 9 , 1 5 8 . 7 ( d , JC–F = 2 4 0 .4 H z , 1 C ) , 1 6 5 . 7 , 1 6 9 . 3 , 1 7 5 .9 . M S m/z 4 2 6 ( M + H )⁺. A n a l . C a l c d f o r C2 3H2 4F N3O4·0 . 6 H2O : C , 6 3 . 3 2 ; H , 5 .8 2 ; N , 9 . 6 3 . F o u n d : C , 6 3 . 5 3 ; H , 5 . 7 3 ; N , 9 . 3 5 .

( ± ) - M e t h y l ( 3S, 3 'R, 5 'S) 5 c h l o r o 5 ' i s o b u t y l 2 o x o 1 ' ( p y r i d i n 2 y l c a r bo n y l ) 1 , 2 -d i h y -d r o s p i r o [ i n -d o l e - 3 , 2 ' - p y r r o l i -d i n e ] - 3 '- c a r b o x y l a t e ( 7 6 ) . C o m p o u n d 7 6 w a s p r ep a r e d f r o m 1 0 0 g i n a s i m i l a r m an n e r to t h a t d e s c r i b ed f o r t h e s y n th e s i s o f c o m p o u n d 5 0 a n d o b t a i n e d i n 3 5 % y i e l d a s a w h i t e s o l i d . m . p . 2 4 1–2 4 3 ° C . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l3) δ 0 . 7 5 ( d , J = 6 . 6 H z, 3 H ) , 0 . 8 1 ( d , J = 6 . 7 H z , 3 H) , 1 . 0 2 ( d d d , J = 1 2 . 8 , 1 0 . 3 , 2 . 9 H z, 1 H ) , 1 . 3 3–1 .4 6 ( m , 1 H ) , 1 .5 6–1 .7 1 ( m , 1 H ) , 2 .2 7–2 . 4 8 ( m , 1 H ) , 2 . 6 1–2 .8 2 ( m , 1 H ) , 3 . 3 4 ( s , 3 H) , 3 . 6 7 ( d d , J = 1 2 .8 , 7 . 4 H z , 1 H ) , 5 . 2 0–5 .3 7 ( m , 1 H ) , 6 . 8 1 ( d , J = 8 . 3 H z , 1 H ) , 7 . 1 3 ( d , J = 2 . 0 H z, 1 H ) , 7 . 2 3 ( d d , J = 8 . 3 , 2 .0 H z , 1 H ) , 7 .3 7 ( d d d , J = 7 . 5 , 4 .8 , 1 . 4 H z , 1 H ) , 7 . 6 8 ( d , J = 7 . 8 H z , 1 H ) , 7 . 7 2–7 . 8 1 ( m , 2 H ) , 8 . 5 7–8 . 6 5 ( m , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 7 5 M H z , C D C l3) δ 2 0 . 9 , 2 4 . 2 , 2 5 .6 , 3 4 . 0 , 4 7 . 4 , 5 1 . 2 , 5 1 .9 , 5 8 . 0 , 7 1 .0 , 1 1 0 .7 , 1 2 4 .3 , 1 2 4 . 6 , 1 2 5 . 4 , 1 2 7 . 5 ,

156

1 2 8 .9 , 1 2 9 . 5 , 1 3 7 . 0 , 1 4 0 . 0 , 1 4 8 . 2 , 1 5 2 .9 , 1 6 5 . 7 , 1 6 9 .2 , 1 7 5 . 4 . M S m/z 4 4 2 ( M + H)⁺. A n a l.

C a l c d f o r C2 3H2 4F N3O4·0 .4 C4H8O2: C , 6 1 .9 2 ; H , 5 . 7 5 ; N , 8 . 8 1 . F o u n d : C , 6 1 . 8 3 ; H , 5 . 7 2 ; N , 8 . 8 7 . P u r i ty 1 0 0 % ( H P L C ) .

( ± ) - M e t h y l ( 3S, 3 'R, 5 'S) 6 f l u o ro 5 ' i s o b u t y l 2 o x o 1 ' ( p y r i d i n 2 y l c a r bo n y l ) 1 , 2 -d i h y -d r o s p i r o [ i n -d o l e - 3 , 2 ' - p y r r o l i -d i n e ] - 3 '- c a r b o x y l a t e ( 7 7 ) . C o m p o u n d 7 7 w a s p r ep a r ed f r o m 1 0 0 h i n a s i m i l a r m a n n er t o th a t d e s c r i b ed f o r th e s y n t h e s i s o f c o m p o u n d 5 0 a n d o b t a i n e d i n 2 8 % y i e l d a s a w h i t e s o l i d . m .p . 2 0 2–2 0 4 ° C . ¹H N M R ( 4 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 0 . 5 9–0 .7 2 ( m , 7 H ) , 1 .3 5–1 .5 4 ( m , 2 H ) , 2 .2 3–2 . 3 3 ( m , 1 H ) , 2 . 5 9–2 .6 9 ( m , 1 H ) , 3 . 2 3 ( s , 3 H) , 3 .4 7–3 . 5 0 ( m , 1 H ) , 4 . 7 7–5 .0 4 ( m , 1 H ) , 6 . 6 0–6 . 7 6 ( m , 2 H ) , 7 . 2 0–7 . 3 0 ( m , 1 H ) , 7 . 5 0– 7 . 5 8 ( m , 2 H) , 7 .8 7–7 . 9 6 ( m , 1 H) , 8 .6 1 ( d , J = 4 . 4 H z , 1 H) , 1 0 . 7 9 ( b r s , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 7 5 M H z , C D C l3) δ 2 0 . 9 , 2 4 . 2 , 2 5 .5 , 3 3 . 8 , 4 7 . 5 , 5 1 . 1 , 5 1 .9 , 5 7 . 8 , 7 0 . 6 , 9 8 . 7 ( d , JC–F = 2 7 .5 H z , 1 C ) , 1 0 8 .6 ( d , JC–F = 2 3 . 1 H z , 1 C ) , 1 2 2 . 6 ( d , JC–F = 3 .3 0 H z , 1 C ) , 1 2 4 . 5 , 1 2 5 .0 ( d , JC–F = 9 . 9 H z , 1 C ) , 1 2 5 . 4 , 1 3 7 . 0 , 1 4 3 .2 ( d , JC–F = 1 2 . 1 H z , 1 C ) , 1 4 8 . 2 , 1 5 3 . 0 , 1 6 3 .5 ( d , JC–F = 2 4 6 .5 H z , 1 C ) , 1 6 5 . 6 , 1 6 9 . 5 , 1 7 6 .2 . M S m/z 4 2 6 ( M + H )⁺. A n a l . C a l c d f o r C2 3H2 4F N3O4·0 . 2 H2O : C , 6 4 . 3 8 ; H , 5 . 7 3 ; N , 9 .7 9 . Fo u n d : C , 6 4 . 1 4 ; H , 5 . 8 5 ; N , 9 . 8 0 .

( ± ) - M e t h y l ( 3S, 3 'R, 5 'S) 7 f l u o ro 5 ' i s o b u t y l 2 o x o 1 ' ( p y r i d i n 2 y l c a r bo n y l ) 1 , 2 -d i h y -d r o s p i r o [ i n -d o l e - 3 , 2 ' - p y r r o l i -d i n e ] - 3 '- c a r b o x y l a t e ( 7 8 ) . C o m p o u n d 7 8 w a s p r ep a r ed f r o m 1 0 0 i i n a s i m i l a r m a n n e r t o t h a t d e s c r i b ed f o r t h e s y n t h e s i s o f co m p o u n d 5 0 an d o b t a i n e d i n 2 0 % y i e l d a s a w h i t e s o l i d . m .p . 2 3 4–2 3 6 ° C . ¹H N M R ( 4 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 0 . 5 6–0 .7 4 ( m , 7 H ) , 1 .3 4–1 .5 8 ( m , 2 H ) , 2 .2 2–2 . 3 5 ( m , 1 H ) , 2 . 6 1–2 .7 1 ( m , 1 H ) , 3 . 2 2 ( s , 3 H) , 3 .5 0–3 . 5 4 ( m , 1 H ) , 4 . 8 3–5 .0 2 ( m , 1 H ) , 6 . 9 2–6 . 9 6 ( m , 1 H ) , 7 . 0 3–7 . 2 3 ( m , 2 H ) , 7 . 4 6– 7 . 6 1 ( m , 2 H) , 7 .8 4–7 . 9 4 ( m , 1 H) , 8 .6 2 ( d , J = 4 . 4 H z , 1 H) , 1 1 . 1 2 ( b r s , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 7 5 M H z , C D C l3) δ 2 0 . 9 , 2 4 . 2 , 2 5 .6 , 3 3 . 9 , 4 7 . 5 , 5 1 . 3 , 5 1 .9 , 5 7 . 9 , 7 1 . 1 ( d , JC–F = 3 . 3 H z, 1 C ) , 1 1 6 .6 3 ( d , JC–F = 1 7 .1 H z , 1 C ) , 1 1 9 . 5 7 ( d , JC–F = 3 . 3 H z , 1 C ) , 1 2 2 .9 ( d , JC–F = 6 . 1 H z , 1 C ) , 1 2 4 .6 ( s , 1 C ) , 1 2 5 . 4 ( s , 1 C ) , 1 2 8 . 8 ( d , JC–F = 1 2 . 7 H z , 1 C ) , 1 2 9 . 8 ( d , JC–F = 3 . 3 H z , 1 C ) , 1 3 6 .9 , 1 4 6 . 9 ( d , JC–F = 2 4 3 . 7 H z , 1 C ) , 1 4 8 . 2 , 1 5 2 .9 , 1 6 5 . 6 , 1 6 9 . 3 , 1 7 4 . 9 . M S m/z 4 2 6 ( M + H )⁺. A n a l. C a l c d f o r C2 3H2 4F N3O4·0 . 4 H2O : C , 6 3 .8 5 ; H , 5 .7 8 ; N , 9 .7 1 . F o u n d : C , 6 4 .0 5 ; H , 6 . 0 7 ; N , 9 . 8 0 .

( ± ) - M e t h y l ( 3S,3 'R, 5 'S) 1 ' b e n z o y l 5 f l u o ro 5 ' i s o b u t y l 2 o x o 1 ,2 -d i h y -d r o s p i r o [ i n -d o l e - 3 , 2 ' - p y r r o l i -d i n e ] - 3 '- c a r b o x y l a t e ( 7 9 ) . C o m p o u n d 7 9 w a s p r ep a r ed

157

f r o m 1 0 0 f a n d b en z o y l c h lo r i d e in a s i m i l a r m a n n e r to t h a t d e s c r ib e d f o r t h e s y n t h e s i s o f c o m p o u n d 5 0 a n d o b t a i n ed i n 4 7 % y i e ld a s a w h i t e s o l i d . m .p . 2 1 1–2 1 3 ° C . ¹H N M R ( 4 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 0 . 3 8–0 .5 2 ( m , 3 H ) , 0 . 5 9–0 . 7 2 ( m , 3 H) , 0 .8 0–1 . 0 4 ( m , 1 H) , 1 .3 2–1 . 5 1 ( m , 2 H ) , 2 .2 1–2 .3 9 ( m , 1 H ) , 2 . 5 4–2 .6 8 ( m , 1 H ) , 3 .2 2 ( s , 3 H ) , 3 . 4 2–3 . 5 7 ( m , 1 H ) , 4 .2 5– 4 . 4 3 ( m , 1 H ) , 6 . 7 5–6 . 8 5 ( m , 1 H ) , 7 . 0 3–7 . 0 9 ( m , 1 H ) , 7 .0 9–7 . 1 7 ( m , 1 H ) , 7 . 3 2–7 .5 7 ( m , 5 H) , 1 0 . 6 4 ( b r s , 1 H) . ^{1 3}C N M R ( 7 5 M H z , D M S O -d6) δ 2 1 . 1 , 2 4 .2 , 2 5 . 4 , 3 3 . 6 , 4 5 . 8 , 5 1 . 2 , 5 2 . 0 , 5 8 . 0 , 7 1 .0 , 1 1 0 .4 ( d , JC–F = 9 . 4 H z , 1 C ) , 1 1 2 .0 ( d , JC–F = 2 4 . 2 H z , 1 C ) , 1 1 5 .7 ( d , JC– F = 2 3 . 7 H z , 1 C ) , 1 2 7 . 1 ( 2 C ) , 1 2 8 .9 ( 2 C ) , 1 2 9 . 6 , 1 3 0 . 6 , 1 3 6 .7 , 1 3 9 . 4 , 1 5 8 . 2 ( d , JC–F = 2 3 7 .1 H z , 1 C ) , 1 6 8 . 2 , 1 6 9 . 3 , 1 7 5 .9 . M S m/z 4 2 5 ( M + H )⁺. A n a l . C a l c d f o r C2 4H2 5F N2O4·0 . 1 H2O : C , 6 7 . 6 2 ; H , 5 . 9 6 ; N , 6 .5 7 . Fo u n d : C , 6 7 . 5 2 ; H , 5 . 9 6 ; N , 6 . 4 4 .

( ± ) - M e t h y l ( 3S, 3 'R, 5 'S) 5 f l u o ro 5 ' i s o b u t y l 2 o x o 1 ' ( p y r i d i n 3 y l c a r bo n y l ) 1 , 2 -d i h y -d r o s p i r o [ i n -d o l e - 3 , 2 ' - p y r r o l i -d i n e ] - 3 '- c a r b o x y l a t e ( 8 0 ) . C o m p o u n d 8 0 w a s p r ep a r ed f r o m 1 0 0 f a n d n i c o t i n o y l c h lo r i d e i n a s i m i l a r m a n n e r t o t h a t d e s c r i b e d f o r t h e s y n t h e s i s o f c o m p o u n d 5 0 an d o b t a in e d i n 5 7 % y i e l d a s a w h i t e s o l i d . m . p . 2 0 2–2 0 4 ° C . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l3) δ 0 . 4 7–0 . 6 6 ( m , 3 H) , 0 . 6 9–0 . 8 7 ( m , 3 H ) , 1 . 0 4–1 .1 7 ( m , 1 H ) , 1 . 3 3–1 .4 6 ( m , 1 H ) , 1 . 4 8–1 .5 7 ( m , 1 H ) , 2 . 2 9–2 . 4 7 ( m , 1 H ) , 2 .7 0 ( d t , J = 1 3 . 5 , 6 . 8 H z , 1 H ) , 3 .3 2 ( s , 3 H) , 3 .5 4–3 . 7 2 ( m , 1 H ) , 4 . 2 8–4 .5 4 ( m , 1 H ) , 6 . 7 1–6 . 8 6 ( m , 1 H ) , 6 . 8 7–7 . 0 7 ( m , 2 H ) , 7 . 3 0– 7 . 4 6 ( m , 1 H ) , 7 . 7 6–8 . 0 0 ( m , 2 H) , 8 .7 0 ( b r s , 1 H ) , 8 . 7 8 ( b r s , 1 H) . ^{1 3}C N M R ( 7 5 M H z , D M S O -d6) δ 2 1 . 1 , 2 4 .2 , 2 5 . 4 , 3 3 .6 , 4 6 .1 , 5 1 . 3 , 5 2 .1 , 5 8 . 0 , 7 1 . 1 , 1 1 0 . 5 , 1 1 2 .2 ( d , JC–F = 2 4 . 8 H z , 1 C ) , 1 1 5 . 8 ( d , JC–F = 2 3 . 7 H z , 1 C ) , 1 2 4 .1 , 1 2 9 .2 ( d , JC–F = 7 .7 H z , 1 C ) , 1 3 2 . 5 , 1 3 5 .0 , 1 3 9 . 4 , 1 4 7 . 8 , 1 5 1 . 6 , 1 5 8 .2 ( d , JC–F = 2 3 7 .1 H z , 1 C ) , 1 6 6 .1 , 1 6 9 .2 , 1 7 5 . 7 . M S m/z 4 2 6 ( M + H )⁺. A n a l . C a l c d f o r C2 3H2 4F N3O4·0 . 6 H2O : C , 6 3 .3 2 ; H, 5 . 8 2 ; N , 9 . 6 3 . F o u n d : C , 6 3 . 3 9 ; H , 5 . 8 5 ; N , 9 . 6 0 .

( ± ) - M e t h y l ( 3S, 3 'R, 5 'S) 5 f l u o ro 5 ' i s o b u t y l 1 ' i s o n i c o t i n o y l 2 o x o 1 ,2 -d i h y -d r o s p i r o [ i n -d o l e - 3 , 2 ' - p y r r o l i -d i n e ] - 3 '- c a r b o x y l a t e ( 8 1 ) . C o m p o u n d 8 1 w a s p r ep a r ed f r o m 1 0 0 f an d i s o n i c o t in o y l c h l o r id e i n a s i m i l a r m a n n er t o th a t d e s c r i b e d f o r t h e s y n th e s i s o f c o m p o u n d 5 0 a n d o b t a i n ed in 2 8 % y i e l d a s a wh i t e s o l i d . m . p . 2 2 5–2 2 7 ° C .

