0.0056) Staurosporine 0.07

(0.041–0.12) 0.049

(0.034–0.072) 0.055

(0.036–0.083) 0.073 (0.047–0.11)

aそ れ ぞ れ の プ レ イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン 時 間 に 対 す るI C5 0 値 (M ) を 記 載 し た 。n = 4 , 9 5 % c o n f i d en c e i n t er v a l s s h o wn i n p a r en t h e s e s .

55

2 . 2 評 価 化 合 物 の 合 成

化 合 物 1 お よ び 5-1 1 の 合 成 を S c h e m e 2 - 1 に 示 し た 。 市 販 の4 -ア ミ ノ ピ ペ リ ジ ン 誘 導 体 3 1 を ス ル ホ ニ ル 化 、 鈴 木-宮 浦 カ ッ プ リ ン グ ( M i y a u r a a n d S u z u k i , 1 9 9 5 )、 お よ び 脱B o c化 に よ り 、 中 間 体 3 2 へ と 誘 導 し た 。 続 い て3 2のN-ア リ ー ル 化 に よ り 、 標 的 化 合 物 1, 5 お よ び 7

-1 -1 を 得 た 。 化 合 物 6 は 、1 のN-メ チ ル 化 に よ り 合 成 し た 。

S c h e m e 2 - 1 . 化 合 物 1 お よ び 5–1 1 の 合 成 ^a

a R e a g e n t s a n d c o n d i t i o n s : ( a ) ( i ) 4 - b r o m o b e n z e n e s u l f o n y l c h l o r i d e , E t3N , T H F , r t , 9 6 % ; ( i i ) 1 -m e t h y l - 4 - ( 4 , 4 , 5 , 5 - t e t r a -m e t h y l - 1 , 3 , 2 - d i o x a b o r o l a n - 2 - y l ) -1 H -p y r a z o l e , P d ( d p p f ) C l2·C H2C l2 , K2C O3 ,

D M F , H2O , 1 0 0 ° C , 8 3 % ; ( i i i ) H C l / M e O H , r t , 9 9 % . ; ( b ) 6 - f l u o r o n i c o t i n o n i t r i l e ( f o r 1) o r 2 -c h l o r o i s o n i -c o t i n o n i t r i l e ( f o r 7) o r 6 - c h l o r o - 2 - p y r i d i n e c a r b o n i t r i l e ( f o r 8) , D I P E A , N M P , 1 2 0 – 2 0 0 ° C , 5 – 7 3 % ; ( c ) 2 - b r o m o p y r i d i n e ( f o r 9) o r 2 - b r o m o - 5 - m e t h o x y p y r i d i n e ( f o r 1 0) o r 2 b r o m o -5 - ( t r i f l u o r o m e t h y l ) p y r i d i n e ( f o r 1 1) , P d2( d b a )3, D a v e p h o s , t e r t- B u O N a , t o l u e n e , 1 0 0 ° C , 7 – 2 9 % ; ( d ) 4 - f l u o r o b e n z o n i t r i l e , K2C O3, D M S O , 1 2 0 ° C , 9 % ; ( e ) M e I , N a H , T H F , D M F , 0 ° C t o r t , 8 5 % .

化 合 物 1 2 お よ び 1 3の 合 成 をS c h e m e 2 - 2 に 示 し た 。 市 販 の 原 料 3 3 を 6 -ク ロ ロ ニ コ チ ノ ニ ト リ ル と カ ッ プ リ ン グ し 、B o c 基 を 除 去 し て 中 間 体 3 4 を 得 た 。3 4 を4 -ブ ロ モ ベ ン ゾ イ ル ク ロ リ ド を 用 い て ア シ ル 化 し 、 続 く 鈴 木-宮 浦 カ ッ プ リ ン グ に よ り 化 合 物 1 2 を 得 た 。 ま た 、

3 4 を4 -ブ ロ モ ベ ン ジ ル ブ ロ ミ ド を 用 い て ア ル キ ル 化 し 、 先 ほ ど と 同 様 の 条 件 の 鈴 木-宮 浦 カ

ッ プ リ ン グ に よ り 化 合 物 1 3 を 得 た 。

56 S c h e m e 2 - 2 . 化 合 物 1 2 お よ び 1 3 の 合 成 ^a

a R e a g e n t s a n d c o n d i t i o n s : ( a ) ( i ) 6 - c h l o r o n i c o t i n o n i t r i l e, D I P E A , D M F , 1 2 0 ° C , 6 6 % ; ( i i ) H C l / E t O A c , E t O H , r t , 9 8 % ; ( b ) 4 b r o m o b e n z o y l c h l o r i d e , D I P E A , T H F , r t , 8 9 % ; ( c ) 1 m e t h y l 4 -( 4 , 4 , 5 , 5 - t e t r a m e t h y l - 1 , 3 , 2 - d i o x a b o r o l a n - 2 - y l ) -1 H -p y r a z o l e , P d C l2( A m p h o s )2 ( G u r a m e t a l. , 2 0 0 6 ) , C s2C O3, D M F , 1 0 0 ° C ( m i c r o w a v e ) , 6 1 – 8 2 % ; ( d ) 4 - b r o m o b e n z y l b r o m i d e , K2C O3, D M F , 8 0 ° C , 9 6 % .

化 合 物 1 4-2 5 は 、S c h e m e 2 - 3 に 示 し た 方 法 で 合 成 し た 。 市 販 の t r a n s- 1 , 4 -シ ク ロ ヘ キ サ ン ジ ア ミ ン 誘 導 体 3 5 をB u c h w a l d - H a r t w i g カ ッ プ リ ン グ ( R u i z - C a s t i l l o a n d B u c h w a l d ,

2 0 1 6 ) お よ び 鈴 木-宮 浦 カ ッ プ リ ン グ に よ り 中 間 体 3 7 へ と 誘 導 し た 。 中 間 体 3 7 の ア リ ー ル

ア ミ ノ 基 の ア シ ル 化 、 メ チ ル ス ル ホ ニ ル 化 、 ア ル コ キ シ カ ル ボ ニ ル 化 、 も し く は ア ル キ ル ア ミ ノ カ ル ボ ニ ル 化 、 続 くB o c基 の 除 去 、2 -ハ ロ ピ リ ジ ン 誘 導 体 も し く は 2 -ク ロ ロ キ ナ ゾ リ ン と の カ ッ プ リ ン グ に よ り 化 合 物 1 4, 1 6, 1 8-2 4 を 得 た 。 化 合 物 1 7 は 、 中 間 体 3 7 のB o c基 の 除 去 、 続 く6 -フ ル オ ロ ニ コ チ ノ ニ ト リ ル と カ ッ プ リ ン グ 反 応 に よ り 合 成 し た 。C i s 異 性 体 1 5 お よ び 2 5 は 、 市 販 の 中 間 体 3 8 を 用 い て 、1 4 お よ び 2 3 の 合 成 と 類 似 の 方 法 に よ り 合 成 し た 。

57 S c h e m e 2 - 3 . 化 合 物 1 4–2 5 の 合 成 ^a

aR e a g e n t s a n d c o n d i t i o n s : ( a ) 1 - b r o m o - 4 - i o d o b e n z e n e , t e r t- B u O N a , P d2( d b a )3, X a n t p h o s , t o l u e n e , 8 0 ° C , 2 6 – 4 5 % ; ( b ) 1 - m e t h y l - 4 - ( 4 , 4 , 5 , 5 - t e t r a m e t h y l - 1 , 3 , 2 - d i o x a b o r o l a n - 2 - y l ) -1 H -p y r a z o l e , C s2C O3, P d C l2( A m p h o s )2, D M F , H2O , 1 0 0 ° C , 8 4 – 9 6 % ; ( c ) a c e t y l c h l o r i d e ( f o r 1 4, 1 8, a n d 1 5) o r p h e n y l p r o p i o n y l c h l o r i d e ( f o r 2 1) , D I P E A , T H F, 0 ° C , 7 9 – 8 9 % ; ( d ) m e t h a n e s u l f o n y l c h l o r i d e , p y r i d i n e , r t , 8 1 % ; ( e ) m e t h y l c h l o r o f o r m a t e ( f o r 1 9) o r b e n z y l c h l o r o f o r m a t e ( f o r 2 2) , D I P E A , C H2C l2, r t , 6 2 – 8 5 % ; ( f ) e t h y l i s o c y a n a t e , T H F , r t , 5 3 % ; ( g ) b e n z y l i s o c y a n a t e ( f o r 2 3 a n d 2 5) o r c y c l o h e x y l m e t h y l i s o c y a n a t e ( f o r 2 4) , T H F , r t , 6 8 – 9 0 % ; ( h ) ( i ) T F A , r t ( i i ) 6 c h l o r o n i c o t i n o n i t r i l e , D I P E A , D M F , 1 2 0 ° C , 1 9 – 2 3 % ; ( i ) ( i ) H C l / E t O A c , r t ( i i ) 6 -f l u o r o n i c o t i n o n i t r i l e , D I P E A , N M P , 8 0 – 1 0 0 ° C , 3 3 – 8 2 % ; ( j ) ( i ) H C l / d i o x a n e , C H2C l2, r t ( i i ) 6 -b r o m o n i c o t i n o n i t r i l e , C s2C O3, D M F , r t , 1 5 % ; ( k ) ( i ) T F A , r t ( i i ) 2 - c h l o r o q u i n a z o l i n e , D B U , D M F , 1 2 0 ° C , 3 7 % .