1H N M R ( 4 0 0 M H z , D M S O -d6, T = 9 0 ° C ) δ 0 . 5 9 ( b r s , 3 H ) , 0 .7 8 ( b r s , 4 H ) , 1 . 4 0–1 . 5 9 ( m , 2 H) , 2 . 2 4–2 . 3 6 ( m , 1 H) , 2 .6 3 ( d t , J = 1 3 . 3 , 6 . 8 H z , 1 H ) , 3 .0 0 ( s , 3 H ) , 3 .5 0 ( d d , J = 1 2 .5 , 7 . 1 H z , 1 H ) , 4 .2 3–4 .3 6 ( m , 1 H) , 6 . 7 6 ( b r s , 1 H ) , 6 . 9 8–7 .1 0 ( m , 2 H) , 7 .2 6 ( b r s , 2 H) , 8 . 5 8

158

( b r s , 2 H) , 1 0 . 2 9 ( b r s , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 1 5 1 M H z , D M S O -d6) δ 2 0 . 4 , 2 3 . 5 , 2 4 .9 , 3 3 .0 , 4 5 .4 , 5 0 . 8 , 5 1 .5 , 5 7 . 4 , 7 0 . 4 ( d , JC–F = 1 . 1 H z , 1 C ) , 1 0 9 .1 ( d , JC–F = 7 .7 H z , 1 C ) , 1 1 1 . 6 ( d , JC–F

= 2 4 .9 H z , 1 C ) , 1 1 5 . 4 ( d , JC–F = 2 3 . 2 H z , 1 C ) , 1 2 0 .9 ( s , 2 C ) , 1 2 8 . 4 ( d , JC–F = 7 . 7 H z , 1 C ) , 1 3 8 .8 ( s , 1 C ) , 1 4 3 . 2 ( s , 1 C ) , 1 5 0 . 2 ( 2 C ) 1 5 7 .6 ( d , JC–F = 2 3 6 .6 H z , 1 C ) , 1 6 5 .7 , 1 6 8 . 6 , 1 7 5 .0 . M S m/z 4 2 6 ( M + H )⁺. A n a l. C a l c d f o r C2 3H2 4F N3O4·0 . 1 H2O : C , 6 4 .6 6 ; H , 5 .7 1 ; N , 9 . 8 3 . F o u n d : C , 6 4 . 4 0 ; H , 5 . 8 0 ; N , 9 . 8 4 .

( ± ) - M e t h y l ( 3S, 3 'R, 5 'S) - 5 - f l u o ro - 5 '- i s o b u t y l - 1 ' - ( ( 1 - m e t h y l - 1H p y r a zo l 3 y l ) ca r b o n y l ) -2 - o x o - 1 , -2 - d i h y d r o s p i r o [ i n d o l e - 3 ,-2 ' - p y r r o l i d i n e ] - 3 ' - c a r bo x y la t e ( 8 -2 ) . C o m p o u n d 8 2 w a s p r e p a r e d f r o m 1 0 0 f an d 1 - m e th y l - 1H- p y r a z o l e - 3 - c a r b o n y l c h lo r i d e i n a s i m i l a r m an n er t o t h a t d e s c r i b e d f o r th e s y n th e s i s o f c o m p o u n d 5 0 a n d o b t a in e d i n 3 0 % y i e ld a s a w h i t e s o l i d . m .p . 2 4 0–2 4 2 ° C . ¹H N M R ( 4 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 0 .8 4 ( d , J = 6 .4 H z , 6 H ) , 1 . 2 3– 1 . 3 0 ( m , 1 H ) , 1 . 4 1–1 . 4 7 ( m , 1 H ) , 1 . 5 9–1 . 6 6 ( m , 1 H ) , 2 .2 6–2 . 3 5 ( m , 1 H ) , 2 . 6 0–2 .6 7 ( m , 1 H) , 3 .2 1 ( s , 3 H ) , 3 . 4 0–3 . 4 5 ( m , 1 H ) , 3 .8 9 ( s , 3 H) , 4 .9 2–4 . 9 8 ( m , 1 H ) , 6 . 4 1 ( d , J = 2 .4 H z , 1 H) , 6 . 7 8 ( d d , J = 8 . 0 , 4 . 8 H z , 1 H ) , 7 . 0 1–7 . 0 6 ( m , 2 H ) , 7 . 7 5 ( d , J = 2 . 0 H z , 1 H ) , 1 0 .5 7 ( b r s , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 7 5 M H z , C D C l3) δ 2 1 .0 , 2 4 . 3 , 2 5 . 9 , 3 3 .7 , 3 9 .3 , 4 6 . 9 , 5 1 . 1 , 5 1 .9 , 5 7 .8 , 7 1 . 2 , 1 0 9 .6 , 1 1 0 . 2 ( d , JC–F = 7 . 7 H z , 1 C ) , 1 1 2 . 0 ( d , JC–F = 2 4 . 8 H z , 1 C ) , 1 1 5 . 6 ( d , JC–F = 2 3 . 1 H z , 1 C ) , 1 2 8 . 9 ( d , JC–F = 7 .7 H z , 1 C ) , 1 3 0 . 5 , 1 3 7 . 5 , 1 4 6 . 4 , 1 5 8 . 7 ( d , JC–F = 2 4 0 . 4 H z , 1 C ) , 1 6 1 .5 , 1 6 9 . 6 , 1 7 6 . 1 . M S m/z 4 2 9 ( M + H)⁺. A n a l . C a l c d f o r C2 2H2 5F N4O4·0 . 3 H2O : C , 6 0 . 9 0 ; H , 5 . 9 5 ; N , 1 2 . 9 1 . F o u n d : C , 6 1 . 1 9 ; H , 5 . 9 8 ; N, 1 2 . 9 0 .

( ± ) - M e t h y l ( 3S, 3 'R, 5 'S) - 5 - f l u o ro - 5 ' - i s o b u t y l - 1 ' - ( ( 1 - m e t h y l - 1H im i d a zo l 2 -y l) c a r b o n -y l ) - 2 - o x o - 1 ,2 - d i h -y d r o s p i r o [ i n d o l e - 3 , 2 ' - p -y r ro l i d i n e ] - 3 ' - ca r b o x -y l a t e ( 8 3 ) . A m ix t u r e o f 1 0 0 f ( 1 0 0 m g , 0 .3 1 2 m m o l ) , 1 - m e th y l - 1H- i m id a z o l e - 2 - c a r b o x y l i c a c id ( 7 9 m g , 0 . 6 3 m m o l ) , H A T U ( 1 7 8 m g , 0 .4 6 8 m m o l ) , a n d D I P E A ( 0 . 5 7 4 m L , 3 . 3 0 m m o l ) in D M F ( 5 m L ) w a s h e a t e d t o 9 0 ° C a n d s t i r r ed f o r 1 8 h u n d er N2. T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s d i l u t e d w i t h w a t e r an d e x t r a c t e d w i t h E t O A c . T h e o r g a n i c l a y er w a s s e p ar a t e d , w a s h e d w i t h b r in e , d r i e d o v e r N a2S O4, a n d c o n c e n t r a t ed . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i e d b y p r ep a r a t i v e H P L C ( co n d i t i o n 1 , 0 .0 5 % a q u eo u s am m o n i a s o l u t io n / M e C N = 6 5 /3 5 t o 2 5 / 7 5 ) t o af f o r d 8 3 ( 4 2 m g , 3 2 % ) a s a wh i t e s o l id . m . p . 2 2 8–2 3 0 ° C . ¹H N M R ( 4 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 0 . 7 4–0 . 8 2 ( m , 6 H ) , 0 .9 2–0 . 9 9 ( m , 1 H ) , 1 . 4 2–1 .6 7 ( m , 2 H ) , 2 . 2 9–2 .3 5 ( m , 1 H ) , 2 .5 8–2 . 6 4 ( m , 1 H ) , 3 . 2 1 ( s , 3 H ) , 3 .4 4–3 .4 8 ( m , 1 H ) , 3 . 5 8 ( s , 3 H ) , 4 .9 5–5 . 0 6 ( m , 1 H ) , 6 . 7 5–6 . 8 5 ( m , 1 H ) ,

159

6 . 9 9–7 .1 4 ( m , 3 H ) , 7 . 3 0 ( s , 1 H ) , 1 0 . 6 4 ( s , 1 H) . ^{1 3}C N M R ( 7 5 M H z , D M S O -d6) δ 2 0 . 9 , 2 3 . 9 , 2 5 .1 , 3 2 . 6 , 3 4 .1 , 4 5 . 9 , 5 0 .9 , 5 1 . 4 , 5 7 .8 , 7 0 . 4 , 1 0 9 . 8 ( d , JC–F = 7 . 7 0 H z , 1 C ) , 1 1 1 . 4 ( d , JC–F = 2 5 .3 H z , 1 C ) , 1 1 5 . 2 ( d , JC–F = 2 3 .1 H z , 1 C ) , 1 2 4 . 5 , 1 2 7 .0 , 1 2 8 .8 ( d , JC–F = 7 .7 H z , 1 C ) , 1 3 8 . 7 ( d , JC–F = 1 .7 H z , 1 C ) , 1 3 8 . 8 , 1 5 7 . 5 ( d , JC–F = 2 3 6 . 0 H z , 1 C ) , 1 5 7 . 8 , 1 6 8 . 8 , 1 7 5 .0 . M S m/z 4 2 9 ( M + H )⁺. A n a l. C a l c d f o r C2 2H2 5F N4O4·0 . 9 H2O : C , 5 9 .4 2 ; H , 6 .0 7 ; N , 1 2 . 6 0 . F o u n d : C , 5 9 .5 9 ; H , 6 .0 9 ; N , 1 2 .5 0 .

( ± ) - M e t h y l ( 3S, 3 'R, 5 'S) - 5 - f l u o ro - 5 ' - i s o b u t y l - 1 ' - ( ( 1 - m e t h y l - 1H im i d a zo l 4 -y l) c a r b o n -y l ) - 2 - o x o - 1 ,2 - d i h -y d r o s p i r o [ i n d o l e - 3 , 2 ' - p -y r ro l i d i n e ] - 3 ' - ca r b o x -y l a t e ( 8 4 ) . T o a s o l u t i o n o f 1 0 0 f ( 3 .5 0 g , 1 0 . 9 m m o l ) , 1 - m e th y l - 1H- i m id a z o l e - 4 - c a r b o x y l i c ac i d ( 2 .7 6 g , 2 1 . 9 m m o l ) an d D I P E A ( 1 1 . 4 m L , 6 5 .4 m m o l ) i n D M A ( 9 0 m L ) w a s a d d e d P y B r o P ( 1 7 . 8 g , 3 8 . 2 m m o l ) a t r o o m t e m p e r a t u r e . T h e m i x tu r e w a s s t i r r e d a t 1 0 0 ° C f o r 0 . 5 h . T h e m i x t u r e w a s p o u r ed i n t o w a t e r a t r o o m t e m p er a t u r e a n d e x t r a c t ed w i t h E t O A c–T H F . T h e o r g a n i c l a y er w a s s e p a r a t e d , w a s h ed w i t h w a t er a n d b r in e , f i l t r a t e d to r em o v e in s o l u b l e m a t e r i a l , d r i e d o v e r N a2S O4, a n d co n c en t r a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i e d b y s i l i c a g e l c o l u m n c h r o m a to g r ap h y ( E t O A c / M e O H = 1 0 /0 t o 7 /3 ) a n d N H - s i l i c a g e l c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y ( E t O A c / M e O H = 1 / 0 t o 1 / 1 ) t o g i v e 8 4 ( 3 .3 7 g , 7 2 % ) a s a wh i t e s o l i d . m .p . 2 5 8–2 6 0 ° C .

1H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l3) δ 0 . 9 3 ( d , J = 6 . 2 H z , 3 H ) , 0 . 9 8 ( d , J = 6 . 1 H z , 3 H ) , 1 .4 3 ( d d , J = 1 0 . 6 , 8 . 5 H z , 1 H) , 1 . 7 3–1 . 8 9 ( m , 2 H ) , 2 . 4 2 ( td , J = 1 2 . 8 , 8 . 8 H z , 1 H ) , 2 . 7 2 ( d t , J = 1 3 . 4 , 7 .5 H z , 1 H) , 3 . 3 1 ( s , 3 H ) , 3 . 6 0 ( d d , J = 1 2 . 2 , 7 .7 H z , 1 H) , 3 . 6 7 ( s , 3 H ) , 5 . 3 1–5 . 5 1 ( m , 1 H ) , 6 .7 7 ( d d , J = 8 . 3 , 4 . 3 H z , 1 H ) , 6 . 8 7–6 . 9 9 ( m , 2 H ) , 7 .3 5 ( s , 1 H) , 7 .4 0 ( d , J = 1 . 0 H z , 1 H) , 7 .6 2 ( s , 1 H) . ^{1 3}C N M R ( 1 5 1 M H z , D M S O -d6) δ 2 1 . 0 , 2 4 . 0 , 2 5 . 2 , 3 2 .8 , 3 3 . 1 , 4 6 .1 , 5 0 . 7 , 5 1 . 4 , 5 6 . 7 , 7 0 . 6 , 1 0 9 .6 ( d , JC–F = 7 . 7 H z , 1 C ) , 1 1 1 . 2 ( d , JC–F = 2 4 . 9 H z , 1 C ) , 1 1 4 . 8 ( d , JC–F = 2 3 . 2 H z , 1 C ) 1 2 5 . 9 , 1 2 9 . 6 ( d , JC–F = 7 .2 H z, 1 C ) , 1 3 6 . 4 , 1 3 7 . 5 , 1 3 8 .8 , 1 5 7 . 4 ( d , JC–F = 2 3 6 . 6 H z , 1 C ) , 1 6 0 .9 , 1 6 9 . 1 , 1 7 5 . 5 . M S m/z 4 2 9 ( M + H )⁺. A n a l . C a l c d f o r C2 2H2 5F N4O4·H2O : C , 6 1 . 6 7 ; H, 5 .8 8 ; N , 1 3 . 0 8 . Fo u n d : C , 6 1 . 3 7 ; H , 5 .8 2 ; N , 1 3 .1 0 .

( ± ) - M e t h y l ( 3S,3 'R, 5 'S) - 5 - f l u o ro - 1 '- ( 1H i m i d a zo l 4 y l c a r b o n y l) 5 ' i s o b u t y l 2 o x o 1 ,2 -d i h y -d r o s p i r o [ i n -d o l e - 3 , 2 ' - p y r r o l i -d i n e ] - 3 '- c a r b o x y l a t e ( 8 5 ) . T o a m i x tu r e o f 1 - t r i ty l - 1H -i m -i d az o l e - 4 - c a r b o x y l -i c a c -i d ( 4 0 0 m g , 1 .1 3 m m o l) -i n T H F ( 1 0 m L ) w a s a d d ed a s o l u t -i o n o f 1 - c h l o r o -N,N, 2 - tr i m e t h y l - 1 - p r o p e n y l a m i n e ( 0 . 3 0 m L , 2 . 3 m m o l ) i n T H F ( 2 m L ) a t 0 ° C u n d er N2. T h e r e a c t i o n m ix t u r e w a s w a r m e d t o r o o m t e m p e r a t u r e , s t i r r ed f o r 3 h a n d t h e n

160

c o o l e d t o 0 ° C . T o t h e r e a c t io n m ix t u r e w a s a d d e d a s o lu t i o n o f 1 0 0 f ( 7 3 0 m g , 2 . 2 8 m m o l) a n d D I P E A ( 1 . 3 8 m L , 7 . 8 9 m m o l ) i n T H F ( 2 m L ) a t 0 ° C u n d er N2. T h e r e a c t i o n m ix t u r e w a s h e a t e d t o 6 0 ° C a n d s t i r r ed f o r 1 6 h . T h e r e a c t io n m i x t u r e w a s d i l u t ed w i t h w a t e r a n d e x tr a c t e d w i t h E t O A c . T h e o r g a n i c l a y e r w a s s e p ar a t e d , w a s h e d w i t h b r i n e , d r i e d o v er N a2S O4, a n d co n c en t r a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i e d b y p r e p a r a t i v e T L C ( p e t r o l eu m e t h er / E t O A c = 1 / 1 ) t o af f o r d ( ± ) -m e t h y l ( 3S, 3 'R, 5 'S) 5 f l u o r o 5 ' i s o b u t y l 2 o x o 1 ' ( ( 1 -t r i -t y l- 1H- i m id a z o l - 4 - y l ) c ar b o n y l ) - 1 ,2 - d ih y d r o s p i r o [ i n d o l e - 3 , 2 ' - p y r r o l i d in e ] - 3

'-c a r b o x y l a t e ( 4 4 0 m g , 5 9 % ) a s a y e l l o w s o l id . ¹H N M R ( 4 0 0 M H z , D M S O–d6) δ 0 .8 0–0 .9 1 ( m , 6 H ) , 1 .3 2–1 . 4 7 ( m , 2 H ) , 1 . 6 4–1 .6 7 ( m , 1 H ) , 2 . 2 8–2 .3 6 ( m , 1 H ) , 2 .5 5–2 . 6 4 ( m , 1 H ) , 3 . 2 0 ( s , 3 H ) , 3 . 3 8–3 . 4 2 ( m , 1 H ) , 4 . 9 8–5 .1 4 ( m , 1 H ) , 6 .7 0–6 . 8 0 ( m , 1 H ) , 7 . 0 0–7 .1 0 ( m , 8 H) , 7 . 3 8–7 .4 3 ( m , 1 0 H ) , 7 .4 7–7 . 5 0 ( m , 1 H) , 1 0 . 5 3 ( s , 1 H ) .