化 合 物 2 お よ び 2 6–3 0 は 、S c h e m e 2 - 4 に 示 し た 方 法 で 合 成 し た 。 中 間 体 3 6 を ベ ン ジ ル ウ レ ア 4 0 に 変 換 し 、 続 い て ブ ロ モ 基 を 還 元 し て 化 合 物 4 1 を 得 た 。 化 合 物 4 2 は 、4 0 と 3 -ピ リ ジ ニ ル ボ ロ ン 酸 と の 鈴 木-宮 浦 カ ッ プ リ ン グ 反 応 に よ り 合 成 し た 。 化 合 物 4 0–4 2 の B o c 基 を 除 去 し 、6 -フ ル オ ロ ニ コ チ ノ ニ ト リ ル と カ ッ プ リ ン グ し て 、 ア ミ ノ ピ リ ジ ン 誘 導 体 2 6, 2 7 お よ び 4 3 を 得 た 。 ブ ロ マ イ ド 4 3 と ボ レ ー ト 4 4 も し く は 4 5 の 鈴 木-宮 浦 カ ッ プ リ ン グ に よ り 化 合 物 2 お よ び 2 8 を 得 た 。 ま た 、4 3 を 宮 浦 ホ ウ 素 化 反 応 ( I s h i y a m a a n d M i y a u r a ,

58

2 0 0 4 ) を 用 い て ボ レ ー ト 4 7 に 変 換 し 、6 - も し く は 4 -ブ ロ モ- 1 -メ チ ル ピ リ ジ ン- 2 ( 1H) -オ ン と の 鈴 木-宮 浦 カ ッ プ リ ン グ に よ り 化 合 物 2 9 お よ び 3 0 を 得 た 。

S c h e m e 2 - 4 . 化 合 物 2 お よ び 2 6–3 0の 合 成 ^a

a R e a g e n t s a n d c o n d i t i o n s : ( a ) b e n z y l i s o c y a n a t e , E t3N , T H F , r t , 9 3 % ; ( b ) H2, P d / C , E t3N , E t O H , T H F, r t , q u a n t . ; ( c ) 3 - p y r i d i n y l b o r o n i c a c i d , C s2C O3, P d C l2( A m p h o s )2, D M F , H2O , 1 0 0 ° C , 9 5 % ; ( d ) ( i ) H C l / E t O A c , T H F , r t ( i i ) 6 - f l u o r o n i c o t i n o n i t r i l e , D I P E A , N M P , 1 0 0 ° C , 5 3

–

8 0 % ; ( e ) 4 4 ( f o r 2) , 4 5 ( f o r 2 8) , A c O K , P d ( d p p f ) C l2·C H2C l2, N M P , 8 0 – 1 0 0 ° C , 3 5 – 6 9 % ; ( f ) 4 6, A c O K , P d ( d p p f ) C l2, D M S O , 8 0 ° C , 8 8 % ; ( g ) 6 - b r o m o - 1 - m e t h y l p y r i d i n - 2 ( 1H) - o n e ( f o r 2 9) o r 4 b r o m o 1 -m e t h y l p y r i d i n - 2 ( 1H) - o n e ( f o r 3 0) , C s2C O3, P d C l2( A m p h o s )2, D M F , H2O , 8 0 ° C , 4 4–4 8% .

59 2 . 3 結 論

筆 者 は 、H T S に よ り 見 出 さ れ た ア ミ ノ ピ リ ジ ン 誘 導 体 1 を 起 点 と し 、 タ ン パ ク 質 の 結 晶 構 造 情 報 や 低 分 子 X線 結 晶 構 造 の ビ ッ グ デ ー タ で あ る C a m b r i d g e s t r u c t u r a l d a t a b a s e の 配 座 情 報 を 活 用 し 、 新 規 構 造 を 持 つ 選 択 的 C D K 1 2 ( / 1 3 ) 阻 害 剤 2 を 見 出 し た 。 化 合 物 2 は 、1 0^{- 8}M オ ー ダ ー の C D K 1 2 (お よ び ホ モ ロ グ で あ る C D K 1 3 ) 阻 害 活 性 と 転 写 制 御 C D K に 対 す る 高 い 選 択 性 を 示 し 、 物 性 面 で も 優 れ て い た 。 さ ら に 、 化 合 物 2 は 高 い キ ノ ー ム ワ イ ド な 選 択 性 を 示 し 、S K - B R - 3 細 胞 に お い て C T D の S e r 2 の リ ン 酸 化 の 阻 害 、 お よ び 同 細 胞 の 増 殖 阻 害 活 性 を 示 し た 。 筆 者 が 発 見 し た 化 合 物 2 お よ び ネ ガ テ ィ ブ コ ン ト ロ ー ル 2 5 は 、C D K 1 2 の ス プ ラ イ シ ン グ 、R N A プ ロ セ ッ シ ン グ 、 お よ び そ の 他 の 生 物 学 的 役 割 に お け る 機 能 を 解 明 す る た め の 分 子 プ ロ ー ブ と な り 得 る 。 加 え て 、 化 合 物 2 は C D K 1 2 を 標 的 と し た 新 た な 化 学 療 法 薬 の 研 究 ・ 開 発 を 行 う た め の 基 盤 と な る ( O n o e t a l. , 2 0 1 9)。

60 2 . 4 実 験 の 部

B i o l o g y

R e a g e n t s . Hu m a n G S T - t ag g e d C D K 2 / C C N A 2 ( 0 4 - 1 0 3 ) , G S T - t a g g ed C D K 7 / C y c H / M A T 1 ( 0 4 - 1 0 8 ) , G S T - t ag g e d C D K 8 / C y c C ( 0 4 - 1 0 9 ) , a n d G S T - t a g g e d C D K 9 / C y c T 1 ( 0 4 - 1 1 0 ) w e r e o b t a i n e d f r o m C a r n a B i o s c i e n c e s ( Ko b e , J a p an ) . L A N C E d e t e c t io n b u f f er , U L ig h t 4 E -B P 1 ( T h r 3 7 / T h r 4 6 ) s u b s t r a t e p ep t i d e , a n d E u - l a b e l e d a n t i - p h o s p h o - eI F 4 E - b i n d i n g p r o t e i n 1 ( T h r 3 7 /4 6 ) a n t i b o d y w e r e p u r c h a s e d f r o m P e r k i n E l m er ( W a l t h a m , M A ) .

P r e p a ra t i o n o f h u m a n f u l l - l e n g t h C D K 1 2 . H u m a n f u l l l e n g th C D K 1 2 w a s p r e p a r e d i n -h o u s e b y a b a c u lo v i r u s e x p r e s s i o n s y s t e m . H u m a n C D K 1 2 ( r e s i d u e s 1–1 4 9 0 a a , f u l l , G e n b a n k A c c e s s i o n N o . N M _ 0 1 6 5 0 7 ) w a s c o - e x p r e s s e d w i t h h u m an C y c K ( r e s i d u e s 1–5 8 0 a a , f u l l , G e n b a n k A c c e s s i o n N o . N M_ 0 0 1 0 9 9 4 0 2 ) i n S f 9 c e l l s b y u s i n g a b a c u lo v i r u s e x p r e s s i o n s y s t e m . C D K 1 2 an d C y c K w e r e e x p r e s s e d a s a f u s i o n p r o t e i n w i t h a F L A G - t a g a n d a H i s - t a g a t t h e N - t er m i n u s , r e s p e c t i v e ly . S f 9 c e l l s w e r e c u l t u r e d a t 2 7 ° C f o r 7 2 h p o s t in f e c t io n . T h e c e l l s w e r e h ar v e s t e d b y c e n tr i f u g a t i o n a n d s t o r ed a t − 8 0 ° C u n t i l u s e . T h e f r o ze n S f 9 c e l l s e x p r e s s i n g F L A G - t a g g ed h C D K 1 2 a n d H i s - t ag g e d h C y c K w e r e s u s p e n d e d i n l y s i s b u f f e r ( 5 0 m M T r i s ( p H 8 .0 ) , 3 0 0 m M N a C l , 1 0 % ( v /v ) g l y c er o l , 0 .0 5 % B r i j - 3 5 , 1 m M d i t h i o th r e i to l ( D T T ) , 5 U / m L b e n z o n a s e ) a n d c e n t r if u g ed a t 1 4 ,0 0 0 × g f o r 3 0 m in . T h e s u p er n a t a n t w a s m i x ed w i t h ) 1 0 m L p r e - eq u i l i b r a t e d F L A G r e s i n ( M B L ) f o r 2 h w i t h r o t a t in g a t 4 ° C . T h e F L A G r e s i n w a s w a s h ed w i t h a f f in i t y b u f f er ( 5 0 m M T r i s ( p H 8 . 0 ) , 3 0 0 m M N a C l , 1 0 % ( v / v ) g l y c e r o l , 0 . 0 5 % B r i j 3 5 , 1 m M D T T ) a n d e l u t ed w i t h 0 . 2 m g / m L F L A G p e p t i d e i n a f f in i t y b u f f e r . T h e e lu a t e w a s l o a d e d o n t o a H i L o a d 2 6 / 6 0 S u p e r d ex 2 0 0 p g co l u m n ( G E H e a l t h c a r e) u s i n g S D X b u f f er ( 5 0 m M T r i s ( p H 8 . 0 ) , 1 5 0 m M N a C l , 1 0 % ( v / v ) g ly c e r o l, 0 .0 5 % B r i j 3 5 , 1 m M D T T ) . T h e p u r i f i e d F L A G - t ag g e d h C D K 1 2 / H i s - t a g g e d h C y c K c o m p l e x w a s c o n c e n tr a t e d w i t h A m i c o n U l t r a 1 5 [ M W C O : 1 0 0 k ] ( M e r ck M i l l i p o r e ) . P r o t e i n co n c en t r a t i o n w a s d e t e r m i n ed b y u s i n g C o o m a s s i e P l u s ( B r ad f o r d ) A s s a y R e a g e n t ( T h er m o S c i e n t i f i c ) w i t h b o v i n e s e r u m a l b u m i n a s t h e s t a n d a r d .

P r e p a ra t i o n o f h u m a n f u l l - l e n g t h C D K 1 3 . H u m a n f u l l l e n g th C D K 1 3 w a s p r e p a r e d i n -h o u s e w i t -h a b a cu l o v i r u s e x p r e s s i o n s y s t e m . H u m a n C D K 1 3 ( r e s i d u e s 1–1 5 1 2 aa , f u l l , G e n b a n k A c c e s s i o n N o . N M _ 0 0 3 7 1 8 ) w a s c o - e x p r e s s e d w i t h h u m an C y c K ( r e s i d u e s 1–5 8 0

61

a a , f u l l , G e n b a n k A c c e s s i o n N o . N M _ 0 0 1 0 9 9 4 0 2 ) in S f 9 c e l l s b y u s i n g b a c u l o v i r u s e x p r e s s i o n s y s t e m . C D K 1 3 an d C y c K w e r e e x p r e s s e d a s a f u s i o n p r o t e i n w i t h a F L A G - t a g a n d a H i s - t a g a t t h e N - t er m i n u s , r e s p e c t i v e l y . T h e m e t h o d s f o r t h e p r o d u c t io n an d p u r i f i c a t i o n w e r e t h e s a m e a s d e s c r i b ed f o r F L A G - t ag g e d h C D K 1 2 a n d H i s - t a g g e d h C y c K p r o t e i n s .

H um a n C D K 9 , C D K 1 2 , a n d C D K 1 3 e n z y m e i n h i b i t i o n a s s a y u s i n g t h e L A N C E s y s t e m . T h e i n h i b i t o r y a c t i v i t y o f t h e t e s t c o m p o u n d s w a s a s s e s s e d b y t h e L A N C E U l t r a a s s a y , w h i ch d e t e c t s t h e A T P - d e p en d e n t p h o s p h o r y l a t i o n o f a n U L i g h t - 4 E - B P 1 ( T h r 3 7 / T h r 4 6 ) s u b s t r a t e p e p t id e ( 1 5 0 n M ) . B r i e f l y , t h e e n zy m e r e a c t i o n w a s r u n in r e a c t i o n b u f f e r ( 2 5 m M H E P E S ( p H 7 . 5 ) , 1 0 m M M g C l2, 0 .0 1 % B S A , 0 .0 1 % T w e e n 2 0 , 1 m M D T T ) . T h e a s s a y w a s p e r f o r m e d i n 3 8 4 - w e l l p l a t e ( 6 µ L ) f o r m a t . T h e e n d c o n c e n tr a t i o n o f t h e A T P s u b s t r a t e w a s 1 0 µ M , a n d t h a t o f t h e U L ig h t - 4 E - B P 1 ( T h r 3 7 / T h r 4 6 ) s u b s t r a t e p ep t i d e w a s 1 5 0 n M . T h e e n d c o n c e n tr a t i o n o f C D K 9 , C D K 1 2 o r C D K 1 3 w a s 0 . 3 n M , 3 0 n M , o r 3 0 n M , r e s p e c t iv e l y . P r e - i n cu b a t i o n o f th e co m p o u n d s an d e n z y m e w a s p e r f o r m e d f o r 6 0 m i n a t r o o m t e m p e r a t u r e . A f t e r 1 5 , 6 0 , o r 9 0 m i n i n cu b a t i o n a t r o o m t e m p er a t u r e, t h e r e a c t io n w a s t e r m i n a t ed b y t h e a d d i t i o n o f 1 0 m M E D T A an d 0 . 1 5 n M E u l a b e l ed a n t i p h o s p h o -e I F 4 E - b in d i n g p r o t -e in 1 ( T h r 3 7 / 4 6 ) an t i b o d y i n L A N C E d -e t -e c t io n b u f f -e r . T i m -e - r -e s o l v -e d f lu o r e s c e n c e ( e x c i t a t i o n , 3 2 0 n m ; e m i s s i o n d o n o r , 6 1 5 n m ; e m i s s i o n a c c e p t o r , 6 6 5 n m ) w a s m o n i t o r e d b y u s i n g a n E n V i s i o n s p e c t r o p h o t o m e r ( P e r k i n E l m e r ) . T h e r e ad o u t w a s c a l c u l a t ed a s ( a c c ep t o r co u n t s / d o n o r c o u n t s ) × 1 0 0 0 . T h e I C5 0 v a l u e s w e r e d e r i v ed b y f i t t i n g a s i g m o i d a l d o s e - r e s p o n s e c u r v e t o a p l o t o f a s s a y r e a d o u t o v e r i n h ib i t o r c o n c e n tr a t i o n . A l l f i t s w e r e co m p u t e d w i t h t h e p r o g r a m P r i s m 5 .0 3 ( G r ap h P a d S o f t w a r e , S a n D i eg o , C A ) .

H um a n C D K 7 a n d C D K 8 b i n d i n g a s s a y u s i n g a K i n a s e T r a c e r . T h e in h i b i t o r y ac t i v i t y o f t e s t c o m p o u n d s w a s a s s e s s e d b y u s i n g a b i n d in g a s s a y i n w h i ch K i n a s e T r a c e r 2 3 6 ( an A T P co m p e t i t i v e i n h i b i t o r ) w a s u s e d a s a p r o b e a g a in s t G S T - t a g g e d C D K 7 o r G S T - t a g g ed C D K 8 . T h e b o u n d to t h e C D K 7 o r C D K 8 w a s d e t e c t e d b y t i m e - r e s o l v ed f l u o r e s c e n c e r e s o n a n c e en e r g y t r a n s f er ( T R - F R E T ) b e t w e e n a E u r o p i u m - l ab e l l e d a n t ib o d y a n d K i n a s e T r a c e r 2 3 6 ; th e d i s p l a c e m en t o f t h e p r o b e w a s d e t e c t ed b y a d e c r e a s e i n t h e F R E T s i g n a l .

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B r i e f l y , t h e en z y m e r e a c t i o n w a s p e r f o r m e d i n r e a c t i o n b u f f e r ( 2 5 m M H E P E S ( p H 7 .5 ) , 1 0 m M M g C l2, 0 .0 1 % B S A , 0 .0 1 % T w e e n 2 0 , 2 m M D T T ) . T h e a s s a y w a s p e r f o r m e d i n a 3 8 4 - w e l l p l a t e ( 6 µ L ) f o r m a t . T w o m i c r o l i t e r s o f d i f f er e n t co n c e n tr a t i o n s o f t h e t e s t c o m p o u n d s w e r e a d d e d t o th e p l a t e , a f t e r w h i c h 2 µ L o f t h e an t i b o d y / k i n a s e t r a ce r 2 3 6 m ix ( 8 0 0 - f o l d d i l u t e d E u r o p iu m - l ab e l l e d a n t i - G S T an t i b o d y / k in a s e t r a c e r 2 3 6 ) w a s ad d e d . A K i n a s e T r a c er 2 3 6 c o n c e n tr a t i o n o f 3 0 n M o r 2 0 n M w a s u s e d f o r C D K 7 o r C D K 8 , r e s p e c t iv e l y . A f t e r t h e p l a t e w a s i n cu b a t ed a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 5 m i n , 2 µ L o f 0 . 5 n M C D K 7 o r 0 .2 n M C D K 8 i n r e a c t io n b u f f e r w a s ad d ed , a n d t h e i n cu b a t io n w a s c o n t i n u ed f o r a f u r t h er 6 0 m i n b e f o r e t h e p l a t e w a s m e a s u r e d a n d ev a l u a t e d . T i m e - r e s o l v ed f lu o r e s c e n c e w a s m o n i t o r e d a s i n t h e s e c t i o n “H u m a n C D K 1 2 , C D K 1 3 a n d C D K 9 en z y m e i n h i b i t i o n a s s a y b y u s i n g t h e L A N C E s y s t e m”. T h e b in d i n g d i s p l a c e m en t c u r v e s w e r e f i t t e d t o a v a r i ab l e - s l o p e s i g m o i d a l d o s e - r e s p o n s e c u r v e b y u s i n g G r a p h P a d P r i s m .

H um a n C D K 2 / C C N A 2 e n z y m e i n h i b i t i o n w i t h r a d i o m e t r i c a s s a y . T h e a s s a y s f o r C D K 2 / C C N A 2 u s i n g r a d io l a b e l e d [ γ-^{3 3}P ] A T P ( G E H e a l t h c a r e, P i s c a t a w a y , N J ) w er e p er f o r m e d i n 9 6 - w e l l p l a t e s . T h e en z y m e r e a c t i o n w a s r u n in r e a c t i o n b u f f er ( 2 5 m M H E P E S , p H 7 . 5 , w i t h 1 0 m M m a g n e s i u m ac e t a t e , 1 m M D T T ) in a t o t a l v o lu m e o f 5 0 μL . T h e f i n a l co n c en t r a t i o n s o f s u b s t r a t e H i s t o n e H 1 a n d A T P w a s 1 μ g / w e l l a n d 5 0 0 n M , r e s p e c t iv e l y . T h e f i n a l co n c en t r a t i o n o f C D K 2 / C C N A 2 w a s 1 . 8 m U / w e l l . P r i o r t o th e k in a s e r e a c t i o n , t h e co m p o u n d an d en z y m e w e r e in c u b a t e d f o r 5 m i n a t r o o m t em p e r a tu r e . T h e k i n a s e r e a c t i o n s w e r e i n i t i a t e d b y t h e a d d i t i o n o f A T P . A f t er i n c u b a t i o n f o r 2 0 m in a t r o o m t e m p e r a t u r e , t h e r e a c t i o n w a s t e r m in a t e d b y t h e a d d i t io n o f 1 0 % t r i ch l o r o a c e t i c a c i d ( f i n a l c o n c e n t r a t io n ) . T h e [ γ-^{3 3}P ] - p h o s p h o r y l a t e d p r o t e i n s w e r e f i l t e r e d in a H a r v e s t P l a t e ( M i l l i p o r e C o r p . ) w i t h a C e l l H a rv e s t e r ( P e r k in E l m e r ) a n d t h en f r e e [ γ-^{3 3}P ] A T P w a s w a s h e d o u t w i t h 3 % p h o s p h o r i c a c i d . T h e p l a t e s w e r e d r i e d an d 4 0 μL o f M i c r o S c i n t0 ( P e r k i n E l m er ) w a s a d d ed . T h e r a d io a c t i v i t y w a s c o u n t e d b y a T o p C o u n t s c i n t i l l a t i o n c o u n t e r ( P e r k in E l m e r ) .