A m ix t u r e o f ( ± ) -m e t h y l ( 3S,3 'R, 5 'S) - 5 - f l u o r o - 5 ' - i s o b u ty l - 2 - o x o - 1 '- ( ( 1 - t r i ty l - 1H- im i d a z o l-4 - y l ) c ar b o n y l ) - 1 ,2 - d ih y d r o s p i r o [ i n d o l e - 3 , 2 ' - p y r r o l i d i n e ] - 3 '- c a r b o x y l a t e ( l-4 l-4 0 m g , 0 . 6 7 m m o l ) i n T F A ( 8 m L ) , M e C N ( 6 m L ) , a n d w a t e r ( 6 m L ) w a s s t i r r e d a t 0 ° C f o r 1 h u n d e r N2. T h e r e a c t i o n m ix t u r e w a s p o u r e d i n t o s a t u r a t e d a q u e o u s N a H C O3, a n d th e m ix t u r e w a s e x tr a c t e d w i t h E t O A c . T h e o r g a n i c l a y e r w a s s e p ar a t e d , w a s h e d w i t h b r i n e , d r i e d o v er N a2S O4, a n d c o n c e n tr a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i e d b y p r ep a r a t i v e H P L C ( c o n d i t io n 1 , 0 . 0 5 % a q u e o u s a m m o n i a s o l u t i o n / M e C N = 7 8 / 2 2 t o 4 8 /5 2 ) t o af f o r d 8 5 ( 8 8 m g , 3 2 % ) a s a w h i t e s o l i d . m .p . 2 6 0–2 6 2 ° C . ¹H N M R ( 4 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 0 . 8 3–0 . 8 9 ( m , 6 H) , 1 . 3 1– 1 . 5 2 ( m , 2 H) , 1 . 6 0–1 . 7 3 ( m , 1 H ) , 2 .2 9–2 . 3 7 ( m , 1 H ) , 2 . 5 7–2 .6 6 ( m , 1 H ) , 3 . 2 1 ( s , 3 H ) , 3 . 3 8–3 .4 2 ( m , 1 H ) , 5 .1 4 ( s , 1 H ) , 6 . 7 3–6 . 8 1 ( m , 1 H ) , 6 . 9 6–7 . 0 7 ( m , 2 H ) , 7 . 4 6 ( s , 1 H ) , 7 . 7 3 ( s , 1 H ) , 1 0 . 5 2 ( s , 1 H ) , 1 2 . 4 5 ( b r s , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 1 5 1 M H z , D M S O -d6) δ 2 1 . 0 , 2 4 . 0 , 2 5 . 2 , 3 2 . 9 , 4 6 . 0 , 5 0 .7 , 5 1 . 4 , 5 6 . 7 , 7 0 . 6 , 1 0 9 . 6 ( d , JC–F = 7 . 7 H z , 1 C ) , 1 1 1 . 3 ( d , JC–F = 2 4 . 9 H z , 1 C ) , 1 1 4 . 8 ( d , JC–F = 2 3 . 2 H z , 1 C ) , 1 2 2 . 0 , 1 2 9 . 6 , 1 3 5 .3 , 1 3 6 .0 , 1 3 8 . 8 , 1 5 7 . 4 ( d , JC–F = 2 3 6 .1 H z , 1 C ) , 1 6 1 . 1 , 1 6 9 . 1 , 1 7 5 .5 . M S m/z 4 1 5 ( M + H )⁺. A n a l . C a l c d f o r C2 1H2 3F N4O4·0 . 6 H2O : C , 6 1 . 6 7 ; H , 5 . 8 8 ; N , 1 3 . 0 8 . F o u n d : C , 6 1 . 3 7 ; H , 5 . 8 2 ; N , 1 3 . 1 0 . ( ± ) - M e t h y l ( 3S, 3 'R, 5 'S) - 1 ' - ( ( 1 - b e n z y l - 1H im i d a z o l 4 y l ) c a r b o n y l ) 5 f l u o r o 5 ' -i s o b u t y l - 2 - o x o - 1 , 2 - d -i h y d ro s p -i r o [ -i n d o l e - 3 , 2 '- p y r ro l -i d -i n e ] - 3 ' - c a r bo x y la t e ( 8 6 ) . T o a s o l u t i o n o f 1 - b en z y l - 1H- i m id a z o l e - 4 - c a r b o x y l i c a c i d ( 3 0 7 m g , 1 .5 2 m m o l ) i n D M A ( 3 m L ) w e r e a d d ed D I P E A ( 0 . 9 2 7 m L , 5 . 3 1 m m o l) a n d P y C l U ( 5 0 5 m g , 1 .5 2 m m o l ) a t r o o m

161

t e m p e r a t u r e . T h e m i x t u r e w a s s t i r r e d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 2 0 m in . T o t h e r e a c t io n m ix t u r e w a s a d d ed 1 0 0 f ( 2 4 3 m g , 0 . 7 5 9 m m o l ) a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d t h e m i x tu r e w a s h ea t e d t o 8 0 ° C a n d s t i r r e d f o r 3 0 m in . T h e m i x t u r e w a s p o u r e d in t o w a t e r a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d e x tr a c t e d w i t h E t O A c . T h e o r g an i c l a y e r w a s s e p a r a t ed , w a s h ed w i t h w a t e r an d b r i n e , d r i ed o v e r N a2S O4, a n d c o n c e n tr a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i e d b y s i l i c a g e l c o l u m n ch r o m a to g r a p h y ( E t O A c / M e O H = 1 0 / 0 to 8 / 2 ) t o g i v e 8 6 ( 2 1 6 m g , 5 6 % ) a s a w h i t e s o l id . m . p . 2 2 6–2 2 8 ° C . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 0 . 8 2 ( d , J = 6 .4 H z , 6 H ) , 1 . 2 9–1 .4 5 ( m , 2 H ) , 1 .5 6–1 .7 3 ( m , 1 H ) , 2 .2 1–2 . 3 6 ( m , 1 H ) , 2 . 5 6–2 .6 8 ( m , 1 H ) , 3 . 2 1 ( s , 3 H) , 3 . 3 9 ( d d , J = 1 2 .3 , 7 . 3 H z , 1 H ) , 4 . 9 9–5 .1 5 ( m , 1 H ) , 5 . 2 3 ( s , 2 H) , 6 . 7 6 ( d d , J = 8 .9 , 4 . 3 H z , 1 H ) , 6 . 9 6–7 .0 7 ( m , 2 H ) , 7 .2 2 ( d , J = 7 . 3 H z, 2 H ) , 7 . 2 6–7 . 4 0 ( m , 3 H ) , 7 . 5 3 ( s , 1 H ) , 7 . 8 6 ( s , 1 H ) , 1 0 .5 1 ( s , 1 H) . ^{1 3}C N M R ( 7 5 M H z , D M S O -d6) δ 2 1 . 5 , 2 4 . 5 , 2 5 . 7 , 3 3 . 4 , 4 6 .6 , 5 0 . 1 , 5 1 . 3 , 5 2 . 0 , 5 7 . 3 , 7 1 . 1 , 1 1 0 .2 ( d , JC–F = 8 . 3 H z , 1 C ) , 1 1 1 . 8 ( d , JC–F = 2 4 . 8 H z , 1 C ) , 1 1 5 .4 ( d , JC–F = 2 3 . 1 H z , 1 C ) , 1 2 5 .0 , 1 2 7 . 7 ( 2 C ) , 1 2 8 . 3 , 1 2 9 .2 ( 2 C ) , 1 2 3 .0 ( d , JC–F = 7 . 7 H z , 1 C ) , 1 3 7 . 3 , 1 3 7 .7 , 1 3 7 .9 , 1 3 9 . 3 ( d , JC–F = 1 . 7 H z , 1 C ) , 1 5 8 .0 ( d , JC–F = 2 3 6 .6 H z , 1 C ) , 1 6 1 .5 4 , 1 6 9 .6 , 1 7 6 . 0 . M S m/z 5 0 5 ( M + H)⁺. A n a l . C a l c d f o r C2 8H2 9F N4O4·0 . 2 H2O : C , 6 6 . 1 8 ; H , 5 . 8 3 ; N , 1 1 . 0 3 . F o u n d : C , 6 6 . 2 8 ; H , 5 . 8 5 ; N, 1 0 . 9 8 .

( ± ) - ( 3S, 3 'R, 5 'S) - 5 - F l u o ro - 5 ' - i s o b u t y l - 3 ' - m e t h y l - 1 ' - ( ( 1 - m e t h y l - 1H i m i d a z o l 4

-y l) c a r b o n -y l ) s p i r o [ i n d o l e - 3 , 2 ' - p-y r r o l i d i n ] - 2 ( 1H) - o n e ( 8 7 ) . T o a s o l u t io n o f 8 4 ( 1 .5 0 g , 3 . 5 0 m m o l ) an d C a C l2 ( 0 . 7 7 7 g , 7 . 0 0 m m o l) i n E t O H ( 5 0 m L ) w a s a d d e d N a B H4 ( 5 3 0 m g , 1 4 . 0 m m o l ) a t 1 0 ° C . T h e m i x t u r e w a s s t i r r e d a t 1 0 ° C t o r o o m t e m p e r a t u r e o v er n i g h t . T h e m i x t u r e w a s p o u r e d in t o s a t u r a t e d aq u eo u s N H4C l a t r o o m t e m p e r a tu r e a n d e x t r a c t ed w i t h E t O A c . T h e o r g a n i c l a y er w a s s e p ar a t e d , w a s h e d w i t h w a t e r a n d b r i n e, d r i e d o v er N a2S O4, a n d co n c en t r a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i ed b y s i l i c a g e l c o l u m n c h r o m a to g r ap h y ( E t O A c / M e O H = 1 /0 t o 1 /1 ) to g i v e ( ± ) -( 3S ,3 'R, 5 'S) - 5 - f l u o r o - 3 ( h y d r o x y m e t h y l ) - 5 '-i s o b u t y l - 1 '- ( ( 1 - m e th y l - 1H- i m i d a z o l - 4 - y l ) c a r b o n y l ) s p i r o [ i n d o l e - 3 , 2 ' - p y r r o l id i n ] - 2 ( 1H) - o n e ( 1 . 4 0 g , q u a n t .) a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 0 . 8 4 ( d , J = 6 . 6 H z , 3 H) , 0 . 8 8 ( d , J = 6 . 5 H z , 3 H ) , 1 . 2 3–1 . 3 6 ( m , 1 H) , 1 . 4 4–1 .5 7 ( m , 1 H ) , 1 . 5 8–1 . 8 3 ( m , 2 H ) , 2 . 5 2–2 .6 2 ( m , 2 H ) , 2 .8 4–3 .1 0 ( m , 2 H ) , 3 .6 6 ( s , 3 H ) , 4 . 4 6 ( t, J = 4 .6 H z , 1 H ) , 5 . 0 1–5 .1 5 ( m , 1 H) , 6 . 7 1–6 .8 0 ( m , 1 H ) , 6 . 9 5–7 . 0 6 ( m , 2 H ) , 7 .4 4 ( s , 1 H ) , 7 .6 5 ( s , 1 H ) , 1 0 .3 1 ( s , 1 H ) . M S m/z 4 0 1 ( M + H )⁺.

162

T o a s o l u t i o n o f ( ± ) -( 3S ,3 'R, 5 'S) 5 f lu o r o 3 ' ( h y d r o x y m e th y l ) 5 ' i s o b u t y l 1 ' ( ( 1 m e t h y l -1H- i m i d a z o l - 4 - y l ) c a r b o n y l ) s p i r o [ i n d o l e - 3 , 2 ' - p y r r o l id i n ] - 2 ( 1H) - o n e ( 1 .0 0 g , 2 .5 0 m m o l ) i n T H F ( 8 m L ) an d D M A ( 1 6 m L ) w e r e a d d e d E t3N ( 2 .1 0 m L , 1 5 . 1 m m o l ) a n d m e th a n e s u l f o n y l c h lo r i d e ( 0 . 5 4 0 m L , 6 . 9 8 m m o l) a t 0 ° C . T h e m ix t u r e w a s s t i r r e d a t 0 ° C f o r 1 h . T h e m i x t u r e w a s p o u r ed i n to w a t e r a t r o o m t e m p er a t u r e a n d e x tr a c t e d w i t h E t O A c . T h e o r g a n i c l a y er w a s s e p a r a t e d , w a s h e d w i t h w a t e r an d b r in e , d r i e d o v e r N a2S O4, an d c o n c e n tr a t e d . T h e r e s i d u e w a s s o l i d i f i e d f r o m E t O A c t o g i v e ( ± ) -( ( 3S,3 'R, 5 'S) 5 f lu o r o -5 '- i s o b u ty l - 1 '- ( ( 1 - m e t h y l - 1H i m id a z o l 4 y l) c a r b o n y l ) 2 o x o 1 , 2 d i h y d r o s p i r o [ i n d o l e 3 , 2 ' -p y r r o l i d i n ] - 3 '- y l ) m e th y l m e t h a n e s u l f o n a t e ( 9 9 0 m g , 8 3 % ) a s a wh i t e so l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 0 .8 4 ( d , J = 6 . 3 H z , 3 H ) , 0 . 8 8 ( d , J = 6 . 3 H z , 3 H ) , 1 .2 4–1 . 3 9 ( m , 1 H ) , 1 . 4 4–1 .7 0 ( m , 2 H ) , 1 .7 5–1 .9 6 ( m , 1 H ) , 2 .5 3–2 . 6 5 ( m , 1 H ) , 2 . 7 1–2 .8 5 ( m , 1 H ) , 2 . 8 7 ( s , 3 H) , 3 .5 8–3 . 7 0 ( m , 4 H) , 3 . 9 8–4 .0 9 ( m , 1 H ) , 5 . 0 8–5 . 2 2 ( m , 1 H ) , 6 . 8 0 ( d d , J = 8 .3 , 4 .4 H z , 1 H) , 7 . 0 0–7 .1 5 ( m , 2 H ) , 7 . 4 6 ( s , 1 H ) , 7 . 6 6 ( s , 1 H) , 1 0 . 4 5 ( s , 1 H ) . M S m/z 4 7 9 ( M + H )⁺. ( ± ) -( ( 3S, 3 'R, 5 'S) - 5 - f l u o r o - 5 '- i s o b u ty l - 1 '- ( ( 1 - m e t h y l - 1H im i d a z o l 4 y l ) c ar b o n y l ) 2 o x o -1 , 2 - d i h y d r o s p ir o [ in d o l e - 3 , 2 ' - p y r r o l id i n ] - 3 '- y l ) m e th y l m e th a n e s u l f o n a t e ( 9 8 5 m g , 2 0 .6 m m o l ) w a s d i s s o l v e d i n D M A ( 2 4 m L ) . T o t h e s o l u t io n w a s a d d e d l i t h iu m i o d i d e ( 3 . 3 4 g , 2 5 . 0 m m o l ) a t r o o m t e m p e r a t u r e , a n d t h e m i x tu r e w a s s t i r r e d a t 1 0 0 ° C f o r 9 h . T h e m ix t u r e w a s p o u r ed i n to w a t e r a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d e x t r a c t e d w i t h E t O A c . T h e o r g an i c l a y er w a s s e p a r a t ed , w a s h ed w i t h w a t e r a n d b r i n e , d r i e d o v e r N a2S O4, a n d c o n c e n tr a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r if i e d b y s i l i c a g e l c o l u m n ch r o m a t o g r a p h y ( E t O A c / M e O H = 1 0 / 0 t o 7 /3 ) t o g i v e ( ± ) -( 3S,3 'R, 5 'S) - 5 - f l u o r o - 3 ' - ( i o d o m e t h y l ) - 5 '-i s o b u t y l - 1 '- ( ( 1 - m e th y l - 1H- i m i d a z o l - 4 - y l ) c a r b o n y l ) s p i r o [ i n d o l e - 3 , 2 ' - p y r r o l id i n ] - 2 ( 1H) - o n e ( 9 8 0 m g , 9 3 % ) a s a p a l e y e l l o w s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 0 .8 5 ( d , J = 6 .3 H z , 3 H ) , 0 .8 9 ( d , J = 6 .3 H z , 3 H ) , 1 . 2 6–1 . 3 8 ( m , 1 H ) , 1 .4 5–1 .5 8 ( m , 1 H) , 1 . 6 5 ( b r s , 1 H ) , 1 . 8 6 ( d , J = 9 . 1 H z , 1 H ) , 2 . 5 6–2 . 7 5 ( m , 4 H ) , 3 .6 6 ( s , 3 H) , 5 .0 1–5 . 1 9 ( m , 1 H ) , 6 . 8 2 ( d d , J

= 8 . 0 , 4 . 3 H z , 1 H ) , 7 .0 3–7 .1 3 ( m , 2 H ) , 7 . 4 6 ( s , 1 H ) , 7 . 6 6 ( s , 1 H ) , 1 0 . 5 1 ( s , 1 H ) . M S m/z 5 1 1 ( M + H )⁺.

A m i x tu r e o f ( ± ) -( 3S,3 'R, 5 'S) - 5 - f lu o r o - 3 '- ( i o d o m e t h y l ) - 5 '- i s o b u t y l - 1 ' - ( ( 1 - m e t h y l - 1 H-i m H-i d az o l - 4 - y l ) c ar b o n y l ) s p H-ir o [ H-i n d o l e - 3 , 2 ' - p y r r o l H-id H-i n ] - 2 ( 1H) - o n e ( 9 7 5 m g , 1 .9 1 m m o l) , p a l l ad i u m o n c ar b o n e t h y l e n ed i a m i n e c o m p l e x ( P d 3 . 5–6 . 5 % , 4 0 7 m g ) , an d s a t u r a t ed

163

a q u e o u s N a H C O3 ( 4 m L ) i n M e O H ( 2 0 m L ) a n d T H F ( 4 m L ) w a s h y d r o g en a t e d u n d e r b a l lo o n p r e s s u r e a t r o o m t e m p er a t u r e f o r 6 h . T h e c a t a ly s t w a s r e m o v e d b y f i l t r a t i o n , an d t h e f i l t r a t e w a s c o n c e n t r a t ed . T h e r e s i d u e w a s s u s p e n d e d in w a t e r , a n d t h e m i x t u r e w a s e x tr a c t e d w i t h E t O A c . T h e o r g an i c l ay e r w a s s e p ar a t e d , w a s h e d w i t h w a t e r a n d b r i n e, d r i e d o v e r N a2S O4, a n d co n c en t r a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i e d b y s i l i c a g e l c o l u m n c h r o m a to g r ap h y ( E t O A c / M e O H = 1 0 / 0 t o 7 / 3 ) t o g i v e 8 7 ( 5 0 6 m g , 6 9 % ) a s a w h i t e s o l i d . m .p . 2 9 8–3 0 0 ° C . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 0 . 5 3 ( d , J = 6 .4 H z , 3 H ) , 0 . 8 4 ( d , J = 6 . 4 H z , 3 H) , 0 .8 8 ( d , J = 6 . 3 H z , 3 H) , 1 .2 3–1 .3 4 ( m , 1 H ) , 1 . 4 5–1 . 5 8 ( m , 1 H ) , 1 . 5 8–1 . 7 8 ( m , 2 H) , 2 . 3 3–2 . 5 8 ( m , 2 H ) , 3 . 6 6 ( s , 3 H ) , 4 .9 9–5 .1 3 ( m , 1 H ) , 6 .8 0 ( d d , J = 8 . 1 , 4 .4 H z , 1 H) , 6 .9 5–7 . 0 9 ( m , 2 H ) , 7 . 4 4 ( s , 1 H ) , 7 .6 5 ( s , 1 H ) , 1 0 .3 9 ( s , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 7 5 M H z , C D C l3) δ 1 2 . 9 , 2 1 .3 , 2 4 .4 , 2 5 . 9 , 3 3 . 6 , 4 0 . 5 , 4 1 .8 , 4 7 . 4 , 5 8 . 5 , 7 3 . 9 , 1 1 0 . 4 ( d , JC–F = 8 .3 H z , 1 C ) , 1 1 2 .0 ( d , JC–F = 2 4 . 8 H z , 1 C ) , 1 1 4 . 8 ( d , JC–F = 2 3 . 7 H z , 1 C ) , 1 2 6 . 3 , 1 3 0 . 4 ( d , JC–F

7 . 2 H z , 1 C ) , 1 3 6 .8 , 1 3 6 . 9 ( d , JC–F = 2 . 2 H z , 1 C ) , 1 3 7 . 9 , 1 5 8 .8 ( d , JC–F = 2 3 9 . 9 H z , 1 C ) , 1 6 2 .1 , 1 7 7 . 2 . M S m/z 3 8 5 ( M + H)⁺. A n a l . C a l c d f o r C2 1H2 5F N4O2·0 . 9 H2O : C , 6 2 . 9 5 ; H , 6 . 7 4 ; N, 1 3 . 9 8 . F o u n d : C , 6 3 . 1 6 ; H , 6 . 4 9 ; N , 1 3 . 7 2 .