C e l l u l a r H T R F C T D p S e r 2 d e t e c t i o n a s s a y i n h u m a n b r e a s t c a n c e r S K - B R - 3 c e l l s . H u m a n b r e a s t c a n c er S K - B R - 3 c e l l s w e r e m a i n t a in e d i n R P M I 1 6 4 0 s u p p l em e n t e d w i th 1 0 % f e t a l b o v i n e s e r u m ( F B S ) a t 3 7 ° C i n a h u m i d i f i ed 5 % C O2 i n c u b a t o r . A l l r e a g en t s

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w e r e s u p p l i e d in t h e H T R F P h o s p h o - R N A P o l I I ( S e r 2 ) A s s a y S y s t e m ( 6 3 A D K 0 0 0 U , C i s B i o ) . T h e c e l l s w e r e i n o c u l a t e d i n a 9 6 - w e l l p l a t e ( C o s t e r 3 5 8 5 ) ( 1 0 0 , 0 0 0 c e l l s p e r w e l l ; 1 0 0 µ L p er w e l l ) o r a 3 8 4 - w e l l p o l y - D - l y s i n e C e l l w a r e p l a t e ( B D 3 5 6 6 4 0 ) ( 5 , 0 0 0 c e l l s p er w e l l ; 2 0 µ L p e r w e l l ) a n d i n c u b a t ed a t 3 7 ° C i n a h u m i d i f i e d 5 % C O2 i n c u b a t o r . C e l l s w e r e t r e a t e d w i t h co m p o u n d p er w e l l a t 3 7 ° C f o r 4 h i n a h u m i d i f i ed 5 % C O2

i n cu b a t o r . T h e c e l l s w e r e w a s h ed w i t h P B S ( - ) an d w e r e l y s e d w i t h 5 0 µ L o r 2 5 µ L o f d i lu t e d 4 - f o ld l y s i s b u f f e r c o n t a i n e d in t h e P h o s p h o - R N A P o l I I ( S e r 2 ) A s s a y S y s t e m . L y s i s w a s c o n d u c t e d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 1 0 m in w i t h g e n t l e s h a k in g . T h e c e l l l y s a t e w a s t r an s f e r r ed to a 3 8 4 - w e l l p l a t e ( 1 6 µL p e r w e l l ; G r e i n e r 7 8 4 0 7 5 ) . A 5 0 - f o l d d i lu t i o n o f an t i b o d y d e t e c t i o n b u f f er ( e a c h 2 µ L ) w a s ad d e d t o t h e l y s e d c e l l s . T h e p l a t e w a s i n cu b a t ed o v e r n ig h t a t r o o m t e m p e r a tu r e . T h e p l a t e s w er e an a l y z e d o n an E n V i s i o n ( ex c i t a t i o n , 3 2 0 n m ; e m i s s i o n d o n o r , 6 1 5 n m ; e m i s s i o n a c c ep t o r , 6 6 5 n m ) . T h e i n h i b i t i o n r a t e w a s c a l c u l a t ed b a s e d o n 0 % c o n tr o l w e l l s ( D M S O - t r e a t e d c e l l l y s a t e s ) a n d 1 0 0 % c o n t r o l w e l l s ( l y s i s b u f f e r ) . T h e d a t a a n a l y s i s w a s p e r f o r m e d w i t h Gr a p h P ad P r i s m s t a t i s t i c a l a n a l y s i s s o f t w a r e u s i n g a n o n l i n e a r r e g r e s s i o n e q u a t i o n f o r a s i g m o i d a l d o s e -r e s p o n s e w i t h a v a -r i ab l e s l o p e .

C e l l v ia b i l i t y a s s a y i n h u m a n b r e a s t ca n c e r S K - B R - 3 c e l l s . T h e S K - B R - 3 h u m an b r e a s t c an c e r c e l l l i n e s w e r e m a in t a i n e d in R P M I 1 6 4 0 ( T h e r m o F i s h e r S c i e n t i f i c, W a l t h a m , M A ) . T h e c e l l s w e r e p u r c h a s e d f r o m Am e r i c a n T y p e C u l t u r e C o l l e c t i o n ( M a n a s s a s , V A ) . T h e m ed i a w e r e s u p p l e m e n t e d w i t h 1 0 % F B S ( J R H ) , p en i c i l l i n ( 1 0 , 0 0 0 U / m L ; T h er m o F i s h e r S c i e n t i f i c ) , a n d s t r e p t o m y c i n ( 1 0 ,0 0 0 μ g / m L ; T h e r m o F i s h e r S c i e n t i f i c ) . T h e c e l l s w e r e s e e d ed an d s u b cu l t u r ed i n 1 0 0 - m m d i a m e t e r d i s h e s ev e r y 3 d a y s . T h e c e l l s ( 3 × 1 0³) w e r e s e e d ed i n to 9 6 -w e l l p l a t e s an d i n c u b a t e d o v er n i g h t i n 5 0 μ L o f c u l t u r e m ed i u m . S u b s eq u e n t ly , 5 0 µ L o f e a ch c o m p o u n d d i l u t e d in t h e cu l t u r e m ed i u m w a s a d d e d to t h e w e l l s . A f t e r i n c u b a t i o n f o r 7 2 h , v i a b i l i t y w a s d e t e r m in e d b y u s i n g t h e C e l l T i t e r - G l o L u m i n e s c e n t C e l l V i a b i l i t y A s s a y ( P r o m e g a , M ad i s o n , W I ) i n a c co r d a n c e w i t h t h e m an u f a c tu r e r ’ s i n s t r u c t i o n s . T h e G I5 0 v a l u e s w e r e c a l cu l a t e d b y u s i n g G r a p h P a d P r i s m 5 s o f t w a r e w i t h a s i g m o i d a l d o s e - r e s p o n s e cu r v e .

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E v a l u a t i o n o f t i m e - d e p e n d e n t i n h i b i t i o n o f h u m a n C D K 1 2 u s i n g t h e L A N C E s y s t e m . V a r io u s c o n c en t r a t i o n s o f in h i b i t o r s i n D M S O ( 5 0 n L ) w e r e d i s p e n s e d i n t h e a s s a y p l a t e ( p r o d u c t # 7 8 4 0 7 5 , G r e i n er B i o - O n e ) u s i n g a n A c c e s s E c h o 5 5 5 l i q u i d h a n d l er ( L ab s i t e ) . T h e en z y m a t i c r e a c t io n w a s p er f o r m e d i n r e a c t i o n b u f f e r ( 2 5 m M H E P E S ( p H 7 .5 ) , 1 0 m M M g C l2, 0 . 0 1 % T w e en 2 0 , 1 m M D T T ) . T o ev a l u a t e e f f e c t o f p r e in c u b a t i o n w i t h i n h i b i t o r s o n C D K 1 2 i n h i b i t o r y a c t i v i t y , 2 . 5 μ L o f 6 0 n M C D K 1 2 p r o t e i n w a s d i s p en s e d in t o e a c h w e l l a n d i n c u b a t e d f o r v ar i o u s p er i o d s o f t i m e a t r o o m t em p e r a tu r e . S u b s e q u en t l y , t h e e n z y m a t i c r e a c t i o n w a s i n i t ia t e d b y t h e a d d i t i o n o f 2 . 5 μ L s u b s t r a t e p r e m i x ( 2 0 μ M A T P a n d 3 0 0 n M U L ig h t - 4 E - B P 1 ( T h r 3 7 / T h r 4 6 ) ) , a n d th e p l a t e w a s i n c u b a t e d f o r 6 0 m in a t r o o m t e m p e r a t u r e . F o r t h e ev a l u a t i o n o f C D K 1 2 i n h i b i to r y a c t i v i ty o f i n h i b i to r s w i t h o u t p r e i n c u b a t i o n , 2 . 5 μ L o f su b s t r a t e m ix t u r e w a s ad d ed t o t h e p l a t e , f o l lo w e d b y th e a d d i t i o n o f 2 .5 μ L o f 6 0 n M C D K 1 2 p r o t e i n an d i n cu b a t i o n f o r 6 0 m i n a t r o o m t e m p e r a t u r e . T h e f in a l c o n c e n tr a t i o n s o f C D K 1 2 , A T P , a n d p e p t id e w e r e 3 0 n M , 1 0 μ M , a n d 1 5 0 n M, r e s p e c t i v e l y . T h e en z y m a t i c r e a c t i o n w a s t e r m i n a t e d b y t h e ad d i t i o n o f 5 μ L L A N C E d e t e c t i o n b u f f e r ( 2 0 m M E D T A ( f i n a l 1 0 m M ) an d 0 .3 0 n M E u l a b e l e d a n t i -p h o s -p h o - eI F 4 E - b in d i n g -p r o t e i n 1 ( T h r 3 7 /4 6 ) a n t ib o d y ( f in a l 0 . 1 5 n M ) ) . T h e -p l a t e w a s i n cu b a t ed f o r 6 0 m in a t r o o m t e m p e r a t u r e an d t h e t i m e - r e s o l v e d f l u o r e s c e n c e w a s m o n i t o r e d b y u s i n g an E n V i s i o n p l a t e r e ad e r . T h e s o l u t i o n in e a c h w e l l w a s e x c i t e d w i t h a l a s e r ( λ = 3 3 7 n m ) r e f l e c t ed b y a d i c h r o i c m i r r o r ( D 4 0 0 / D 6 3 0 ( P e r k i n E l m er ) ) , an d t h e f lu o r e s c e n c e s i g n a l s f r o m E u an d U L i g h t w e r e d e t e c t ed b y u s i n g t w o e m i s s i o n f i l t e r s ( C y 5 6 2 0 ( P e r k in E l m e r ) f o r E u a n d A P C 6 6 5 ( P e r k i n E l m er ) f o r U L i g h t ) . T h e v a l u e s f o r t h e 0 % a n d 1 0 0 % c o n t r o l s w e r e t h e s i g n a l s o b t a i n e d in t h e p r e s e n ce a n d ab s e n c e o f C D K 1 2 p r o t e in , r e s p e c t i v e ly . T h e i n h i b i t i o n a t e a c h i n h i b i to r co n c en t r a t i o n w a s d e t er m i n ed i n q u a d r u p l i c a t e . T h e I C5 0 v a l u e s w e r e d e r iv e d f r o m t h e f i t t i n g a s i g m o id a l d o s e - r e s p o n s e c u r v e t o a p l o t o f t h e a s s a y r e a d o u t o v e r t h e i n h i b i t o r c o n c en t r a t i o n . A l l f i t s w e r e c o m p u t e d b y G r ap h P a d P r i s m .

C r y s t a l l o g ra p h y

P ro t e i n e x p r e s s i o n a n d p u r i f i c a t i o n f o r c ry s t a l l o g r a p h y . T h e c D N A s e n co d i n g h u m a n C D K 1 2 an d C y c K ( e n co m p a s s i n g r e s i d u e s 7 1 4–1 0 6 3 a n d 1–2 6 7 , r e s p e c t iv e l y ) w er e

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a m p l i f i e d b y t h e p o l y m e r a s e c h a in r e a c t i o n a n d s u b c lo n ed in t o th e p l a s m i d p F a s t B a c D u a l ( I n v i t r o g en ) . T h e C D K 1 2 co d i n g s e q u e n c e w a s in s e r t e d af t e r t h e p o ly h e d r o n p r o m o t e r ( P p H) , w h e r ea s C y c K w a s p l a c e d b e h in d t h e p 1 0 p r o m o t e r ( P p 1 0 ) . T o e n ab l e t h e p u r i f i c a t i o n o f t h e co m p l e x , th e c o d i n g s e q u en c e s w e r e e a ch e n g i n e er e d w i t h an N -t e r m in a l G lu -t a -t h i o n e - S - -t r an s f e r a s e ( G S T ) a f f i n i -t y -t a g -t h a -t i n c l u d e s a r e co g n i -t i o n s e q u e n c e f o r th e T E V p r o t e a s e f o r c l e a v ag e an d r em o v a l o f G S T f u s i o n p a r t n e r p r o t e i n . I n a d d i t i o n , t h e c D N A en c o d i n g S . c e r e v i s i a e C D K - a c t i v a t i n g k i n a s e ( C A K 1 p ) en c o m p a s s i n g r e s i d u e s 2–3 6 8 w a s a m p l i f i e d a n d s u b c l o n e d i n to t h e p l a s m i d p F a s t B a c . T h e C A K 1 p c o n s t r u c t w a s en g i n ee r e d w i t h an N - t e r m i n a l 6 X - H i s a f f i n i t y t a g a n d a T E V r e co g n i t i o n s e q u e n c e t o f a c i l i t a t e p u r i f i c a t i o n i n t h e ev e n t t h a t t h e i s o l a t e d C A K 1 p w a s r e q u i r ed f o r i n v i t r o e x p e r i m en t s . A f t e r co n s t r u c t i o n , t h e c lo n e d in s e r t s w e r e v er i f i e d b y D N A s e q u e n c e an a l y s i s . R e c o m b i n an t v ir u s e s w e r e g en e r a t ed u s i n g t h e B a c - to - B a c b a cu l o v ir u s e x p r e s s i o n s y s t e m ( I n v i t r o g en ) . H i g h - t i t e r v i r u s e s e n c o d i n g C D K 1 2 / C y c K a n d C A K 1 p w e r e m i x e d i n a 1 : 1 r a t i o a n d H i5 c e l l s w er e i n f e c t e d t o e x p r e s s t h e r e co m b i n an t p r o t e in s . T h e C A K 1 p w a s i n c l u d e d d u r i n g e x p r e s s i o n a s t h e p h o s p h o r y l a t i o n o f C D K 1 2 w a s r ep o r t ed t o f a c i l i t a t e c r y s t a l l i z a t i o n ( B ö s k e n e t a l., 2 0 1 4 ) . T h e i n f e c t e d H i 5 ce l l s w e r e h ar v e s t e d 6 6 h af t e r t h e ad d i t i o n o f th e v i r u s e s . A c e l l p e l l e t g e n er a t e d f r o m a 1 0 L c u l tu r e o f H i 5 c e l l s w a s h o m o g en i z e d i n 1 L o f l y s a t e b u f f er ( 2 5 m M H E P E S ( p H 7 . 6 ) , 0 . 5 M N a C l , 0 .2 5 m M T C E P , a n d 5 % g ly c e r o l ; a l l c h e m i c a l s w e r e p u r c h a s e d f r o m S i g m a -A l d r i ch ) s u p p l e m en t e d w i t h p r o t e a s e i n h i b i t o r s ( R o c h e ) . T h e l y s a t e w a s c l a r i f i ed b y c en t r i f u g a t i o n an d th e r e s u l t in g s u p er n a t an t w a s a f f in i t y p u r i f i e d b y u s i n g g l u t a t h io n e s e p h a r o s e ( G E H e a l t h c a r e) . T h e g l u t a t h i o n e a f f i n i t y co l u m n w a s w a s h ed w i t h 5 0 v o l u m e s o f l y s a t e b u f f e r i n th e a b s en c e o f p r o t e a s e i n h i b i t o r s . T o r em o v e th e G S T - t a g , t h e c o l u m n w a s i n c u b a t e d w i t h T E V p r o t e a s e o v e r n ig h t d u r i n g a n o n - co l u m n c l e av a g e s t e p an d th e f o l l o w i n g d ay t h e C D K 1 2 / C y c K p r o t e i n c o m p l e x w a s e l u t ed w i t h b u f f er ( 2 5 m M H E P E S p H 7 . 6 , 0 .4 M N a C l , 0 .5 m M T C E P , 5 % g ly c e r o l ) . T h e c o m p l e x w a s f u r t h e r p u r i f i e d in t h i s b u f f er b y p a s s a g e t h r o u g h a s i z e e x c l u s i o n c o lu m n ( S u p er d e x 2 0 0 , G E H e a l th c a r e ) . T h e p e ak f r a c t io n s f r o m s i z e ex c l u s i o n ch r o m a to g r ap h y t h a t c o n t a i n ed t h e C D K 1 2 / C y c K h e t er o d im e r i c co m p l ex w e r e p o o l e d an d s t o r e d i n a l i q u o t s a t − 8 0 ° C . A n a l y s i s o f th e

66

p u r i f i ed c o m p l ex b y m a s s s p e c t r o m e t r y d e m o n s t r a t e d t h a t C D K 1 2 w a s p h o s p h o r y l a t e d ( d a t a n o t s h o w n ) .

C r y s t a l l i z a t i o n a n d X - r a y s t r u c t u r e a n a l y s i s . P r i o r t o s e t t i n g u p cr y s t a l l i z a t i o n t r i a l s , a C D K 1 2 / C y c K - c o m p o u n d t e r n ar y co m p l ex w a s g e n e r a t e d b y t h e a d d i t i o n o f a m a c r o cy c l i c A T P - c o m p e t i t i v e c o m p o u n d ( t h e i d e n t i ty o f t h i s t o o l c o m p o u n d i s n o t d i s c l o s e d ) f o l l o w e d b y c o - c o n c e n t r a t i o n u s i n g a n Am i c o n co n c en t r a to r ( E M D - M i l l i p o r e) t o p r o d u c e a f in a l c o n c e n tr a t i o n o f 1 2 m g / m L . C r y s t a l l i z a t i o n w a s p e r f o r m e d u s i n g t h e h an g in g d r o p v a p o r d if f u s i o n m e th o d w i t h a r e s e r v o i r s o lu t i o n c o m p o s e d o f 0 .1 M H E P E S ( p H 6 . 5 ) , 1 8 % P E G 3 3 5 0 , 0 .2 M M g C l2, a n d 1 m M s a r co s i n e ( t h e ad d i t i v e s a r co s i n e a n d P E G 3 3 5 0 s o l u t io n w e r e p u r ch a s e d f r o m H a m p t o n R e s e a r c h ) . T h e c r y s t a l s w e r e g r o wn a t 2 5 ° C a n d r e a ch i n g t h e ir m ax i m u m s i z e w i t h in 1 m o n t h . T h e cr y s t a l s o f C D K 1 2 / C y c K w e r e b a ck s o a k ed w i t h m o t h e r l i q u o r s u p p l e m e n t ed w i t h 2 m M c o m p o u n d 1 8 b y t r an s f e r r i n g th e cr y s t a l s i n t o f r e s h c o m p o u n d / m o t h er l iq u o r s o l u t i o n o n c e p e r d ay f o r f i v e co n s e c u t i v e d a y s . A f t e r th e s o a k in g r e g im e n , t h e c r y s t a l s w e r e cr y o - p r o t e c t e d b y r a p i d t r a n s f e r i n t o a r e s e r v o i r s o l u t i o n s u p p l e m e n t e d w i t h 2 5 % e t h y l en e g l y c o l a n d r a p id l y f l a s h - c o o l e d i n A L S - s t y l e p u c k s t h a t w er e s u b m e r g e d in l i q u id n i t r o g e n . T h e d i f f r a c t i o n d a t a w e r e c o l l e c t e d a t A d v a n c ed L i g h t S o u r c e b e a m l i n e 5 . 0 .3 ( L a w r en c e B e r k e l e y ’ s N a t i o n a l L a b o r a t o r y ) a n d p r o c e s s e d u s i n g t h e H K L 2 0 0 0 s o f t w a r e p a c k a g e ( O t w i n o w s k i e t a l. , 1 9 9 7 ) . T h e s t r u c tu r e w a s s o l v e d b y m o l e c u l a r r ep l a c e m en t w i t h P h a s e r ( M c C o y e t a l., 2 0 0 7 ) u s i n g s t e p w i s e s e a r c h e s w i t h t h e c o o r d in a t e s o f C D K 1 2 f o l l o w ed b y C y c K ( b o th m o d e l s d e r iv e d f r o m P D B c o d e :4 N S T ) . T h e g r a p h i c s p r o g r am C O O T ( E m s l e y e t a l. , 2 0 0 4 ) w a s u s e d f o r m o d e l b u i l d i n g a n d r e f i n e m en t w a s p e r f o r m ed w i t h R E F M A C 5 ( M u r s h u d o v e t a l. , 1 9 9 7 ) . P h a s e r a n d R E F M A C 5 a r e d i s t r i b u t e d a s p a r t o f C C P 4 ( C o l l a b o r a t iv e C o m p u t i n g P r o j e c t T h e C C P 4 s u i t e , 2 0 1 0 ) . S t r u c tu r a l v a l id a t i o n w a s p er f o r m e d b y u s i n g M o l p r o b i ty ( C h e n e t a l. , 2 0 1 0 ) . R e f i n e m en t s t a t i s t i c s a r e r e p o r t ed i n T a b l e 2 - 1 1 a n d a n i m ag e o f t h e o m i t e l e c t r o n d en s i t y f o r t h e l i g a n d i s s h o w n i n F i g u r e 2 - 1 4 .