( ± ) - ( 3S, 3 'R, 5 'S) - 1 ' - ( ( 1 - B e n z y l - 1H- im i d a z o l - 4 - y l ) c a r b o ny l ) - 5 - f l u o r o - 5 ' - i s o b u t y l - 3 '-m e t h y l s p i r o [ i n d o l e - 3 ,2 ' - p y r ro l i d i n ] - 2 ( 1H) - o n e ( 8 8 ) . C o m p o u n d 8 8 w a s p r ep a r e d f r o m c o m p o u n d 8 6 i n a s i m i l a r m a n n e r to t h a t d e s c r ib e d f o r t h e s y n t h e s i s o f c o m p o u n d 8 7 a n d o b t a i n e d i n 6 0 % y i e l d f o r 4 s t e p s a s a w h i t e s o l id . m . p . 2 8 2–2 8 4 ° C . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 0 . 5 3 ( d , J = 6 . 3 H z , 3 H ) , 0 .8 1 ( d , J = 6 .3 H z , 6 H ) , 1 . 1 8–1 . 4 7 ( m , 2 H ) , 1 .5 2– 1 . 8 1 ( m , 2 H ) , 2 .3 2–2 . 4 9 ( m , 2 H ) , 4 .9 0–5 . 0 7 ( m , 1 H) , 5 . 2 3 ( s , 2 H ) , 6 .7 9 ( d d , J = 8 .0 , 4 . 4 H z , 1 H ) , 6 . 9 6–7 .0 8 ( m , 2 H ) , 7 . 2 2 ( d , J = 7 .4 H z , 2 H ) , 7 . 2 6–7 .3 9 ( m , 3 H ) , 7 . 5 1 ( s , 1 H) , 7 . 8 5 ( s , 1 H ) , 1 0 . 4 0 ( s , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 7 5 M H z , C D C l3) δ 1 3 . 0 , 2 1 .3 , 2 4 . 4 , 2 5 . 9 , 4 0 .5 , 4 1 . 7 , 4 7 . 4 , 5 1 . 1 , 5 8 . 2 , 7 3 . 9 , 1 1 0 .4 ( d , JC–F = 7 . 7 H z , 1 C ) , 1 1 2 . 0 ( d , JC–F = 2 4 . 8 H z , 1 C ) , 1 1 4 .7 ( d , JC–F = 2 3 . 7 H z , 1 C ) , 1 2 5 .5 , 1 2 7 . 5 ( 2 C ) , 1 2 8 . 5 , 1 2 9 .1 ( 2 C ) , 1 3 0 .4 ( d , JC–F = 7 . 2 H z , 1 C ) , 1 3 5 .3 , 1 3 6 .3 , 1 3 7 .0 , 1 3 7 .8 , 1 5 8 . 8 ( d , JC–F = 2 3 9 . 3 H z , 1 C ) , 1 6 2 . 0 , 1 7 7 . 2 . M S m/z 4 6 1 ( M + H )⁺. A n a l. C a l c d f o r C2 7H2 9F N4O2·0 .1 H2O : C , 7 0 . 1 4 ; H , 6 . 3 7 ; N , 1 2 . 1 2 . F o u n d : C , 7 0 . 1 9 ; H , 6 . 4 8 ; N , 1 2 . 0 7 .

( 3S, 3 'R, 5 'S) - 5 - F l u o r o - 5 '- i s o b u t y l - 3 ' - m e t h y l - 1 '- ( ( 1 - m e t h y l - 1H im i d a zo l 4

-y l) c a r b o n -y l ) s p i r o [ i n d o l e - 3 , 2 ' - p-y r r o l i d i n ] - 2 ( 1H) - o n e ( 8 9 a ) a n d ( 3R, 3 'S, 5 'R) 5 f l u o ro

-164

5 '- i s o b u t y l - 3 ' - m e t h y l - 1 '- ( ( 1 - m e t h y l - 1H im i d a zo l 4 y l ) ca r b o n y l ) s p i r o [ i n d o l e 3 ,2 '

-p y r ro l i d i n ] - 2 ( 1H) - o n e ( 8 9 b ) . R a c e m a t e 8 7 ( 4 3 0 m g ) w a s s e p a r a t e d b y S F C ( J A S C O s y s t e m , C H I R A L C E L O D - H ( D a i c e l ) 2 0 m m I . D . × 2 5 0 m m , 5 μ m , C O2/ M e O H = 7 / 3 ( v /v ) , f lo w r a t e o f 5 0 m L /m i n ) t o g iv e 8 9 a ( 1 9 3 m g , 4 5 % , 9 9 .1 % e e , r e t e n t i o n t i m e 2 . 0 m i n ) a s a w h i t e s o l i d a n d 8 9 b ( 1 8 9 m g , 4 4 % , > 9 9 . 9 % e e , r e t e n t i o n t i m e 4 .2 m i n ) a s a w h i t e s o l i d . A b s o lu t e s t e r e o c h em i s t r y w a s d e t e r m in e d b y X - r a y c r y s t a l s t r u c t u r e a n a l y s i s (8 9 a, C C D C 1 5 3 9 9 6 4 ) . 8 9 a : m . p . 1 5 7–1 5 9 ° C . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 0 .5 3 ( d , J = 6 . 5 H z , 3 H) , 0 . 8 4 ( d , J = 6 . 3 H z , 3 H ) , 0 .8 8 ( d , J = 6 . 4 H z , 3 H ) , 1 .2 1–1 . 3 5 ( m , 1 H ) , 1 . 4 6–1 . 5 7 ( m , 1 H) , 1 . 5 9–1 . 7 8 ( m , 2 H ) , 2 . 3 4–2 .5 7 ( m , 2 H ) , 3 .6 6 ( s , 3 H) , 4 . 9 9–5 . 1 3 ( m , 1 H ) , 6 . 8 0 ( d d , J

= 8 . 3 , 4 . 3 H z , 1 H ) , 6 . 9 7–7 .0 8 ( m , 2 H ) , 7 . 4 5 ( s , 1 H ) , 7 .6 6 ( s , 1 H ) , 1 0 . 4 0 ( s , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 7 5 M H z , C D C l3) δ 1 2 . 9 , 2 1 .3 , 2 4 . 4 , 2 5 . 9 , 3 3 . 6 , 4 0 .4 , 4 1 . 8 , 4 7 . 3 , 5 8 . 2 , 7 4 .0 , 1 1 0 . 5 ( d , JC– F = 8 .3 H z , 1 C ) , 1 1 2 . 0 ( d , JC–F = 2 4 . 8 H z , 1 C ) , 1 1 4 .7 ( d , JC–F = 2 3 .7 H z , 1 C ) , 1 2 6 . 2 , 1 3 0 . 4 ( d , JC–F 7 . 2 H z , 1 C ) , 1 3 6 . 8 , 1 3 7 .0 ( d , JC–F = 2 . 2 H z , 1 C ) , 1 3 7 .8 , 1 5 8 . 7 ( d , JC–F = 2 3 8 . 8 H z , 1 C ) , 1 6 2 .1 , 1 7 7 .4 . M S m/z 3 8 5 ( M + H )⁺. []D2 5 = − 0 .5 ° ( c = 0 . 5 , M e O H ) . A n a l . C a l c d f o r C2 1H2 5F N4O2·0 . 6 H2O : C , 6 3 . 8 1 ; H , 6 . 6 8 ; N , 1 4 . 1 7 . F o u n d : C , 6 3 . 8 5 ; H , 6 . 8 3 ; N , 1 3 .8 7 . 8 9 b : m . p . 1 5 7–1 5 9 ° C . M S m/z 3 8 5 ( M + H )⁺. []D2 5 = + 1 . 0 ° ( c = 0 .5 , M e O H ) . A n a l . C a l c d f o r C2 1H2 5F N4O2·0 .7 H2O : C , 6 3 . 5 2 ; H , 6 . 6 8 ; N , 1 4 . 1 7 . Fo u n d : C , 6 3 . 6 5 ; H , 6 .8 4 ; N , 1 3 . 9 8 .

A n a ly t i c a l S F C c o n d i t i o n f o r d e t e r m i n a t i o n o f % e e v a l u e s o f 8 9 a an d 8 9 b, W a t e r s s y s t e m , C H I R A L C E L O D - H ( D a i c e l ) 4 . 6 m m I . D . × 1 5 0 m m , 5 μ m , C O2/ M e O H = 7 / 3 ( v /v ) , f l o w r a t e o f 2 . 5 m L / m i n .

( 3S, 3 'R, 5 'S) - 1 ' - ( ( 1 - B e n z y l - 1H im i d a z o l 4 y l ) ca r b o n y l ) 5 f l u o r o 5 ' i s o b u t y l 3 '

-m e t h y l s p i r o [ i n d o l e - 3 ,2 ' - p y r ro l i d i n ] - 2 ( 1H) - o n e ( 9 0 a ) a n d ( 3R, 3 'S,5 'R) 1 ' ( ( 1 b e n z y l -1H- i m i d a zo l - 4 - y l ) ca r b o n y l) - 5 - f l u o r o - 5 ' - i s o b u t y l - 3 ' - m e t h y l s p i r o [ i n d o l e - 3 , 2

'-p y r ro l i d i n ] - 2 ( 1H) - o n e ( 9 0 b ) . R a c e m a t e 8 8 ( 2 4 0 m g ) w a s s e p ar a t e d b y H P L C ( Y M C K -p r e -p s y s t e m , C H I R A L P A K A D ( D a i c e l ) 5 0 m m I . D . × 5 0 0 m m , 2 0 μ m , E t O H , f l o w r a t e o f 6 0 m L / m i n .) to g i v e 9 0 a ( 1 0 5 m g , 4 4 % , 9 9 . 9 % e e , r e t en t i o n t i m e 1 5 . 3 m i n ) a s a w h i t e s o l i d an d 9 0 b ( 1 0 0 m g , 4 2 % , >9 9 .9 % e e , r e t e n t io n t i m e 1 0 .2 m i n ) a s a wh i t e s o l i d . A b s o lu t e s t e r e o c h em i s t r y w a s d e t e r m in e d b y X - r a y c r y s t a l s t r u c t u r e a n a l y s i s (9 0 a, C C D C 1 5 3 9 9 6 5 ) . 9 0 a : m . p . 1 2 7–1 2 9 ° C . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z, D M S O -d6) δ 0 . 5 3 ( d , J = 6 . 3 H z ,

165

3 H) , 0 . 8 1 ( d , J = 6 . 3 H z , 6 H ) , 1 . 2 2–1 . 4 5 ( m , 2 H) , 1 . 5 5–1 .7 7 ( m , 2 H ) , 2 . 2 9–2 . 4 9 ( m , 2 H ) , 4 . 9 3–5 .0 5 ( m , 1 H ) , 5 . 2 3 ( s , 2 H ) , 6 .7 9 ( d d , J = 7 .9 , 4 . 3 H z , 1 H ) , 6 . 9 7–7 .0 8 ( m , 2 H ) , 7 . 2 2 ( d , J = 7 .2 H z , 2 H ) , 7 .2 6–7 . 4 0 ( m , 3 H ) , 7 .5 1 ( s , 1 H ) , 7 . 8 6 ( s , 1 H ) , 1 0 . 4 1 ( s , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 7 5 M H z, C D C l3) δ 1 2 .9 , 2 1 . 3 , 2 4 . 4 , 2 5 . 9 , 4 0 .5 , 4 1 .8 , 4 7 .4 , 5 1 . 1 , 5 8 .2 , 7 3 .9 , 1 1 0 . 4 ( d , JC–F = 7 . 7 H z , 1 C ) , 1 1 1 .9 ( d , JC–F = 2 4 . 8 H z , 1 C ) , 1 1 4 . 8 ( d , JC–F = 2 3 . 7 H z, 1 C ) , 1 2 5 .4 , 1 2 7 .5 ( 2 C ) , 1 2 8 . 6 , 1 2 9 .1 ( 2 C ) , 1 3 0 . 4 ( d , JC–F = 7 . 2 H z , 1 C ) , 1 3 5 . 3 , 1 3 6 .3 , 1 3 6 .9 , 1 3 7 .8 , 1 5 8 .8 ( d , JC–F = 2 3 9 .3 H z , 1 C ) , 1 6 2 . 0 , 1 7 7 .3 . M S m/z 4 6 1 ( M + H )⁺. []D2 5 = −1 6 .9 ° ( c = 0 . 5 , M e O H ) . C2 7H2 9F N4O2·0 .5 H2O : C , 6 9 . 0 6 ; H , 6 .4 4 ; N , 1 1 . 9 3 . F o u n d : C , 6 9 .3 6 ; H , 6 .5 4 ; N , 1 1 .8 5 . 9 0 b : m .p . 1 2 7–1 2 9 ° C . M S m/z 4 6 1 ( M + H)⁺. []D2 5 = + 1 9 .2 ° ( c = 0 . 5 , M e O H ) . A n a l . C a l c d f o r C2 7H2 9F N4O2·0 . 4 H2O : C , 6 9 .3 3 ; H , 6 . 4 2 ; N , 1 2 . 0 2 . F o u n d : C , 6 9 .4 5 ; H , 6 . 4 9 ; N, 1 1 . 8 8 .

A n a ly t i c a l H P L C c o n d i t i o n f o r d e t er m i n a t i o n o f % e e v a lu e s o f 9 0 a a n d 9 0 b, W a t e r s s y s t e m , C H I R A L C E L A D - H ( D a i c e l ) 4 . 6 m m I . D . × 2 5 0 m m , 5 μ m , E t O H / d i e t h y l a m i n e = 1 0 0 0 / 1 ( v / v ) , f l o w r a t e o f 0 . 5 m L /m i n .

4 - A z i d o - 1 - m et h y l - 6 - o x o - 1 ,6 - d i h y d r o p y r i d i n e - 3 - c a r bo x y l i c a c i d ( 9 2 a ) . A m i x tu r e o f 9 1 a ( W a l l a c e e t a l. , 2 0 0 6 ) ( 3 . 2 5 g , 1 5 .1 m m o l) a n d s o d i u m a z id e ( 1 . 9 6 g , 3 0 .1 m m o l) i n D M F ( 3 2 m L ) w a s h e a t e d t o 5 5 ° C a n d s t i r r e d f o r 5 d . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s d i l u t e d w i t h s a t u r a t ed aq u eo u s N a H C O3 a n d s a t u r a t e d a q u e o u s N a2C O3, an d t h e m i x tu r e w a s e x t r a c t e d w i t h E t O A c . T h e o r g a n i c l a y er w a s s e p ar a t e d , w a s h e d w i t h w a t e r a n d b r i n e, d r i e d o v er a n h y d r o u s N a2S O4, a n d c o n c en t r a t e d to a f f o r d e t h y l 4 a z i d o 1 m e t h y l 6 o x o 1 , 6 -d ih y -d r o p y r i -d in e - 3 - c a r b o x y l a t e ( 6 .6 0 g ) a s a c r u -d e p r o -d u c t . T h e cr u -d e ( 6 .6 0 g ) an -d l i t h iu m h y d r o x i d e m o n o h y d r a t e ( 2 .1 8 g , 5 2 . 0 m m o l ) in E t O H ( 3 0 m L ) a n d w a t er ( 3 0 m L ) w a s s t i r r e d a t r o o m t e m p e r a tu r e f o r 4 h . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s a c i d if i e d w i t h co n c . h y d r o c h lo r i c a c i d t o p H 2 . T h e r e s u l t a n t p r e c i p i t a t e s o l i d w a s c o l l e c t e d b y f i l t r a t i o n t o a f f o r d 9 2 a ( 2 .0 8 g , 7 1 % f o r 2 s t e p s ) a s a y e l l o w s o l i d . ¹H N M R ( 4 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 3 . 4 6 ( s , 3 H ) , 6 . 1 6 ( s , 1 H ) , 8 .4 5 ( s , 1 H ) . 1 H w a s n o t o b s e r v e d . M S m/z 1 9 5 ( M + H )⁺. 4 - A z i d o - 1 - b e n z y l - 6 - o x o - 1 ,6 - d i h y d r o p y r i d i n e - 3 - c a r bo x y l i c a c i d ( 9 2 b ) . T o a s o lu t i o n o f 9 1 b ( K a i e t a l. , 2 0 1 2 ) ( 1 0 .5 g , 3 6 . 0 m m o l ) i n D M F ( 1 0 0 m L ) w a s a d d e d s o d i u m a z i d e ( 4 . 7 5 g , 7 3 .1 m m o l ) a t r o o m t e m p er a t u r e. T h e m ix t u r e w a s s t i r r e d a t 6 0 ° C f o r 2 d , c o o l e d t o r o o m t e m p e r a t u r e , d i l u t ed w i t h w a t e r , a n d e x tr a c t e d w i t h E t O A c . T h e o r g an i c l a y e r w a s

166

s e p a r a t ed , w a s h ed w i t h w a t e r an d b r i n e, d r i e d o v e r N a2S O4, an d c o n c e n tr a t e d to g i v e e t h y l 4 - a z i d o - 1 - b e n z y l - 6 - o x o - 1 , 6 - d i h y d r o p y r i d in e - 3 - c a r b o x y l a t e ( 1 0 . 7 g ) a s a c r u d e p r o d u c t . T o a s o l u t i o n o f t h e cr u d e ( 1 0 . 7 g ) i n T H F ( 5 0 m L ) a n d E t O H ( 5 0 m L ) w a s a d d ed 1 M N a O H ( 4 3 m L , 4 3 .0 m m o l ) a t r o o m t em p er a t u r e. T h e m ix t u r e w a s s t i r r e d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 1 h , a n d T H F w a s r e m o v ed b y e v ap o r a t io n . T h e r e s i d u a l s o lu t i o n w a s c o o l e d t o 0 ° C a n d a c i d if i e d w i t h 1 M H C l t o p H 2 . T h e r e s u l t an t p r e c ip i t a t e d s o l i d w a s c o l l e c t ed b y f i l t r a t io n , w a s h e d w i t h w a t e r , an d d r i ed t o g i v e 9 2 b ( 9 .2 0 g , 9 5 % f o r 2 s t e p s ) a s a y e l l o w s o l id . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 5 .1 8 ( s, 2 H ) , 6 .2 4 ( s , 1 H ) , 7 . 2 5–7 .4 1 ( m , 5 H) , 8 . 5 8 ( s , 1 H ) , 1 2 . 9 2 ( b r s , 1 H) . M S m/z 2 4 3 ( M − N2+ H )⁺.