67

T a b l e 2 - 1 1 . X - r ay d a t a c o l l e c t io n an d r e f i n e m e n t s t a t i s t i c s . X - R a y S t r u c t u r e

D a ta c o l l e c t i o n R e s o l u t i o n r a ng e ( Å ) S p a c e g r o u p

C e l l d i m e n s i o n s : a , b , c ( Å )

α , β , γ ( º ) Rs y m

< I / σI >

C o m p l e t e n e s s ( % ) R e d u n d a n c y

S t r u c t u r e R e f i n e m e n t R e s o l u t i o n ( Å)

N o . r e f l e c t io n s

N o . r e f l e c t io n s R f r e e t e s t s e t R w o rk / R f re e

N o . a t o m s : P r o t e i n L i g a n d M g I o n s Wa t e r s

M e a n B V a l u e ( Ų) P ro t e i n B V a l u e ( Ų) L i g a n d B V a l u e ( Ų) M g I o n s B V a l u e ( Ų) W a t er B V a l u e ( Ų) R M S B o n d l e n g t h s ( Å ) R M S B o n d a n g l e s ( º ) R a m a c h a n d r a n s t a t i s t i c s : F a v o r e d ( % )

C D K 1 2 / C y c K -1 8 / P D B C O D E : 6 C K X

5 0 - 2 . 7 5 ( 2 . 8 - 2 . 7 5 ) P 212121

9 6 . 5 9 6 , 1 0 7 . 5 3 0 , 1 3 8 . 3 2 4 9 0 . 0 0 0 , 9 0 . 0 0 0 , 9 0 . 0 0 0 1 0 . 7 ( 1 0 0 )

1 3 . 9 ( 1 .0 5 ) 9 9 . 9 ( 9 9 . 8 ) 6 . 9 ( 6 . 7 )

4 5 . 6 4 - 2 . 8 0 3 4 , 3 7 5 1 , 8 1 3 2 0 . 8 /2 5 .1

8 , 6 1 3 6 6 3 3 8 8 7 . 3 8 7 . 3 9 4 . 9 8 1 . 5 6 7 . 0 0 . 0 1 0 1 . 3 7

9 6 . 1 7

68

O u t l i e r s ( % ) 0 . 1 9

*V a l u e s i n p a r en t h e s e s a r e f o r h ig h e s t - r e s o l u t i o n s h e l l .

F i g u r e 2 - 1 4. O m i t e l e c t r o n d en s i t y F o - F c m a p ( r e n d e r ed a s m e s h ) w a s g e n er a t e d b y o m i t t i n g a t o m s co r r e s p o n d i n g t o t h e c o m p o u n d ( d i s p l ay e d a s g r e e n s t i c k s ) . M a p i s c o n t o u r e d a t ± 3 . 0 σ . F i g u r e w a s c r e a t e d u s i n g P y m o l .

C o m p u t a t io n a l C h e m i s t r y

M o l e c u l a r do c k i n g m o d e l o f c o m p o u n d 1 w i t h C D K 1 2 . M o d e l i n g an d d o c k i n g c a l c u l a t io n s w e r e p e r f o r m e d b y u s i n g t h e S c h r ö d in g e r s o f t w a r e s u i t e ( R e l e a s e 2 0 1 3 - 2 ) . T h e c r y s t a l s t r u c t u r e o f t h e h u m an C D K 1 2 - C y c K co m p l ex ( P D B I D : 4 C X A ) i n c l u d e s t w o C D K 1 2 m o l e c u l e s ( c h a i n A an d c h a in C ) . C h a i n C w a s u s e d a s a t e m p l a t e f o r d o ck i n g b ec a u s e t h e A T P b i n d i n g s i t e w a s m o r e o p e n t h an ch a i n A , i n w h i c h t h e A T P s i t e i s o cc l u d ed b y t h e C - t e r m i n a l s e g m en t ( D i x o n - C l a r k e e t a l. , 2 0 1 5 ) . T h e m i s s i n g s i d e ch a i n s o f t h e c r y s t a l s t r u c t u r e w e r e m o d e l e d b y u s i n g P r i m e. A l l w a t e r m o l e cu l e s w e r e r e m o v ed b ef o r e d o ck i n g . T h e c o m p o u n d s t r u c t u r e w a s p r ep a r e d f o r d o c k in g b y u s i n g L i g P r e p m o d u l e a n d d o c k ed u s i n g G l i d e in S P m o d e w i t h to r s i o n a l c o n s t r a i n t s b y S M A R T S

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p a t t er n s : [ # 1 ] [ N - 0 X 3 ] [ c - 0 X 3 ] [ n - 0 X 2 ] = 0 . 0 a n d [ # 1 ] [ C - 0 X 4 ] [ N - 0 X 3 ] [ # 1 ] = 1 4 5 . 8 . T h e d o c k ed p o s e w a s t h e n m in i m i z e d u s i n g t h e l o c a l o p t i m i z a t i o n f e a t u r e u s i n g Mo l e c u l a r O p er a t i n g E n v ir o n m e n t ( M O E ) 2 0 1 3 . 0 8 .

M o l e c u l a r d o ck i n g m o d e l o f c o m p o u n d 1 w i t h C D K 2 . T h e d o ck i n g c a l cu l a t i o n s w er e p er f o r m e d u s i n g t h e S c h r ö d in g e r s o f t w a r e s u i t e ( R e l e a s e 2 0 1 4 - 3 ) . T h e c r y s t a l s t r u c t u r e o f h u m a n C D K 2 w i t h a d i a m i n o p y r i m i d i n e i n h i b i t o r ( P D B I D : 2 F V D ) w a s u s e d . T h e c o m p o u n d s t r u c t u r e u s e d w a s t h e s a m e a s t h a t u s e d f o r th e C D K 1 2 d o c k i n g s t u d y a b o v e a n d d o c k ed b y u s i n g G l i d e i n S P m o d e w i t h c o r e co n s t r a i n t s d e t er m i n ed b y th e S M A R T S p a t t er n S ( = O ) ( = O ) N ( C C 1 ) C C C 1 N c 2 n c c c c 2 , w h i ch w a s c o n s i s t e n t w i t h th e c o n f o r m a t i o n o f t h e d i a m in o p y r i m i d i n e in h i b i t o r i n 2 F V D . T h e d o ck e d p o s e w a s t h en m i n i m i z ed u s i n g t h e l o c a l o p t i m i z a t i o n f e a t u r e u s i n g M O E 2 0 1 3 .0 8 .

M o l e c u l a r d o ck i n g o f c o m p o u n d 2 3 w i t h C D K 1 2 . T h e X - r a y s t r u c t u r e o f C D K 1 2 k i n a s e d o m a i n i n c o m p l e x w i t h 1 8 w a s u s e d f o r d o c k i n g s t u d i e s . T h e l i g a n d 2 3 a n d p r o t e i n w e r e p r e p a r e d in a cc o r d a n c e w i th t h e s t a n d ar d p r o t o co l u s i n g M a e s t r o 2 0 1 5 - 0 3 ( S c h r o d in g e r s o f t w a r e) . T w e n t y d o c k in g m o d e s w e r e o u tp u t i n G l i d e S P m o d e , wh i c h w e r e f u r th e r r ef i n e d u s i n g G l i d e X P m o d e . A l l d o ck i n g c a l c u l a t io n s w e r e p er f o r m e d u s i n g d ef a u l t s e t t i n g s . T h e o b t a i n ed 2 0 m o d e s w e r e r e s c o r e d b y t h e in - h o u s e M M G B S A c a l c u l a t i o n t o o l b a s ed o n A M B E R ( S a l o m o n - F e r r e r e t a l., 2 0 1 3 ) an d t h e p o s e w i t h th e b e s t s c o r e w a s s e l e c t e d a s t h e p r e s u m e d b in d i n g p o s e . T h e c o m m o n p a r t i a l s t r u c t u r e o f th e p r e d i c t e d p o s e o f 2 3 w e l l o v e r l a p p e d w i t h t h a t o f 1 8, w h i ch s u p p o r t s t h a t t h i s d o c k in g p o s e i s r e a s o n a b l e .