4 - A m i n o - 1 - m e t h y l - 6 - o x o - 1 , 6 - d i h y d r o p y r i d i n e - 3 - c a r b a l d e h y d e ( 9 3 a ) . T o a m i x t u r e o f 9 2 a ( 7 0 0 m g , 3 . 6 1 m m o l ) , N,O- d i m e th y l h y d r o x y l a m i n e h y d r o ch l o r id e ( 7 0 0 m g , 7 .2 1 m m o l ) a n d D I P E A ( 3 . 7 7 m L , 2 1 .6 m m o l) i n D M F ( 5 m L ) w a s a d d e d T3P ( 5 0 % i n e t h y l a c e t a t e , 4 . 2 8 m L , 7 . 2 1 m m o l ) d r o p w i s e a t 0 ° C . T h e r e a c t i o n m i x tu r e w a s w a r m e d to r o o m t e m p e r a t u r e a n d s t i r r e d f o r 1 6 h . T h e r e a c t i o n m i x tu r e w a s d i l u t e d w i t h w a t er a n d th e m ix t u r e w a s e x t r a c t ed w i t h C H2C l2/ M e O H ( 1 0 / 1 ) . T h e o r g an i c l a y e r w a s s e p a r a t e d , w a s h e d w i t h b r in e , d r i e d w i t h a n h y d r o u s N a2S O4, f i l t e r ed a n d c o n c e n tr a t e d t o a f f o r d 4 -a z i d o -N- m e t h o x y -N, 1 - d i m e t h y l - 6 - o x o - 1 , 6 - d i h y d r o p y r i d in e - 3 - c a r b o x a m id e ( 8 0 0 m g ) a s a c r u d e p r o d u c t . T o a s o l u t i o n o f th e c r u d e ( 8 0 0 m g ) i n T H F ( 2 0 m L ) w a s a d d ed L i A l H4

( 3 8 4 m g , 1 0 . 1 m m o l ) p o r t i o n w i s e a t 0 ° C u n d e r N2. T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s w a r m e d t o r o o m t em p e r a tu r e an d s t i r r e d f o r 2 h . T h e r e a c t i o n m i x tu r e w a s p o u r ed i n t o s a t u r a t e d a q u e o u s N H4C l a t 0 ° C an d t h e m ix t u r e w a s ex t r a c t e d w i t h C H2C l2/ M e O H ( 1 0 / 1 ) . T h e o r g an i c l a y er w a s s e p a r a t ed , w a s h ed w i t h b r i n e ( 3 0 m L ) , d r i ed o v e r a n h y d r o u s N a2S O4, a n d c o n c e n tr a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i e d b y p r ep a r a t i v e T L C o n s i l i c a g e l ( C H2C l2/ M e O H = 1 0 / 1 ) t o a f f o r d 9 3 a ( 1 3 0 m g , 2 4 % f o r 2 s t e p s ) a s a y e l l o w s o l id . ¹H N M R ( 4 0 0 M H z, D M S O -d6) δ 3 . 3 8 ( s , 3 H ) , 5 .2 9 ( s , 1 H ) , 7 . 0 5 ( b r s , 2 H ) , 8 .3 5 ( s , 1 H) , 9 . 4 4 ( s , 1 H ) . M S m/z 1 5 3 ( M + H)⁺.

4 - A m i n o - 1 - b e n z y l - 6 - o x o - 1 , 6 - d i h y d r o p y r i d i n e - 3 - c a r b a l d e h y d e ( 9 3 b ) . T o a s o l u t i o n o f 9 2 b ( 9 .1 9 g , 3 4 . 0 m m o l ) , N,O- d i m e t h y l h y d r o x y l am i n e h y d r o c h l o r i d e ( 4 . 9 8 g , 5 1 .0 m m o l ) , H O B t H2O ( 7 .8 1 g , 5 1 . 0 m m o l ) , an d E D C H C l ( 9 .7 8 g , 5 1 .0 m m o l ) i n D M F ( 1 2 0 m L ) w a s a d d e d D I P E A ( 2 6 .7 m L , 1 5 3 m m o l ) a t r o o m t e m p e r a t u r e . T h e m ix t u r e w a s s t i r r e d a t r o o m

167

t e m p e r a t u r e f o r 3 d a y s . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s c o n c e n t r a t ed t o o n e - f o u r t h v o l u m e , d i lu t e d w i t h w a t e r , a n d e x t r ac t e d w i t h E t O A c . T h e o r g a n i c l a y e r w a s s e p a r a t e d , w a s h e d w i t h 5 % aq u eo u s c i t r i c a c i d , w a t e r , 5 % a q u e o u s N a H C O3, w a t e r , a n d b r i n e , d r i e d o v e r N a2S O4, a n d co n c en t r a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i ed b y s i l i c a g e l c o l u m n c h r o m a to g r ap h y ( h e x an e / E t O A c = 5 0 / 5 0 t o 0 /1 0 0 ) t o g i v e 4 - a z i d o - 1 - b en z y l -N- m e th o x y -N m e t h y l 6 o x o -1 , 6 - d i h y d r o p y r id i n e - 3 - c a r b o x a m i d e ( 9 . 0 0 g , 8 4 % ) a s a y e l l o w s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 3 . 1 9 ( s, 3 H ) , 3 .5 2 ( s , 3 H ) , 5 . 0 9 ( s , 2 H ) , 6 . 2 9 ( s , 1 H ) , 7 . 2 3–7 . 4 1 ( m , 5 H ) , 8 . 1 0 ( s , 1 H ) . M S m/z 3 1 4 ( M + H )⁺.

T o a s u s p e n s i o n o f L i A l H4 ( 8 0 7 m g , 2 1 . 3 m m o l ) in T H F ( 3 0 m L ) w a s ad d e d d r o p w i s e a s o l u t i o n o f 4 - a z i d o - 1 - b en z y l -N- m e th o x y -N m e t h y l 6 o x o 1 , 6 d i h y d r o p y r i d i n e 3 -c a r b o x a m i d e ( 3 . 3 3 g , 1 0 . 6 m m o l) i n T H F ( 3 0 m L ) a t 0 ° C . T h e m i x t u r e w a s s t i r r ed a t 0 ° C f o r 0 . 5 h an d q u e n ch e d w i t h E t O H i n T H F a t 0 ° C . T o t h e m i x t u r e w a s a d d e d E t O A c a n d s a t u r a t ed a q u eo u s p o t a s s i u m s o d i u m ( + ) - t ar t a r a t e a t 0 ° C . T h e m i x tu r e w a s f i l t e r e d t h r o u g h a p a d o f C e l i t e , a n d t h e f i l t r a t e w a s e x tr a c t e d w i t h E t O A c . T h e o r g an i c l a y e r w a s s e p a r a t ed , w a s h e d w i t h w a t e r an d b r i n e , d r i e d o v e r N a2S O4, p a s s e d t h r o u g h a s h o r t c o lu m n ( s i l i c a g e l , E t O A c ) , a n d co n c e n tr a t e d t o g i v e 9 3 b ( 1 . 6 4 g , 6 8 % ) a s a y e l l o w s o l i d .

1H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 5 . 0 6 ( s, 2 H ) , 5 . 3 2 ( s , 1 H ) , 7 . 1 0 ( s , 2 H) , 7 .2 4–7 . 3 8 ( m , 5 H) , 8 . 4 9 ( 1 H , s ) , 9 . 4 7 ( 1 H , s ) . M S m/z 2 2 9 ( M + H)⁺.

6 - B e n z y l - 3 - ( 3 - ( ( 4 - m e t h o x y b e n z y l ) o x y ) p h e n y l ) - 4 , 6 - d i h y d r o p y r i d o [ 4 ,3 -d] p y r i m i d i n e -2 , 7 ( 1H, 3H) - d i o n e ( 9 6 ) . T o a m ix t u r e o f 9 5 b ( 5 1 0 m g , 2 . 2 2 m m o l ) an d 9 3 b ( 4 6 0 m g , 2 .0 1 m m o l ) i n T H F ( 1 0 m L ) w a s a d d ed T i (i- P r O )4 ( 0 . 8 9 m L , 3 . 0 m m o l ) a t r o o m t e m p er a t u r e u n d er N2. T h e r e ac t i o n m i x t u r e w a s h e a t e d t o 5 0 ° C an d s t i r r e d f o r 1 6 h . T o th e r e a c t i o n m ix t u r e w a s a d d e d N a B H ( O A c )3 ( 1 .7 0 g , 8 . 0 2 m m o l ) , an d th e r e a c t io n m i x t u r e w a s s t i r r e d a t 5 0 ° C f o r 1 8 h . T h e r e a c t i o n m i x tu r e w a s c o n ce n t r a t e d , a n d t h e r e s i d u e w a s p u r i f i e d b y s i l i c a g e l c o lu m n c h r o m a to g r ap h y ( C H2C l2/ M e O H = 1 0 0 / 1 t o 2 0 /1 ) t o a f f o r d 4 a m i n o 1 -b en z y l - 5 - ( ( ( 3 - ( ( 4 - m e th o x y -b e n z y l) o x y ) p h e n y l ) a m in o ) m e t h y l ) p y r id i n - 2 ( 1H) - o n e ( 7 0 0 m g , 7 9 % ) a s a y e l l o w s o l i d . ¹H N M R ( 4 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 3 . 7 5 ( s , 3 H ) , 3 . 8 9 ( d , J = 5 . 6 H z, 1 H) , 4 .0 6–4 . 0 8 ( m , 1 H ) , 4 . 8 6–4 .9 2 ( m , 4 H ) , 5 . 3 5–5 . 4 3 ( m , 1 H ) , 5 . 8 8–5 . 9 3 ( m , 2 H ) , 6 . 1 7– 6 . 3 3 ( m , 3 H ) , 6 . 9 0–6 . 9 6 ( m , 3 H ) , 7 . 0 4–7 . 0 8 ( m , 1 H ) , 7 .1 6–7 . 2 8 ( m , 5 H ) , 7 . 3 0–7 .3 4 ( m , 2 H) , 7 . 3 8–7 .4 6 ( m , 1 H ) . M S m/z 4 4 2 ( M + H )⁺.

168

T o a 4 a m in o 1 b e n z y l 5 ( ( ( 3 ( ( 4 m e t h o x y b en z y l ) o x y ) p h e n y l ) a m in o ) m e th y l ) p y r id i n -2 ( 1H) - o n e ( 4 . 6 4 g , 1 0 . 5 m m o l ) a n d C D I ( 8 .5 2 g , 5 2 . 6 m m o l ) i n T H F ( 1 5 0 m L ) w a s ad d ed D B U ( 7 . 9 2 m L , 5 2 .6 m m o l ) a t r o o m t e m p e r a tu r e . T h e m ix t u r e w a s s t i r r ed a t r o o m t e m p e r a t u r e o v e r n i g h t. T h e r e a c t io n m i x t u r e w a s d i l u t e d w i t h E t O A c , a c i d if i e d w i t h 5 % c i t r i c a c i d , a n d ex t r a c t e d w i t h E t O A c . T h e o r g an i c l a y e r w a s s e p a r a t ed , w a s h e d w i t h w a t e r , b r i n e, d r i ed o v e r N a2S O4, a n d c o n c e n t r a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i ed b y s i l i c a g e l c o lu m n ch r o m a t o g r a p h y ( E t O A c / M e O H = 1 0 0 / 0 to 8 8 /1 2 ) to g i v e 9 6 ( 4 .2 0 g , 8 5 % ) a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 3 .7 5 ( s , 3 H ) , 4 .5 9 ( s , 2 H) , 5 .0 0 ( b r s , 2 H ) , 5 . 0 1 ( b r s , 2 H ) , 5 . 7 4 ( s , 1 H) , 6 .8 5–6 .9 8 ( m , 4 H ) , 7 .0 0 ( s , 1 H ) , 7 . 2 4–7 . 4 0 ( m , 8 H ) ,7 . 6 8 ( s , 1 H) , 9 . 9 7 ( s , 1 H ) . M S m/z 4 6 8 ( M + H )⁺.

6 - B e n z y l - 3 - ( 3 - h y d r o x y p h e n y l ) - 4 , 6 - d i h y d r o p y r i d o [ 4 , 3 -d] p y r im i d i n e - 2 , 7 ( 1H, 3H) - d i o n e ( 9 7 ) . T o a m i x tu r e o f 9 6 ( 3 0 0 m g , 0 .6 4 2 m m o l ) a n d a n i s o l e ( 6 9 7 μL , 6 .4 2 m m o l ) w a s a d d e d T F A ( 3 . 0 m L , 3 9 m m o l) a t r o o m t e m p e r a t u r e . T h e m ix t u r e w a s s t i r r e d r o o m t e m p e r a t u r e f o r 1 h , d i lu t e d w i t h E t O A c a n d b a s i f i e d w i t h 5 % a q u eo u s N a H C O3, a n d e x tr a c t e d w i t h E t O A c . T h e o r g an i c l ay e r w a s s e p ar a t e d , w a s h e d w i t h w a t e r a n d b r i n e, d r i e d o v e r N a2S O4, a n d c o n c e n t r a t ed . T h e r e s i d u a l s o l i d w a s s u s p e n d e d i n h e x an e / E t O A c ( 4 / 1 ) , c o l l e c t e d b y f i l t r a t i o n , w a s h e d w i t h h e x a n e / E t O A c ( 4 / 1 ) , a n d d r i ed t o g iv e 9 7 ( 2 2 3 m g , q u a n t. ) a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 4 . 5 5 ( s , 2 H ) , 5 . 0 0 ( s , 2 H ) , 5 . 7 3 ( s , 1 H ) , 6 . 6 3 ( d , J = 8 .0 H z , 1 H ) , 6 .7 0–6 . 7 7 ( m , 2 H ) , 7 . 1 5 ( t , J = 8 . 3 H z , 1 H ) , 7 . 2 2– 7 . 4 0 ( m , 5 H ) , 7 .6 8 ( s , 1 H ) , 9 .5 1 ( s , 1 H ) , 9 .9 3 ( s , 1 H) . M S m/z 3 4 8 ( M + H )⁺.

( ± ) - M e t h y l ( 3S, 3 'R, 5 'S) 5 ' i s o b u t y l 2 o x o 1 , 2 d i h y d r o s p i r o [ i n d o l e 3 , 2 ' p y r r o l i d i n e ] -3 '- c a r b o x y l a t e ( 1 0 0 a ) . A m i x tu r e o f 1H- i n d o l e - 2 , 3 - d i o n e 9 9 a ( 8 . 7 0 g , 5 9 . 1 m m o l ) , D L -l e u c in e ( 7 . 7 6 g , 5 9 .1 m m o -l ) , an d m e th y -l a c r y -l a t e ( 5 . 3 2 m L , 5 9 .1 m m o -l) i n T H F ( 1 6 0 m L ) a n d w a t e r ( 4 0 m L ) w a s r e f l u x ed f o r 2 h . T h e m ix t u r e w a s c o n c en t r a t e d an d s u s p e n d e d i n w a t e r , a n d th e m ix t u r e w a s e x t r a c t ed w i t h E t O A c . T h e o r g a n i c l a y e r w a s s e p ar a t e d , w a s h e d w i t h w a t e r a n d b r i n e , d r i e d o v e r N a2S O4 a n d c o n c e n t r a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i ed b y N H - s i l i c a g e l c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y ( h ex a n e / E t O A c = 9 5 /5 to 2 0 / 8 0 ) to g i v e 1 0 0 a ( 1 2 .4 g , 6 9 % ) a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l3) δ 0 . 9 5 ( t , J = 6 . 6 H z , 6 H) , 1 .3 6–1 . 5 6 ( m , 2 H ) , 1 . 6 5–1 . 7 9 ( m , 1 H ) , 1 . 9 7–2 .1 5 ( m , 2 H ) , 2 . 3 1–2 .4 2 ( m , 1 H ) , 3 . 2 0

169

( s , 3 H ) , 3 .5 5 ( d d , J = 1 1 . 9 , 7 . 0 H z, 1 H ) , 3 . 6 3–3 .8 0 ( m , 1 H ) , 6 .8 2 ( d , J = 7 . 7 H z , 1 H ) , 6 . 9 5–7 .0 6 ( m , 1 H ) , 7 . 1 2–7 .2 4 ( m , 2 H ) , 7 . 6 8 ( b r s , 1 H ) . M S m/z 3 0 3 ( M + H)⁺.