C h e m i s t ry

G e n e ra l . P r o t o n n u c l e a r m a g n e t i c r e s o n an c e (¹H N M R ) s p e c t r a w e r e r e co r d e d o n B r u k er A V A N C E - 3 0 0 ( 3 0 0 M H z ) , B r u k e r A V A N C E - 4 0 0 ( 4 0 0 M H z ) , a n d B r u k e r A V A N C E - 6 0 0 ( 6 0 0 M H z ) , an d c a r b o n n u c l e ar m a g n e t i c r e s o n an c e (^{1 3}C N M R ) s p e c t r a w e r e r e co r d ed o n B r u k e r A V A N C E - 3 0 0 ( 7 5 M H z ) a n d B r u k er A V A N C E - 6 0 0 ( 1 5 1 M H z ) i n C D C l3 o r D M S O -d6 s o l u t i o n . C h e m i c a l s h if t s a r e g i v en in p a r t s p er m i l l i o n ( p p m ) w i t h t e t r a m e t h y l s i l a n e a s a n in t e r n a l s t a n d a r d . A b b r e v i a t io n s a r e u s e d a s f o l l o w s : s = s i n g l e t , d = d o u b l e t , t =

70

t r i p l e t, m = m u l t i p l e t , d d = d o u b l e t o f d o u b l e t s , t t = t r i p l e t o f t r ip l e t s , q = q u a r t e t , b r s = b r o ad s i n g l e t . C o u p l i n g c o n s t a n t s (J v a l u e s ) a r e g i v en in h e r t z ( H z ) . L o w - r e s o l u t io n m a s s s p e c t r a ( M S ) w e r e a cq u i r ed u s i n g a n A g i l e n t L C / M S s y s t e m ( Ag i l e n t 1 2 0 0 S L / A g i l e n t 6 1 3 0 M S , A g i l en t 1 2 0 0 S L / A g i l e n t1 9 5 6 M S , o r A g i l e n t1 2 0 0 S L / A g i l e n t 6 1 1 0 M S ) o r S h i m ad z u U F L C / M S ( P r o m i n en c e U F L C h ig h p r e s s u r e g r a d i e n t s y s t e m / L C M S - 2 0 2 0 ) o p e r a t i n g i n a n e l e c t r o s p r a y io n i z a t i o n m o d e ( E S I + ) . T h e c o lu m n u s e d w a s a n L - c o lu m n 2 O D S ( 3 . 0 × 5 0 m m I . D ., 3 μ m , C E R I ) w i t h a t e m p e r a tu r e o f 4 0 ° C a n d a f lo w r a t e o f 1 . 2 o r 1 .5 m L / m in . C o n d i t i o n 1 : Mo b i l e p h a s e s A an d B u n d er a n a c id i c co n d i t i o n w e r e 0 .0 5 % T F A i n w a t e r a n d 0 . 0 5 % T F A i n M e C N , r e s p e c t i v e l y . T h e r a t io o f m o b i l e p h a s e B w a s i n c r e a s e d l i n e ar l y f r o m 5 t o 9 0 % o v e r 0 .9 m i n , 9 0 % o v e r t h e n ex t 1 . 1 m i n . C o n d i t i o n 2 : M o b i l e p h a s e s A an d B u n d er a n e u t r a l c o n d i t i o n w e r e a m ix t u r e o f 5 m m o l / L A c O N H4 a n d M e C N ( 9 /1 , v / v ) a n d a m i x t u r e o f 5 m m o l / L A c O N H4

a n d M e C N ( 1 / 9 , v /v ) , r e s p e c t iv e l y . T h e r a t i o o f m o b i l e p h a s e B w a s i n c r e a s e d l i n e ar l y f r o m 5 to 9 0 % o v e r 0 . 9 m i n , 9 0 % o v er t h e n e x t 1 .1 m in . T h e p u r i t i e s o f a l l co m p o u n d s t e s t e d i n b i o lo g i c a l s y s t e m s w e r e a s s e s s e d a s b e in g >9 5 % u s i n g e l e m en t a l a n a ly s i s o r a n a l y t i c a l H P L C . E l e m en t a l a n a l y s e s w e r e c a r r i e d o u t b y S u m ik a C h e m i c a l A n a ly s i s S e r v i c e o r T o r a y R e s e a r ch C e n t er a n d w e r e w i t h i n 0 . 4 % o f t h e th e o r e t i c a l v a lu e s . A n a ly t i c a l H P L C w e r e c a r r i ed o u t u s i n g H P L C w i t h N Q A D ( N a n o Qu a l i t y An a l y t e D e t e c t o r ) o r C o r o n a C A D ( C h ar g e d A e r o s o l D e t e c t o r ) . T h e co l u m n w a s an L - co l u m n 2 O D S ( 3 0 × 2 .1 m m I . D . , C E R I ) o r a C a p c e l l P a k C 1 8 A Q ( 5 0 m m × 3 . 0 m m I . D. , S h i s e i d o ) w i t h a t e m p e r a tu r e o f 5 0 ° C a n d a f l o w r a t e o f 0 . 5 m L / m i n . Mo b i l e p h a s e s A a n d B u n d er a n eu t r a l co n d i t i o n w e r e a m i x t u r e o f 5 0 m m o l / L A c O N H4, w a t e r a n d M e C N ( 1 / 8 / 1 , v / v / v ) a n d a m ix t u r e o f 5 0 m m o l / L A c O N H4 a n d M e C N ( 1 / 9 , v / v ) , r e s p e c t i v e ly . T h e r a t i o o f m o b i l e p h a s e B w a s i n c r e a s e d l i n e a r l y f r o m 5 t o 9 5 % o v e r 3 m i n , 9 5 % o v e r t h e n e x t 1 m i n . R e a c t i o n p r o g r e s s w a s d e t er m i n ed b y t h in l a y e r c h r o m a t o g r a p h y ( T L C ) a n a l y s i s o n M er c k K i e s e l g e l 6 0 F 2 5 4 p l a t e s o r F u j i S i l y s i a N H p l a t e s . C h r o m a t o g r a p h i c p u r i f i ca t i o n w a s c a r r i e d o u t o n s i l i c a g e l c o lu m n s ( ( M er c k K i e s e l g e l 6 0 , 7 0 ‒ 2 3 0 m e s h o r 2 3 0 ‒ 4 0 0 m e s h , M e r ck ) , ( C h r o m a t o r ex N H -D M 1 0 2 0 , 1 0 0 ‒ 2 0 0 m e s h , F u j i S i l y s i a C h e m i c a l), ( I n j e c t c o lu m n a n d Un i v e r s a l c o lu m n , Y A M A Z E N , h t t p : / / y am a z e n u s a . c o m / p r o d u c t s / c o l u m n s / ) , o r ( P u r i f - P a c k S i o r N H , S h o k o S c i e n t i f i c , h t t p : / / s h o k o - s c . co . j p / e n g l i s h 2 / ) ) . Preparative HPLC

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w a s p e r f o r m ed u s i n g a G i l s o n P r e p a r a t i v e H P L C S y s t e m w i t h U V d e t e c t o r ( 2 2 0 a n d 2 5 4 n m ) . M o b i l e p h a s e s A a n d B u n d e r a b a s i c co n d i t i o n w e r e 0 .0 2 2 5 % a q u e o u s f o r m i c a c i d s o l u t i o n a n d M e C N , r e s p e c t i v e ly . T h e r a t i o o f m o b i l e p h a s e B w a s i n cr e a s e d l i n e a r ly i n 1 5 m i n . T h e co l u m n u s e d w a s a Synergi C 1 8 ( 1 5 0 × 2 5 m m I . D . , 1 0 μ m , Ph e n o m e n ex ) , an d a f lo w r a t e o f 2 5 m L / m in . A l l c o m m e r c i a l l y av a i l a b l e s o l v en t s a n d r e a g en t s w e r e u s e d w i t h o u t f u r t h e r p u r if i c a t i o n . Y i e l d s w e r e n o t o p t i m i z ed . S t a u r o s p o r in e w a s p u r ch a s e d f r o m E n zo L i f e S c i e n c e s I n c . , a n d I b u l o cy d i n e w a s p u r c h a s e d f r o m M ed i c i l o n I n c. ( f e e f o r s e r v i c e ) . 3 ( T H Z-5 3 1 ) w a s s y n t h e s i z e d a c c o r d i n g t o t h e l i t e r a t u r e p r o c e d u r e ( Z h a n g e t a l. , 2 0 1 6 ).

6 - ( ( 1 - ( ( 4 - ( 1 - M e t h y l -1 H p y r a zo l 4 y l ) p h e n y l ) s u l f o n y l ) p i p e r i d i n 4

-y l) a m i n o ) n i c o t i n o n i t r i l e ( 1 ) . A m i x t u r e o f 3 2 ( 3 0 0 m g , 0 .8 4 1 m m o l ) , D I P E A ( 0 . 8 7 9 m L , 5 . 0 4 m m o l) , a n d 6-f l u o r o n i c o t in o n i t r i l e ( 3 0 8 m g , 2 . 5 2 m m o l) i n N M P ( 5 m L ) w a s s t i r r e d a t 1 2 0 ° C f o r 7 h . T h e m i x t u r e w a s p o u r ed i n to w a t e r a n d e x t r a c t e d w i t h E t O A c . T h e o r g an i c l a y e r w a s s e p a r a t ed , w a s h e d w i t h w a t e r an d b r i n e , d r i e d o v e r Mg S O4, a n d c o n c e n tr a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i e d b y N H s i l i c a g e l c o lu m n ch r o m a t o g r a p h y ( h e x an e / E t O A c = 9 5 / 5 t o 0 /1 0 0 ) a n d s o l i d i f i ed w i t h h ex a n e / E t O H to g i v e 1 ( 2 6 0 m g , 7 3 % ) a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 1 . 3 7 –1 . 6 0 ( m , 2 H ) , 1 . 8 6–2 . 0 4 ( m , 2 H) , 2 . 5 1–2 .6 2 ( m , 2 H ) , 3 . 5 3 ( d , J = 1 2 .1 H z , 2 H ) , 3 . 6 9–3 . 8 5 ( m , 1 H ) , 3 . 8 9 ( s , 3 H ) , 6 .5 1 ( d , J