( ± ) - M e t h y l ( 3S,3 'R, 5 'S) 5 ' i s o b u t y l 1 m e t h y l 2 o x o 1 , 2 d i h y d r o s p i r o [ i n d o l e 3 , 2 ' -p y r ro l i d i n e ] - 3 ' - c a r bo x y la t e ( 1 0 0 b ) . C o m p o u n d 1 0 0 b w a s p r e p a r ed f r o m 1 - m e t h y l - 1 H-i n d o l e - 2 , 3 - d H-i o n 9 9 b in a s i m i l a r m an n e r t o t h a t d e s c r i b ed f o r t h e s y n th e s i s o f c o m p o u n d 1 0 0 a a n d o b t a i n e d i n 8 5 % y i e l d a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l3) δ 0 .9 4 ( t , J

= 6 . 4 H z , 6 H) , 1 . 3 7–1 . 5 3 ( m , 2 H) , 1 . 6 4–1 . 7 9 ( m , 1 H) , 1 . 9 7–2 .1 4 ( m , 2 H ) , 2 . 3 7 ( d d d , J = 1 2 . 4 , 7 .1 , 5 . 3 H z , 1 H ) , 3 . 1 7 ( s , 3 H ) , 3 .2 1 ( s , 3 H) , 3 .4 7–3 .5 9 ( m , 1 H ) , 3 . 6 6–3 . 8 0 ( m , 1 H ) , 6 . 7 8 ( d , J = 7 .7 H z , 1 H ) , 6 . 9 8–7 . 0 6 ( m , 1 H ) , 7 . 1 4–7 .2 0 ( m , 1 H) , 7 . 2 3–7 . 3 0 ( m , 1 H ) . M S m/z 3 1 7 ( M + H )⁺.

( ± ) - M e t h y l ( 3S, 3 'R, 5 'S) 5 ' m e t h y l 2 o x o 1 , 2 d i h y d r o s p i r o [ i n d o l e 3 , 2 ' p y r ro l i d i n e ] 3 ' -c a r b o x y la t e ( 1 0 0 -c ) . C o m p o u n d 1 0 0 c w a s p r e p ar e d f r o m co m p o u n d 9 9 a a n d D L - a l a n i n e i n a s i m i l a r m a n n er t o th a t d e s c r i b e d f o r t h e s y n th e s i s o f c o m p o u n d 1 0 0 a an d o b t a i n ed i n 4 2 % y i e l d a s a wh i t e s o l id . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l3) δ 1 .3 2 ( d , J = 6 . 1 H z , 3 H ) , 1 .9 7– 2 . 1 4 ( m , 2 H ) , 2 . 3 5 ( d d d , J = 1 2 .4 , 7 .1 , 5 . 1 H z , 1 H ) , 3 . 1 9 ( s , 3 H) , 3 . 5 1–3 .6 4 ( m , 1 H ) , 3 . 6 6–3 .8 9 ( m , 1 H ) , 6 . 8 3 ( d , J = 7 . 7 H z , 1 H ) , 6 . 9 6–7 .0 4 ( m , 1 H ) , 7 . 1 4–7 .2 4 ( m , 2 H ) , 7 . 8 5 ( b r s , 1 H) . M S m/z 2 6 1 ( M + H)⁺.

( ± ) - M e t h y l ( 3S, 3 'R, 5 'R) 5 ' b e n z y l 2 o x o 1 ,2 d i h y d r o s p i r o [ i n d o l e 3 , 2 ' p y r ro l i d i n e ] 3 ' -c a r b o x y la t e ( 1 0 0 d ) . C o m p o u n d 1 0 0 d w a s p r ep a r ed f r o m c o m p o u n d 9 9 a an d D L -p h e n y l a l a n i n e in a s i m i l a r m an n er t o t h a t d e s c r ib e d f o r t h e s y n t h e s i s o f co m -p o u n d 1 0 0 a a n d o b t a i n e d i n 8 7 % y i e l d a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z, C D C l3) δ 2 .1 0–2 .3 3 ( m , 3 H) , 2 . 8 2–3 .0 3 ( m , 2 H) , 3 . 1 7 ( s , 3 H) , 3 . 5 1 ( d d , J = 1 1 . 6 , 7 . 4 H z , 1 H ) , 3 . 8 8–4 .0 1 ( m , 1 H ) , 6 . 8 1 ( d , J = 7 . 7 H z , 1 H ) , 6 . 9 2–7 . 0 5 ( m , 2 H ) , 7 .1 4–7 . 3 3 ( m , 6 H ) , 7 . 9 0 ( s , 1 H ) . M S m/z 3 3 7 ( M + H )⁺.

( ± ) - M e t h y l ( 3S, 3 'R, 5 'S) 4 f l u o r o 5 ' i s o b u t y l 2 o x o 1 ,2 d i h y d r o s p i r o [ i n d o l e 3 , 2 ' -p y r ro l i d i n e ] - 3 ' - c a r bo x y la t e ( 1 0 0 e ) . C o m p o u n d 1 0 0 e w a s p r e p a r e d f r o m 4 - f l u o r o - 1 H-i n d o l e - 2 , 3 - d H-i o n e 9 9 c a n d D L - l e u c in e i n a s i m i l a r m a n n e r t o t h a t d e s c r i b ed f o r t h e s y n th e s i s o f c o m p o u n d 1 0 0 a a n d o b t a i n ed in 7 0 % y i e ld a s a y e l l o w s o l i d . ¹H N M R ( 4 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 0 . 8 5–0 .9 0 ( m , 6 H ) , 1 . 2 8–1 . 3 9 ( m , 2 H) , 1 .5 8–1 . 6 7 ( m , 1 H) , 1 .9 2–2 . 0 3

170

( m , 1 H ) , 2 .1 1–2 .2 2 ( m , 1 H ) , 2 . 9 1–3 .0 4 ( m , 1 H ) , 3 .1 5 ( s , 3 H ) , 3 . 3 8–3 . 4 2 ( m , 1 H ) , 3 .4 4– 3 . 4 9 ( m , 1 H ) , 6 .6 0–6 . 6 9 ( m , 2 H ) , 7 .1 5–7 . 2 3 ( m , 1 H ) , 1 0 . 5 1 ( s , 1 H) . M S m/z 3 2 1 ( M + H )⁺. ( ± ) - M e t h y l ( 3S, 3 'R, 5 'S) 5 f l u o r o 5 ' i s o b u t y l 2 o x o 1 ,2 d i h y d r o s p i r o [ i n d o l e 3 , 2 ' -p y r ro l i d i n e ] - 3 ' - c a r bo x y la t e ( 1 0 0 f ) . C o m p o u n d 1 0 0 f w a s p r ep a r ed f r o m 5 - f l u o r o - 1 H-i n d o l e - 2 , 3 - d H-i o n e 9 9 d a n d D L - l e u c i n e i n a s i m i l a r m a n n e r to t h a t d e s c r i b ed f o r t h e s y n th e s i s o f c o m p o u n d 1 0 0 a a n d o b t a i n e d i n 6 3 % y i e l d a s a wh i t e s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l3) δ 0 . 9 0–0 . 9 9 ( m , 6 H ) , 1 . 3 5–1 .5 6 ( m , 2 H ) , 1 .6 5–1 . 8 0 ( m , 1 H ) , 1 . 9 3–2 .1 4 ( m , 2 H) , 2 . 3 7 ( d d d , J = 1 2 . 4 , 7 . 0 , 5 . 1 H z , 1 H ) , 3 . 2 7 ( s , 3 H ) , 3 . 4 7–3 . 6 1 ( m , 1 H ) , 3 . 6 5–3 . 8 4 ( m , 1 H) , 6 . 7 3–6 .8 1 ( m , 1 H ) , 6 . 8 6–6 . 9 6 ( m , 2 H ) , 7 . 9 9 ( s , 1 H ) . M S m/z 3 2 1 ( M + H )⁺.

( ± ) - M e t h y l ( 3S, 3 'R, 5 'S) - 5 - c h l o r o - 5 ' - i s o b u t y l - 2 - o x o - 1 , 2 - d i h y d r o s p i r o [ i n d o l e - 3 , 2 '-p y r ro l i d i n e ] - 3 ' - c a r bo x y l a t e ( 1 0 0 g ) . C o m p o u n d 1 0 0 g w a s p r ep a r ed f r o m 5 - c h l o r o - 1 H-i n d o l e - 2 , 3 - d H-i o n e 9 9 e a n d D L - l e u c in e i n a s i m i l a r m a n n e r t o t h a t d e s c r i b ed f o r t h e s y n th e s i s o f c o m p o u n d 1 0 0 a a n d o b t a i n e d i n 4 7 % y i e l d a s a wh i t e s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l3) δ 0 .9 5 ( d d , J = 6 . 3 , 5 .7 H z , 6 H ) , 1 .3 8–1 .5 6 ( m , 2 H ) , 1 .6 0–1 . 7 8 ( m , 1 H ) , 1 . 9 5–2 .1 2 ( m , 2 H ) , 2 . 3 0–2 . 4 3 ( m , 1 H ) , 3 .2 8 ( s , 3 H ) , 3 . 5 3 ( d d , J = 1 1 .9 , 7 . 0 H z , 1 H ) , 3 . 6 7–3 .8 1 ( m , 1 H ) , 6 . 7 6 ( d , J = 8 . 2 H z , 1 H ) , 7 . 1 5 ( d , J = 2 . 1 H z , 1 H ) , 7 .1 9 ( d d , J = 8 . 4 , 2 . 1 H z , 1 H ) , 7 .6 4 ( s , 1 H ) . M S m/z 3 3 7 ( M + H )⁺.

( ± ) - M e t h y l ( 3S, 3 'R, 5 'S) 6 f l u o r o 5 ' i s o b u t y l 2 o x o 1 ,2 d i h y d r o s p i r o [ i n d o l e 3 , 2 ' -p y r ro l i d i n e ] - 3 ' - c a r bo x y la t e ( 1 0 0 h ) . C o m p o u n d 1 0 0 h w a s p r e p a r e d f r o m 6 - f l u o r o - 1 H-i n d o l e - 2 , 3 - d H-i o n e 9 9 f a n d D L - l e u c in e i n a s i m i l a r m an n e r to t h a t d e s c r ib e d f o r t h e s y n th e s i s o f c o m p o u n d 1 0 0 a a n d o b t a i n ed in 6 4 % y i e ld a s a y e l l o w s o l i d . ¹H N M R ( 4 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 0 . 8 6–0 .9 1 ( m , 6 H ) , 1 . 3 1–1 . 4 5 ( m , 2 H) , 1 .6 1–1 . 6 9 ( m , 1 H) , 1 .7 9–1 . 8 9 ( m , 1 H ) , 2 .1 6–2 .2 3 ( m , 1 H ) , 2 . 9 3–2 .9 6 ( m , 1 H ) , 3 .1 2 ( s , 3 H ) , 3 . 2 8–3 . 3 2 ( m , 1 H ) , 3 .4 2– 3 . 5 3 ( m , 1 H ) , 6 . 5 5–6 . 6 1 ( m , 1 H ) , 6 . 6 6–6 . 7 4 ( m , 1 H ) , 7 .0 1–7 . 0 9 ( m , 1 H ) , 1 0 . 4 5 ( s , 1 H ) . M S m/z 3 2 1 ( M + H )⁺.

( ± ) - M e t h y l ( 3S, 3 'R, 5 'S) 7 f l u o r o 5 ' i s o b u t y l 2 o x o 1 ,2 d i h y d r o s p i r o [ i n d o l e 3 , 2 ' -p y r ro l i d i n e ] - 3 ' - c a r bo x y la t e ( 1 0 0 i ) . C o m p o u n d 1 0 0 i w a s p r e p ar e d f r o m 7 - f lu o r o - 1 H-i n d o l e - 2 , 3 - d H-i o n e 9 9 g a n d D L - l eu c i n e i n a s i m i l a r m an n e r t o t h a t d e s c r ib e d f o r th e s y n th e s i s o f c o m p o u n d 1 0 0 a a n d o b t a i n ed in 6 4 % y i e ld a s a y e l l o w s o l i d . ¹H N M R ( 4 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 0 . 8 5–0 .9 1 ( m , 6 H ) , 1 . 3 0–1 . 4 5 ( m , 2 H) , 1 .5 6–1 . 7 1 ( m , 1 H) , 1 .8 2–1 . 8 5

171

( m , 1 H ) , 2 .1 6–2 . 2 5 ( m , 1 H ) , 2 . 9 7–3 .1 3 ( m , 4 H ) , 3 . 3 3–3 .3 6 ( m , 1 H ) , 3 .4 5–3 . 5 8 ( m , 1 H ) , 6 . 8 6–6 .9 6 ( m , 2 H ) , 7 . 0 5–7 .1 3 ( m , 1 H ) , 1 0 .8 0 ( s , 1 H) . M S m/z 3 2 1 ( M + H )⁺.

( ± ) -t e r t- B u t y l ( 3S, 3 'R, 5 'S) 5 ' i s o b u t y l 2 o x o 1 ' ( p y r i d i n 2 y l ca r b o n y l ) 1 ,2 -d i h y -d r o s p i r o [ i n -d o l e - 3 , 2 ' - p y r r o l i -d i n e ] - 3 '- c a r b o x y l a t e ( 1 0 1 ) . T o a s o lu t i o n o f 9 9 a ( 3 .5 0 g , 2 3 .8 m m o l ) an d D L - l e u c in e ( 3 .1 2 g , 2 3 .8 m m o l ) i n T H F ( 1 5 0 m L ) an d w a t e r ( 5 0 m L ) w a s a d d ed t e r t- b u ty l a c r y l a t e ( 3 .4 6 m L , 2 3 . 8 m m o l ) a t r o o m t e m p e r a t u r e . T h e m i x t u r e w a s s t i r r e d a t 6 0 ° C f o r 1 6 h . T h e m i x t u r e w a s p o u r e d in t o w a t e r a t r o o m t em p e r a tu r e an d e x tr a c t e d w i t h E t O A c . T h e o r g an i c l ay e r w a s s e p ar a t e d , w a s h e d w i t h w a t e r a n d b r i n e, d r i e d o v e r M g S O4, a n d c o n c e n t r a t ed . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i e d b y s i l i c a g e l c o lu m n c h r o m a to g r ap h y ( h e x a n e / E t O A c = 9 / 1 t o 3 / 7 ) t o g i v e a ( ± ) -t e r t- b u t y l ( 3S,3 'R, 5 'S) - 5 '-i s o b u t y l - 2 - o x o - 1 , 2 - d '-i h y d r o s p '-ir o [ '-in d o l e - 3 ,2 ' - p y r r o l '-id '-i n e ] - 3 '- c a r b o x y l a t e ( 4 .9 0 g , 6 0 % ) a s a n o r a n g e s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l3) δ 0 . 8 6–1 .0 1 ( m , 1 5 H ) , 1 .3 6–1 . 5 8 ( m , 3 H) , 1 . 6 6–1 .7 9 ( m , 1 H ) , 1 .9 0–2 .0 6 ( m , 1 H ) , 2 .3 2 ( d d d , J = 1 2 . 3 , 6 .9 , 5 .0 H z , 1 H ) , 3 . 5 0 ( d d , J = 1 2 . 8 , 6 .7 H z , 1 H ) , 3 . 5 7–3 .7 5 ( m , 1 H ) , 6 . 7 8–6 . 8 7 ( m , 1 H ) , 6 . 9 6–7 . 0 8 ( m , 1 H ) , 7 . 1 6–7 . 2 6 ( m , 2 H) , 7 . 7 2 ( s , 1 H ) . M S m/z 3 4 5 ( M + H )⁺.

T o a s o l u t i o n o f p y r id i n e - 2 - c ar b o x y l i c a c id ( 2 6 8 m g , 2 . 1 8 m m o l ) i n T H F ( 5 m L ) w a s a d d e d D M F ( 8 . 4 L , 0 . 1 1 m m o l ) a n d o x a l y l c h lo r i d e ( 0 .2 2 8 m L , 2 . 6 1 m m o l ) a t 0 ° C . T h e m ix t u r e w a s s t i r r e d a t 0 ° C f o r 1 h . T h e m ix t u r e w a s c o n c e n tr a t e d a n d t h e n d i s s o l v e d i n T H F . T h e s o l u t i o n w a s co n c e n tr a t e d ag a i n a n d d i s s o l v e d i n T H F ( 5 m L ) . T o t h e m ix t u r e w a s a d d ed ( ± ) -t e r t- b u t y l ( 3S, 3 'R, 5 'S) 5 ' i s o b u t y l 2 o x o 1 , 2 d i h y d r o s p i r o [ i n d o l e 3 , 2 ' -p y r r o l i d i n e] - 3 '- c a r b o x y l a t e ( 2 5 0 m g , 0 .7 2 6 m m o l ) in T H F ( 5 m L ) a n d D I P E A ( 0 . 7 5 9 m L , 4 . 3 5 m m o l ) a t 0 ° C . T h e m ix t u r e w a s a l l o w e d t o w a r m t o r o o m t e m p e r a t u r e a n d s t i r r ed o v e r n i g h t . T h e r e a c t i o n m i x tu r e w a s p o u r e d i n t o s a t u r a t ed a q u e o u s N a H C O3 a n d e x t r a c t e d w i t h E t O A c . T h e o r g a n i c l a y er w a s s e p ar a t e d , w a s h e d w i t h w a t e r a n d b r i n e, d r i e d o v er M g S O4, a n d c o n ce n t r a t ed . T h e r e s i d u e w a s p u r if i e d b y N H - s i l i c a g e l c o l u m n c h r o m a to g r ap h y ( h e x an e / E t O A c = 9 5 / 5 t o 0 / 1 0 0 ) t o g i v e 1 0 1 ( 2 3 3 m g , 7 1 % ) a s a wh i t e s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l3) δ 0 . 7 1 ( d , J = 6 .5 H z , 3 H ) , 0 . 7 7 ( d , J = 6 .7 H z , 3 H ) , 0 . 8 7–1 .1 0 ( m , 1 0 H ) , 1 . 3 1–1 . 4 6 ( m , 1 H ) , 1 .4 9–1 . 6 5 ( m , 1 H ) , 2 . 3 7 ( t d , J = 1 3 .2 , 9 .9 H z , 1 H) , 2 . 5 9–2 . 8 0 ( m , 1 H ) , 3 .6 1 ( d d , J = 1 3 .1 , 7 . 5 H z , 1 H ) , 5 . 1 0–5 . 3 4 ( m , 1 H ) , 6 .8 8 ( d , J = 7 . 7 H z , 1 H ) , 6 . 9 7–7 . 0 6 ( m , 1 H ) , 7 .1 7–7 .2 9 ( m , 2 H) , 7 .3 5 ( d d d , J = 7 .5 , 4 .8 , 1 .3 H z , 1 H ) ,

172

7 . 6 1–7 .6 8 ( m , 1 H ) , 7 .7 0–7 .7 9 ( m , 1 H ) , 7 .8 3 ( s , 1 H ) , 8 .5 5–8 . 6 6 ( m , 1 H ) . M S m/z 4 5 0 ( M + H )⁺.

X-ra y c r y s t a l s t r u c t u re a n a l y s i s o f c o m p o u n d s . A l l m e a s u r e m en t s w e r e m a d e o n a R i g a k u X t a L A B P 2 0 0 d if f r a c to m e t e r ( f o r co m p o u n d s 6 2 b, 6 9, 7 3, 8 9 a a n d 9 0 a) a n d a R i g a k u R - A X I S R A P I D - 1 9 1 R d i f f r a c t o m e t e r ( f o r co m p o u n d s 6 6, 7 1 a n d 7 2) u s i n g g r a p h i t e m o n o ch r o m a t e d C u Kα r a d i a t i o n . T h e s t r u c t u r e w a s s o l v e d b y d i r e c t m e t h o d s w i t h S I R 2 0 0 8 ( B u r l a e t a l. , 2 0 0 7 ) an d w a s r e f in e d u s i n g f u l l - m a t r ix l e a s t - s q u a r e s o n F² w i t h S H E L X L - 2 0 1 3 / 4 o r S H E L X L - 2 0 1 4 /7 ( S h e ld r i c k , 2 0 0 8 ) . A l l n o n - H a to m s w e r e r ef i n e d w i t h a n i s o t r o p i c d i s p l a c e m e n t p a r am e t e r s . A l l t h e s e d a t a c an b e o b t a i n e d f r e e o f c h a r g e f r o m T h e C a m b r id g e C r y s t a l l o g r ap h i c D a t a C e n t r e v i a h t tp : / / w w w. c c d c . c am . a c .u k / C o m m u n i t y / R e q u e s t a s t r u c tu r e / P a g e s / D a t a R e q u e s t . a s p x ? .

F i g u r e 3 - 1 3 . O R T E P o f 7 2, th e r m a l e l l i p s o i d s a r e d r a wn a t 5 0 % p r o b a b i l i t y .

C r y s t a l d a t a fo r 7 2 ( C C D C 1 5 3 9 9 5 8 ) : C2 0H1 9N3O4, M W = 3 6 5 . 3 9 ; c r y s t a l s i z e , 0 . 2 3 × 0 . 1 8

× 0 . 1 0 m m ; c o l o r l e s s , b lo c k ; t r i c l i n i c , s p a c e g r o u p P- 1 , a = 7 .3 3 2 1 5 ( 1 3 ) Å , b = 8 . 9 9 2 5 0 ( 1 6 ) Å , c = 1 3 .4 9 6 8 ( 3 ) Å , α = 7 7 .6 8 6 ( 6 ) ° , β = 8 3 . 1 6 0 ( 6 ) ° , γ = 8 5 . 4 7 3 ( 6 ) ° , V = 8 6 1 .9 3 ( 3 ) ų, Z = 2 , D x = 1 . 4 0 8 g / cm³, T = 1 0 0 K , μ = 0 . 8 2 4 m m⁻¹, λ = 1 . 5 4 1 8 7 Å , R1 = 0 . 0 5 0 , w R2 = 0 . 1 2 7 .

173

F i g u r e 3 - 1 4 . O R T E P o f 7 3, th e r m a l e l l i p s o i d s a r e d r a wn a t 3 0 % p r o b a b i l i t y .

C r y s t a l d a t a fo r 7 3 ( C C D C 1 5 3 9 9 5 9 ) : C2 6H2 3N3O4∙ 0 . 7 H2O , M W = 4 5 4 .1 0 ; cr y s t a l s i z e , 0 . 1 4 × 0 .1 1 × 0 .0 5 m m ; co l o r l e s s , b lo c k ; t r i c l i n i c, s p a c e g r o u p P- 1 , a = 8 . 0 0 2 0 0 ( 1 7 ) Å , b

= 1 1 .7 6 1 8 ( 2 ) Å , c = 1 1 .8 0 6 8 0 ( 1 8 ) Å , α = 9 7 .8 7 9 6 ( 1 4 ) ° , β = 9 3 .9 1 7 7 ( 1 5 ) ° , γ = 9 2 . 3 3 1 0 ( 1 6 ) ° , V = 1 0 9 6 .7 6 ( 3 ) ų, Z = 2 , D x = 1 . 3 7 5 g / c m³, T = 1 0 0 K , μ = 0 . 7 8 6 m m⁻¹, λ

= 1 . 5 4 1 8 7 Å , R1 = 0 . 0 4 0 , w R2 = 0 .1 0 5 .

F i g u r e 3 - 1 5 . O R T E P o f 7 1, th e r m a l e l l i p s o i d s a r e d r a wn a t 5 0 % p r o b a b i l i t y .

C r y s t a l d a t a fo r 7 1 ( C C D C 1 5 3 9 9 6 0 ) : C2 3H2 7N3O3, M W = 3 9 3 . 4 8 ; c r y s t a l s i z e , 0 . 3 4 × 0 . 3 3

× 0 . 1 2 m m ; co l o r l e s s , b l o c k ; m o n o c l i n i c , s p ac e g r o u p P21/n , a = 1 3 .0 7 8 9 ( 2 ) Å , b = 1 0 . 9 0 4 3 ( 2 ) Å , c = 1 5 . 4 8 5 8 ( 3 ) Å , α = γ = 9 0 ° , β = 1 0 6 . 9 0 8 ( 8 ) ° , V = 2 1 1 3 .0 6 ( 1 1 ) ų, Z = 4 , D x = 1 . 2 3 7 g / c m³, T = 1 0 0 K , μ = 0 . 6 6 7 m m⁻¹, λ = 1 . 5 4 1 8 7 Å , R1 = 0 . 0 6 5 , w R2 = 0 .1 4 2 .

174

F i g u r e 3 - 1 6 . O R T E P o f 6 2 b, t h er m a l e l l i p s o id s a r e d r a w n a t 5 0 % p r o b ab i l i t y .

C r y s t a l d a t a f o r 6 2 b ( C C D C 1 5 3 9 9 6 1 ) : C2 3H2 5N3O4, M W = 4 0 7 . 4 7 ; c r y s t a l s i z e , 0 . 2 6 × 0 . 0 7 × 0 . 0 5 m m ; co l o r l e s s , b lo c k ; m o n o c l i n i c , s p a c e g r o u p P21, a = 9 .1 1 4 6 8 ( 5 ) Å , b = 7 . 8 7 6 0 4 ( 5 ) Å , c = 1 4 . 8 8 7 2 0 ( 8 ) Å , α = γ = 9 0 ° , β = 1 0 0 . 8 6 1 0 ( 5 ) ° , V = 1 0 4 9 . 5 7 2 ( 1 1 ) ų, Z

= 2 , D x = 1 .2 8 9 g / cm³, T = 1 0 0 K , μ = 0 . 7 2 9 m m⁻¹, λ = 1 .5 4 1 8 7 Å , R1 = 0 .0 2 9 , w R2 = 0 . 0 7 6 , F l a c k P a r a m e t e r ( F l a c k , 1 9 8 3 )= − 0 . 0 6 ( 9 ) .

F i g u r e 3 - 1 7 . O R T E P o f 6 6, th e r m a l e l l i p s o i d s a r e d r a wn a t 3 0 % p r o b a b i l i t y .

C r y s t a l d a t a fo r 6 6 ( C C D C 1 5 3 9 9 6 2 ) : 2 . 0 C2 2H2 5N3O3∙ 1 .0 H2O , M W = 7 7 6 . 9 3 ; c r y s t a l s i z e , 0 . 2 3 × 0 .1 4 × 0 . 0 9 m m ; c o lo r l e s s , b l o ck ; t r i c l i n i c, s p a c e g r o u p P- 1 , a = 9 .0 8 1 1 0 ( 1 6 ) Å , b = 1 0 .3 9 6 5 0 ( 1 9 ) Å , c = 2 1 . 4 9 5 2 ( 4 ) Å , α = 9 9 . 2 1 1 ( 7 ) ° , β = 9 3 .0 7 4 ( 7 ) ° , γ = 9 4 . 4 5 9 ( 7 ) ° , V = 1 9 9 2 .6 6 ( 8 ) ų, Z = 2 , D x = 1 . 2 9 5 g / c m³, T = 2 9 6 K , μ = 0 . 7 1 9 m m⁻¹, λ = 1 . 5 4 1 8 7 Å , R1 = 0 .1 2 3 , w R2 = 0 .2 4 8 .

175

F i g u r e 3 - 1 8 . O R T E P o f 6 9, th e r m a l e l l i p s o i d s a r e d r a wn a t 3 0 % p r o b a b i l i t y .

C r y s t a l d a t a f o r 6 9 ( C C D C 1 5 3 9 9 6 3 ) : C2 2H2 5N3O2, M W = 3 6 3 . 4 6 ; cr y s t a l s i z e , 0 . 3 4 × 0 .2 7

× 0 .2 5 m m ; co l o r l e s s , b l o ck ; m o n o c l i n i c , s p a c e g r o u p P21/ c , a = 1 1 . 4 0 4 9 0 ( 9 ) Å , b = 1 4 . 4 6 1 3 0 ( 1 1 ) Å , c = 1 2 .6 8 6 7 0 ( 1 2 ) Å , α = γ = 9 0 ° , β = 1 1 4 . 1 3 3 0 ( 1 0 ) ° , V = 1 9 0 9 . 5 3 ( 3 ) ų, Z = 4 , D x = 1 . 2 6 4 g / c m³, T = 1 0 0 K , μ = 0 . 6 5 5 m m⁻¹, λ = 1 . 5 4 1 8 7 Å , R1 = 0 . 0 3 7 , w R2 = 0 . 0 9 1 .

F i g u r e 3 - 1 9 . O R T E P o f 8 9 a, t h e r m a l e l l i p s o i d s ar e d r a w n a t 5 0 % p r o b a b i l i t y .

C r y s t a l d a t a f o r 8 9 a ( C C D C 1 5 3 9 9 6 4 ) : C2 1H2 5F N4O2∙C2 7H2 9F N4O2 ( c o - c r y s t a l o f 8 9 a a n d 9 0 b) , M W = 8 4 5 .0 0 ; c r y s t a l s i z e , 0 .1 5 × 0 .0 8 × 0 . 0 3 m m ; c o l o r l e s s , p l a t e ; m o n o c l i n i c, s p a c e g r o u p C2 , a = 2 6 .1 0 4 6 0 ( 1 1 ) Å , b = 1 4 . 0 8 3 0 0 ( 6 ) Å , c = 1 2 . 5 4 8 7 0 ( 6 ) Å , α = γ = 9 0 ° , β = 9 2 . 1 9 9 0 ( 4 ) ° , V = 4 6 0 9 .8 9 ( 4 ) ų, Z = 4 , D x = 1 . 2 1 7 g / cm³, T = 1 0 0 K , μ = 0 . 6 9 0 m m⁻¹, λ = 1 . 5 4 1 8 7 Å , R1 = 0 . 0 3 7 , w R2 = 0 . 0 9 5 , F l a ck P a r a m e t er ( F l a c k , 1 9 8 3 ) = 0 .0 3 ( 4 ) .

176

F i g u r e 3 - 2 0 . O R T E P o f 9 0 a, t h e r m a l e l l i p s o i d s ar e d r a w n a t 3 0 % p r o b a b i l i t y .

C r y s t a l d a t a fo r 9 0 a ( C C D C 1 5 3 9 9 6 5 ) : 2 . 0 C2 7H2 9F N4O2∙ 2 .7 5 H2O , M W = 9 7 0 .6 4 ; cr y s t a l s i z e , 0 . 1 9 × 0 . 0 5 × 0 . 0 3 m m ; c o lo r l e s s , b lo c k ; m o n o c l i n i c , s p a c e g r o u p P21, a = 1 4 . 7 2 3 4 0 ( 1 4 ) Å , b = 1 1 .9 0 5 1 0 ( 1 2 ) Å , c = 1 5 . 3 0 5 1 0 ( 1 7 ) Å , α = γ = 9 0 ° , β = 1 0 7 .4 2 0 0 ( 1 1 ) ° , V = 2 5 5 9 .6 9 ( 5 ) ų, Z = 2 , D x = 1 . 2 5 9 g / c m³, T = 1 0 0 K , μ = 0 . 7 3 0 m m⁻¹, λ = 1 . 5 4 1 8 7 Å , R1 = 0 .0 4 0 , w R2 = 0 .1 0 1 , F l a c k P a r a m e t e r ( F l a c k , 1 9 8 3 ) = - 0 . 0 4 ( 7 ) .

P h y s i c o c h em i c a l p r o p e r t y

S a m e p r o to c o l s d e s c r ib e d i n C h a p t er 2 ( C D K 1 2 i n h ib i t o r ) w e r e u s e d .

177 3 . 5 参 考 文 献

A b s m e i e r , E . ; S a n to s , K . F . ; W a h l , M . C . F u n c t i o n s a n d r e g u l a t i o n o f t h e B r r 2 R N A h e l i c a s e d u r in g s p l i c i n g . C e l l C y c l e 2 0 1 6, 1 5, 3 3 6 2–3 3 7 7 .

A b s m e i e r , E . ; S a n to s , K . F . ; W a h l , M . C . M o l e cu l a r m e ch a n i s m u n d e r ly i n g in h i b i t i o n o f i n t r in s i c A T P a s e a c t i v i t y in a S k i2 - l i k e R N A h e l i c a s e . S t r u c tu r e, 2 0 2 0, 2 8, 2 3 6–2 4 3 . e 3

A d am s , P . D . ; A f o n in e , P . V . ; B u n k o c z i , G. ; C h en , V . B . ; D a v i s , I . W . ; E ch o l s , N . ; H e a d d , J . J . ; H u n g , L . W . ; K a p r a l , G . J . ; G r o s s e - K u n s t l e v e, R . W . ; M c C o y , A . J . ; M o r i a r ty , N . W . ; O e f f n er , R . ; R e a d , R . J . ; R i c h a r d s o n , D . C . ; R i c h a r d s o n , J . S . ; T e r w i l l i g er , T . C . ; Z w a r t , P . H . P H E N I X : a c o m p r eh e n s i v e P y t h o n - b a s e d s y s t e m f o r m a c r o m o l e cu l a r s t r u c tu r e s o l u t io n . A c t a C r y s t a l l o g r . S e c t. D B i o l . C r y s t a l l o g r . 2 0 1 0, 6 6, 2 1 3–2 2 1 .

B u r l a , M . C . ; C a l i a n d r o , R . ; C a m a l l i , M . ; C a r r o z z i n i , B . ; C a s c a r a n o , G . L . ; D e C a r o , L . ; G i a c o v a z z o , C . ; P o l i d o r i , G . ; S i l i q i , D . ; S p a g n a , R . I L M I L I O N E : a s u i t e o f co m p u t e r p r o g r a m s f o r c r y s t a l s t r u c t u r e s o lu t i o n o f p r o t e i n s . J. A p p l. C r y s t a l l o g r. 2 0 0 7, 4 0, 6 0 9– 6 1 3 .

C h e n , V . B . ; A r e n d a l l , W . B . , 3 r d ; H e a d d , J . J . ; K e ed y , D . A . ; I m m o r m in o , R . M . ; K ap r a l , G . J . ; M u r r a y , L . W . ; R i c h a r d s o n , J . S . ; R i c h a r d s o n , D. C . M o l P r o b i t y : a l l - a to m s t r u c tu r e v a l id a t i o n f o r m a cr o m o l e c u l a r cr y s t a l l o g r a p h y . A c t a C r y s t a l l o g r . S ec t . D B i o l . C r y s t a l l o g r . 2 0 1 0, 6 6, 1 2–2 1 .

C o l l a b o r a t i v e C o m p u t a t i o n a l P r o j e c t , Nu m b er 4 . T h e C C P 4 s u i t e : p r o g r am s f o r p r o t e i n c r y s t a l l o g r ap h y . A c t a C r y s t a l l o g r . S e c t . D B io l . C r y s t a l l o g r . 1 9 9 4, 5 0, 7 6 0–7 6 3 .

C o s t e , J . ; F r é r o t , E . ; Jo u i n , P. ; C a s t r o , B . O x y b e n zo t r i a z o l e f r e e p ep t i d e co u p l i n g r e ag e n t s f o r N-m e th y l a t e d a m i n o a c i d s . Te t r a h e d ro n L e t t . 1 9 9 1, 3 2, 1 9 6 7 – 1 9 7 0 .

D e v o s , A . ; R e m i o n , J . ; F r i s q u e - H e s b a i n , A . - M . ; C o l en s , A . ; G h o s e z , L . S y n t h e s i s o f a c y l h a l id e s u n d e r v e r y m i l d co n d i t io n s . J . C h e m . S o c ., C h e m . C o m m u n . 1 9 7 9, 1 1 8 0–1 1 8 1 .

178

E m s l e y , P . ; C o w t a n , K . C o o t : m o d e l - b u i l d in g t o o l s f o r m o l e c u l ar g r ap h i c s . A c t a C r y s t a l l o g r . S e c t . D B i o l . C r y s t a l l o g r . 2 0 0 4, 6 0, 2 1 2 6–2 1 3 2 .

E v a n s , P . R . ; M u r s h u d o v , G . N . H o w g o o d a r e m y d a t a a n d w h a t i s t h e r e s o l u t i o n ? A c t a C r y s t a l l o g r . S e c t . D B i o l . C r y s t a l l o g r . 2 0 1 3, 6 9, 1 2 0 4–1 2 1 4 .

F e n g , Y . ; M a j i r e ck , M . M. ; W e i n r e b , S . M . T o t a l s y n t h e s e s o f t h e m o n o t e r p en e i n d o l e a l k a lo i d s ( ± ) - A l s t i l o b a n in e A a n d E an d ( ± ) - A n g u s t i l o d in e . J . O r g . C h e m . 2 0 1 4, 7 9, 7–2 4 .

F l a c k , H . O n en a n t i o m o r p h - p o l a r i t y e s t i m a t i o n . A c t a C r y s t a l l o g r. S e c t. A 1 9 8 3, 3 9, 8 7 6– 8 8 1 .

F r é r o t , E . ; C o s t e , J . ; P a n t a lo n i , A . ; D u f o u r, M .-N. ; J o u i n , P. P y B O P^® an d P y B r o P : Tw o r e ag e n t s f o r t h e d i ff i c u l t co u p l in g o f th e α , α-d i a lk y l am i n o a c i d , A i b . Te t r a h e d ro n 1 9 9 1, 4 7, 2 5 9 – 2 7 0 .

H a t t o r i, K . ; S a j i k i , H . ; H i r o t a , K . P d / C ( e n ) - c a t a l y z ed ch e m o s e l e c t i v e h y d r o g e n a t i o n w i t h r e t en t i o n o f t h e N- C b z p r o t e c t i v e g r o u p a n d i t s s c o p e a n d l i m i t a t i o n s . T e t r a h e d r o n 2 0 0 0, 5 6, 8 4 3 3–8 4 4 1 .

I w a t an i - Y o s h i h ar a , M . ; I to , M . ; K l e i n , M . G . ; Y a m am o t o , T . ; Y o n e m o r i , K . ; T an a k a , T . ; M i w a , M . ; M o r i s h i t a , D . ; E n d o , S . ; T j h e n , R . ; Q i n , L . ; N a k an i s h i , A . ; M a e z a k i , H . ; K a w a m o to , T ., D i s c o v e r y o f a l l o s t e r i c i n h ib i t o r s t a r g e t i n g th e s p l i c e o s o m a l R N A h e l i c a s e B r r 2 . J . M e d . C h e m . 2 0 1 7, 6 0, 5 7 5 9–5 7 7 1 .

K a b s c h , W . X d s . A c t a C r y s t a l l o g r . S e c t . D B i o l . C r y s t a l l o g r . 2 0 1 0, 6 6, 1 2 5–1 3 2 .

K a i , H . ; E n d o h , T . ; J i k i h ar a , S . ; A s a h i , K . ; H o r i g u ch i , T . N o v e l h e t e r o c y c l i c d e r i v a t i v e s a n d p h a r m a c eu t i c a l c o m p o s i t i o n co n t a i n i n g s a m e. P C T I n t . A p p l . W O 2 0 1 2 0 2 0 7 4 2 A 1 , F e b . 1 6 , 2 0 1 2 .

K i m , D . H . ; R o s s i , J . J . T h e f i r s t AT P a s e d o m a i n o f th e y e a s t 2 4 6-k D a p r o t e i n i s r eq u i r ed f o r i n v i v o u n w i n d in g o f t h e U 4 / U 6 d u p l e x , R N A 1 9 9 9, 5, 9 5 9 – 9 7 1 .

179

L au r e n c e, C . ; B r a m e l d , K. A . ; G r a to n , J . ; L e Qu e s t e l , J .-Y. ; R e n au l t , E . T h e p KB H X

d a t ab a s e : To w a r d a b e t t er u n d e r s t a n d in g o f h y d r o g e n-b o n d b a s i c i t y f o r m ed i c i n a l c h e m i s t s . J . M e d . C h e m . 2 0 0 9, 5 2, 4 0 7 3 – 4 0 8 6 .

M c C o y , A . J . ; G r o s s e - K u n s t l e v e , R . W . ; A d a m s , P . D . ; W i n n , M . D . ; S t o r o n i , L . C . ; R e a d , R . J . P h a s e r cr y s t a l l o g r a p h i c s o f t w a r e. J . A p p l . C r y s t a l l o g r . 2 0 0 7, 4 0, 6 5 8–6 7 4 .

M u r s h u d o v , G. N . ; V a g i n , A . A . ; D o d s o n , E . J . R e f i n em e n t o f m a c r o m o l e c u l a r s t r u c t u r e s b y th e m ax i m u m - l i k e l i h o o d m e th o d . A c ta C r y s t a l l o g r . S e c t . D B i o l. C r y s t a l l o g r . 1 9 9 7, 5 3, 2 4 0–2 5 5 .

N a h m , S . ; We i n r eb , S . M . N-m e t h o x y-n-m e t h y l a m i d e s a s e ff e c t i v e a cy l a t i n g ag e n t s . Te t r a h e d ro n L e t t . 1 9 8 1, 2 2, 3 8 1 5 – 3 8 1 8 .

O g in o , M. ; I k e d a , Z . ; F u j i m o to , J . ; Oh b a , Y . ; I s h i i , N . ; F u j i m o t o , T . ; O d a , T . ; T a y a, N . ; Y a m a s h i t a , T . ; M a t s u n a g a , N . H e t e r o c y c l i c c o m p o u n d . P C T I n t . A p p l . W O 2 0 1 4 0 3 0 7 4 3 A 1 , F e b . 2 7 , 2 0 1 4 .

P e n a , V . ; J o v i n , S . M . ; F a b r i z i o , P . ; O r lo w s k i , J . ; B u j n i ck i , J . M . ; L u h r m an n , R . ; W a h l , M . C . C o m m o n d e s i g n p r i n c ip l e s i n t h e s p l i c e o s o m a l R N A h e l i c a s e B r r 2 an d i n th e H e l 3 0 8 D N A h e l i c a s e . M o l . C e l l 2 0 0 9, 3 5, 4 5 4–4 6 6 .

R e h n , S . ; B e r g m an , J . ; S t e n s l a n d , B . T h e t h r e e -c o m p o n e n t r ea c t i o n b e t w e e n i s a t i n , α -a m in o -a c id s , -a n d d i p o l -a r o p h i l e s . E u r . J . O r g . C h e m. 2 0 0 4, 4 1 3–4 1 8 .

S a j i k i , H . ; H a t t o r i , K . ; H i r o t a , K . T h e f o r m a t i o n o f a n o v e l P d / C − e t h y l e n e d i a m i n e c o m p l e x c a t a ly s t : c h e m o s e l e c t i v e h y d r o g en a t i o n w i t h o u t d e p r o t e c t i o n o f t h e O-b en z y l a n d N-C b z g r o u p s . J . O rg . C h e m . 1 9 9 8, 6 3, 7 9 9 0 – 7 9 9 2 .

S a n t o s , K . F . ; J o v i n , S . M . ; W e b e r , G . ; P e n a , V . ; L u h r m a n n , R . ; W a h l , M . C . S t r u c t u r a l b a s i s f o r f u n c t i o n a l c o o p er a t i o n b e t w e en t a n d e m h e l i c a s e c a s s e t t e s i n B r r 2 - m ed i a t e d r em o d e l in g o f t h e s p l i c e o s o m e . P r o c. N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 2 0 1 2, 1 0 9, 1 7 4 1 8–1 7 4 2 3 .

S e i j a s , J . A . ; V á z q u e z-Ta t o , M . P. ; C a s t e d o , L . ; E s t é v e z , R . J . ; Ó n e g a, M . G . ; R u í z , M .

180

S y n th e s i s o f p y r r o l i z i d in e s v i a co p p er ( I ) c a t a l y z ed r ad i c a l a t o m t r a n s f e r cy c l i z a t i o n . Te t r a h e d ro n 1 9 9 2, 4 8, 1 6 3 7 – 1 6 4 2 .

S h ad r i c k , W . R . ; N d j o m o u , J . ; K o l l i , R . ; M u k h e r j e e , S . ; H a n s o n , A . M . ; F r i c k , D . N . D i s c o v er i n g n e w m e d i c i n e s t a r g e t i n g h e l i c a s e s : c h a l l en g e s a n d r e c e n t p r o g r e s s . J . B i o m o l . S c r e en . 2 0 1 3, 1 8, 7 6 1–7 8 1 .

S h e l d r i c k , G . A s h o r t h i s t o r y o f S H E L X . A c t a C r y s t a l l o g r. S e c t. A 2 0 0 8, 6 4, 1 1 2–1 2 2 .

S i n g h , R . P. ; S h r e e v e , J . M . R e c e n t ad v an c e s i n n u c l e o p h i l i c f lu o r i n a t io n r e ac t i o n s o f o rg a n i c co m p o u n d s u s i n g d eo x o f l u o r an d D A S T. S yn t h e s i s 2 0 0 2, 2 5 6 1 – 2 5 7 8 .

v an N u e s , R . W. ; B e g g s , J . D . F u n c t io n a l c o n t a c t s w i t h a r a n g e o f s p l i c i n g p r o t e i n s s u g g e s t a c en t r a l r o l e f o r B r r 2 p in t h e d y n am i c co n t r o l o f t h e o r d e r o f e v e n t s in s p l i c e o s o m e s o f S a c ch a r o m y c e s c er e v i s i a e . G e n e t i c s 2 0 0 1, 1 5 7, 1 4 5 1 – 1 4 6 7 .

W a l l a c e , E . M. ; L y s s i k a t o s , J . ; B l a k e , J . F . ; S e o , J . ; Y a n g , H. W . ; Y e h , T . C . ; P e r r i e r , M . ; J a r s k i , H . ; M ar s h , V . ; P o ch , G. ; L iv i n g s t o n , M . G . ; O t t e n , J . ; H i n g o r a n i , G . ; W o e s s n e r , R . ; L e e , P . ; W i n k l er , J . ; K o c h , K . P o t e n t a n d s e l e c t i v e m i to g e n - a c t i v a t ed p r o t e i n k i n a s e k in a s e ( M E K) 1 , 2 i n h ib i t o r s . 1 . 4 ( 4 b r o m o 2 f l u o r o p h e n y l a m i n o ) 1 m e t h y l p y r i d in -2 ( 1 H ) - o n e s . J. M e d . C h e m . 2 0 0 6, 4 9, 4 4 1–4 4 4 .

Z h a n g , L . ; X u , T . ; M a e d er , C . ; B u d , L . O . ; S h a n k s , J . ; N i x , J . ; G u t h r i e , C . ; P l e i s s , J . A . ; Z h a o , R . S t r u c t u r a l e v i d en c e f o r c o n s e cu t i v e H e l3 0 8 - l i k e m o d u l e s i n t h e s p l i c eo s o m a l A T P a s e B r r 2 . N a t . S t r u c t . M o l. B i o l . 2 0 0 9, 1 6, 7 3 1–7 3 9 .

181

第 四 章 選 択 的 e I F 4 A 3 阻 害 剤 、 イ ン ド ー ル- 2 -カ ル ボ ン 酸 誘 導 体 お よ び 1 , 4 -ジ ア シ ル ピ ペ ラ

ジ ン 誘 導 体 の 発 見

4 . 1 化 合 物 探 索 戦 略 、 化 合 物 発 見 ま で の 過 程 お よ び 生 物 活 性 の 評 価

筆 者 は 、e I F 4 A 3の 機 能 解 明 お よ び 癌 や 遺 伝 病 の 治 療 薬 の 標 的 と し て の タ ー ゲ ッ ト バ リ デ ー シ ョ ン を 目 的 と し 、 低 分 子 プ ロ ー ブ と し て 利 用 可 能 な 選 択 的 低 分 子 e I FA 3 阻 害 剤 の 創 出 に 取 り 組 ん だ^*。

e I F 4 A 3 に 関 し て も R N A 依 存 AT P a s e ア ッ セ イ^{* *}を 用 い て 、 武 田 薬 品 工 業 の 社 内 化 合 物 ラ

イ ブ ラ リ ー の ハ イ ス ル ー プ ッ ト ス ク リ ー ニ ン グ を 行 っ た 。 ス ク リ ー ニ ン グ の ポ ジ テ ィ ブ コ ン ト ロ ー ル と し て 、e I F 4 A 3 に 対 し て も 弱 い 阻 害 活 性 を 示 す こ と が 知 ら れ て い る p a n - eI F 4 A 阻 害 剤 h i p p u r i s t a n o l 1 0 2 ( B o r d e l e a u e t a l. , 2 0 0 6 ; C e n c i c e t a l. , 2 0 1 6 ; H i g a e t a l., 1 9 8 1 ; L i n d q v i s t e t a l. , 2 0 0 8 ) を 用 い た ( F i g u r e 4 - 1 )。 ス ク リ ー ニ ン グ の 結 果 、 イ ン ド ー ル- 2 -カ ル ボ ン 酸 誘 導 体 1 0 3 お よ び ジ ア シ ル ピ ペ ラ ジ ン 誘 導 体 1 0 4 を ヒ ッ ト 化 合 物 と し て 見 出 し た

( F i g u r e 4 - 1 )。 ま ず 、 構 造 が よ り 単 純 な 1 0 3 の 構 造 最 適 化 に 取 り 組 み 、 よ り 活 性 の 強 い 化 合 物

を 探 索 し た 。

F i g u re 4 - 1 . 既 知 の p a n -e IF4 A 阻 害 剤 h i p p u r i s t a n o l お よ び 本 研 究 で 得 ら れ た ス ク リ ー ニ ン グ ヒ ッ ト 化 合 物の 構 造

*本 章 の 生 物 活 性 評 価 は 、 岩 谷 美 沙 博 士 、 森 下 大 輔 博 士 に 、 タ ン パ ク 質 の 調 製 お よ び ハ イ ス ル ー プ ッ ト ス ク リ ー ニ ン グ は 大 西 智 美 氏 、 伊 藤 隆 司 氏 、 松 本 真 一 氏 、 森 山 真 次 氏 、 近 藤 滋 氏 、 猶 塚 昭 彦 氏 、I T C を 用 い た 実 験 は 曽 我 部 智 博 士 に 、S P R を 用 い た 実 験 は 鎌 田 祐 輔 博 士 に そ れ ぞ れ 実 施 し て 頂 い た 。

* *評 価 化 合 物 の e I F 4 A 3や 他 の ヘ リ カ ー ゼ の R N A依 存 A T P a s e 活 性 の 阻 害 能 は 、A D P - G l o ア ッ セ イ ( P r o m e g a ) を 用 い て 産 生 す る A D P 量 の 変 化 を 検 出 し 、 結 果 を I C5 0値 と し て 算 出 す る こ と で 評 価 し た (詳 細 は 実 験 の 部 に 記 載)。

182

<イ ン ド ー ル- 2 -カ ル ボ ン 酸 誘 導 体>

ヒ ッ ト 化 合 物 1 0 3 を 起 点 と し た イ ン ド ー ル- 2 -カ ル ボ ン 酸 誘 導 体 の デ ザ イ ン 戦 略 を F i g u r e

4 - 2 に 示 す 。 ま ず 、( A ) イ ン ド ー ル 環 6 位 の イ ソ プ ロ ピ ル 基 、( B ) 2 位 の カ ル ボ キ シ 基 、 そ し

て ( C ) イ ン ド ー ル 環 の N H 基 の 必 要 性 を 調 べ 、 次 に ( D) イ ン ド ー ル 環 へ の 置 換 基 導 入 を 試 み 、

最 後 に 活 性 を 最 大 化 す る た め に 、 有 望 な 置 換 基 の 組 み 合 わ せ を 調 査 す る 。

F i g u r e 4 - 2. 化 合 物 1 0 3 を 基 に し た デ ザ イ ン 戦 略

最 初 に 化 合 物 1 0 3 の6 -イ ソ プ ロ ピ ル 基 の 効 果 を 調 べ た ( T a b l e 4 - 1 )。6 -メ チ ル 誘 導 体 1 0 5、 6 -エ チ ル 誘 導 体 1 0 6 お よ び 6 -ク ロ ロ 誘 導 体 1 0 7 は 、 い ず れ も 減 弱 し た 活 性 を 示 し た 。 こ の 結 果 は 、 イ ソ プ ロ ピ ル 基 の 疎 水 性 や 嵩 高 さ が 活 性 発 現 に 必 要 で あ り 、 ク ロ ロ 基 の 電 子 求 引 効 果 は 特 に 活 性 に 良 い 影 響 を 与 え な い こ と を 示 唆 し て い る 。 ま た 、5 -イ ソ プ ロ ピ ル 誘 導 体 1 0 8 や 7 -イ ソ プ ロ ピ ル 誘 導 体 1 0 9 は 、 化 合 物 濃 度 を 1 0 0 M ま で 上 げ て も 阻 害 活 性 を 示 さ な か っ た こ と か ら 、 イ ソ プ ロ ピ ル 基 の 置 換 位 置 の 重 要 性 が 強 調 さ れ る 結 果 と な っ た 。

183 T a b l e 4-1 . 化 合 物 1 0 3, 1 0 5–1 0 9 の 構 造 活 性 相 関

compound R eIF4A3

IC

5 0

(  M)

^a

103 6-i Pr 27 (23 – 32)

105 6 - Me >100

106 6 - Et >100

107 6 - Cl >100

108 5- i Pr >100

109 7- i Pr >100

^a n = 2 , 9 5 % c o n f id e n c e in t e r v a l s s h o wn i n p a r e n t h e s e s .

次 に 、2 -位 カ ル ボ キ シ 基 の 変 換 を 試 み た ( Ta b l e 4 - 2 )。 エ ス テ ル 体 11 0 や カ ル ボ キ サ ミ ド 体

111 は 1 0 0 M ま で 化 合 物 濃 度 を 上 げ て も 阻 害 活 性 を 示 さ ず 、 一 方 で テ ト ラ ゾ ー ル 誘 導 体 1 1 2

は 、 カ ル ボ ン 酸 1 0 3 と 同 程 度 の 活 性 を 示 し た 。 こ れ ら の 結 果 か ら 、 阻 害 活 性 を 示 す た め に 酸 性 プ ロ ト ン が 重 要 で あ る こ と が 示 さ れ 、2 位 の 置 換 基 と タ ン パ ク 質 と の 間 に イ オ ン 結 合 が 形 成 さ れ て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。

ドキュメント内 RNA代謝に関与するタンパク質CDK12、Brr2およびeIF4A3を標的とした選択的阻害剤の発見 (ページ 124-188)