= 8 . 9 H z , 1 H ) , 7 .5 5 ( d , J = 7 . 2 H z , 1 H ) , 7 . 5 9–7 . 6 7 ( m , 1 H ) , 7 . 7 0 ( d , J = 8 . 1 H z , 2 H ) , 7 . 8 2 ( d , J = 8 . 1 H z , 2 H ) , 8 .0 1 ( s , 1 H ) , 8 . 3 2 ( s , 2 H ) . ^{1 3}C N M R ( 1 5 1 M H z , D M S O -d6) δ 3 0 . 3 ( 2 C ) , 3 8 . 7 , 4 4 .7 ( 2 C ) , 4 6 . 1 , 9 4 . 5 , 1 1 8 . 9 , 1 2 0 . 3 , 1 2 5 . 2 ( 2 C ) , 1 2 8 .1 ( 2 C ) , 1 2 8 .9 , 1 3 2 .4 , 1 3 6 .6 , 1 3 7 . 3 , 1 3 8 . 5 , 1 5 2 . 9 , 1 5 9 .1 . 1 C w a s n o t o b s e r v e d . M S m/z 4 2 3 . 2 ( M + H )⁺. A n a l. C a l c d f o r C2 1H2 2N6O2S : C , 5 9 .7 0 ; H , 5 . 2 5 ; N , 1 9 .8 9 . F o u n d : C , 5 9 . 5 8 ; H , 5 . 3 4 ; N , 1 9 . 7 7 . X-r a y c r y s t a l s t r u c t u r e i s a v a i l a b l e ( C C D C 1 8 3 5 9 9 2 ) .

3 - B e n z y l - 1 - (t r a n s 4 ( ( 5 c y a n o p y r i d i n 2 y l) a m i n o ) c y c lo h e x y l ) 1 ( 4 ( 1 m e t h y l 6 o x o -1 , 6 - d i h y d r o p y r i d i n - 3 - y l) p h e n y l ) u r e a ( 2 ) . A m i x t u r e o f 4 3 ( 2 0 3 m g , 0 . 4 0 2 m m o l) , 4 4 ( 1 2 3 m g , 0 . 5 2 3 m m o l) , p o t a s s i u m a c e t a t e ( 7 9 m g , 0 . 8 0 4 m m o l ) , a n d Pd ( d p p f ) C l2·C H2C l2

( 3 2 .9 m g , 0 .0 4 0 2 m m o l ) i n N M P ( 1 0 m L ) w a s s t i r r e d a t 1 0 0 ° C u n d e r A r o v er n i g h t . T h e r e a c t io n m ix t u r e w a s c o o l e d t o r o o m t e m p e r a t u r e a n d i n s o l u b l e m a t e r i a l s w e r e f i l t e r ed o f f . T h e f i l t r a t e w a s p o u r e d i n t o w a t e r a n d e x tr a c t e d w i t h E t O A c . T h e o r g a n i c l a y e r w a s

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s e p a r a t ed , w a s h e d w i t h w a t e r a n d b r i n e , d r i e d o v e r N a2S O4, an d c o n c e n tr a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i e d b y s i l i c a g e l co l u m n c h r o m a to g r a p h y ( h e x an e / E t O A c = 7 0 / 3 0 t o 0 /1 0 0 ) t o g iv e 2 ( 7 4 m g , 3 5 % ) a s a g r ay i s h w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 6 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 1 .0 7 –1 . 2 0 ( m , 2 H ) , 1 . 2 7–1 . 3 8 ( m , 2 H ) , 1 .8 3 ( d , J = 1 1 . 4 H z , 2 H) , 1 .9 2 ( d , J = 1 1 . 4 H z , 2 H ) , 3 . 4 5– 3 . 5 2 ( m , 1 H ) , 3 . 5 2 ( s , 3 H) , 4 .1 6 ( d , J = 5 .9 H z , 2 H ) , 4 . 3 0 ( t t , J = 1 2 . 1 , 3 . 5 H z , 1 H ) , 5 . 8 2 ( t , J = 6 . 1 H z , 1 H ) , 6 . 4 7 ( d , J = 8 . 8 H z , 1 H ) , 6 .5 0 ( d , J = 9 .2 H z , 1 H) , 7 . 1 6–7 .2 0 ( m , 3 H ) , 7 . 2 2 ( d , J = 8 . 4 H z , 2 H ) , 7 .2 6–7 . 2 9 ( m , 2 H ) , 7 . 4 7 ( d , J = 6 . 6 H z, 1 H ) , 7 .6 0 ( d d , J = 8 . 8 , 1 . 8 H z , 1 H ) , 7 . 6 6 ( d , J = 8 . 8 H z, 2 H ) , 7 .8 7 ( d d , J = 9 .4 , 2 . 8 H z, 1 H ) , 8 . 1 8 ( d , J = 2 . 9 H z , 1 H) , 8 .2 9 ( d , J = 1 . 8 H z , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 1 5 1 M H z , D M S O -d6) δ 3 0 . 1 ( 2 C ) , 3 1 . 2 ( 2 C ) , 3 7 . 0 , 4 3 . 4 , 4 8 . 5 , 5 3 . 1 , 9 3 .9 , 1 0 8 . 8 , 1 1 6 . 9 , 1 1 9 . 0 , 1 1 9 .2 , 1 2 6 . 0 ( 2 C ) , 1 2 6 .2 , 1 2 6 .7 ( 2 C ) , 1 2 7 .9 ( 2 C ) , 1 3 1 . 5 ( 2 C ) , 1 3 5 . 5 , 1 3 6 . 6 , 1 3 7 . 5 , 1 3 8 .3 , 1 3 8 .6 , 1 4 1 . 1 , 1 5 3 .0 , 1 5 6 .4 , 1 5 9 .1 , 1 6 1 .1 . M S m/z 5 3 3 . 3 ( M + H )⁺. A n a l. C a l c d f o r C3 2H3 2N6O2· 0 .5 H2O : C , 7 0 .9 6 ; H , 6 .1 4 ; N , 1 5 . 5 2 . F o u n d : C , 7 1 .0 2 ; H , 6 .2 9 ; N , 1 5 .4 0 .

4 - ( ( 1 - ( ( 4 - ( 1 - M e t h y l -1 H p y r a zo l 4 y l ) p h e n y l ) s u l f o n y l ) p i p e r i d i n 4 -y l) a m i n o ) b e n z o n i t r i l e ( 5 ) .

A m i x tu r e o f 4 - f l u o r o b e n z o n i t r i l e ( 1 5 4 m g , 1 .2 7 m m o l ) , 3 2 ( 2 0 0 m g , 0 .5 6 0 m m o l ) , a n d K2C O3 ( 2 1 1 m g , 1 . 5 3 m m o l ) i n D M S O ( 4 m L ) w a s s t i r r e d a t 1 2 0 ° C f o r 4 h . T h e m i x t u r e w a s p o u r ed i n to w a t e r an d ex t r a c t ed w i t h E t O A c . T h e o r g an i c l a y e r w a s w a s h e d w i t h w a t e r an d b r i n e , d r i ed o v e r N a2S O4, a n d c o n c e n tr a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i e d b y s i l i c a g e l co l u m n c h r o m a t o g r a p h y ( h e x an e / E t O A c = 5 0 / 5 0 to 0 / 1 0 0 ) t o g iv e 5 ( 2 2 m g , 9 % ) a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 1 .3 2 –1 . 5 2 ( m , 2 H) , 1 . 9 3 ( d , J = 1 0 . 8 H z , 2 H) , 2 . 5 2–2 .5 9 ( m , 2 H ) , 3 .3 4–3 .4 4 ( m , 1 H ) , 3 . 5 0–3 .6 3 ( m , 2 H ) , 3 . 8 9 ( s , 3 H) , 6 . 5 3–6 . 6 6 ( m , 3 H ) , 7 .3 8 ( d , J = 8 . 8 H z , 2 H ) , 7 .7 0 ( d , J = 8 . 3 H z , 2 H ) , 7 . 8 3 ( d , J = 8 . 7 H z , 2 H ) , 8 . 0 1 ( d , J = 0 .6 H z , 1 H ) , 8 . 3 2 ( b r s , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 7 5 M H z , D M S O -d6) δ 3 1 . 0 ( 2 C ) , 3 9 . 3 , 4 5 .4 ( 2 C ) , 4 7 .7 , 9 6 .0 , 1 1 2 . 6 ( 2 C ) , 1 2 0 .9 , 1 2 1 . 0 , 1 2 5 . 8 ( 2 C ) , 1 2 8 . 7 ( 2 C ) , 1 2 9 . 5 , 1 3 2 . 7 , 1 3 3 .8 ( 2 C ) , 1 3 7 . 2 , 1 3 7 .9 , 1 5 1 .6 . M S m/z 4 2 2 .3 ( M + H )⁺. A n a l. C a l c d f o r C2 2H2 3N5O2S · 0 . 3 H2O : C , 6 1 . 8 9 ; H , 5 . 5 7 ; N , 1 6 . 4 0 . F o u n d : C , 6 2 . 0 5 ; H , 5 . 7 7 ; N , 1 6 . 0 4 .

6 - ( M e t h y l ( 1 - ( ( 4 - ( 1 - m e t h y l -1 H -py r a z o l 4 y l ) p h e n y l ) s u l f o n y l ) p i p e r i d i n 4

-y l) a m i n o ) n i c o t i n o n i t r i l e ( 6 ) . T o a s o l u t i o n o f 1 ( 5 0 m g , 0 .1 2 m m o l ) i n T H F ( 1 . 5 m L ) an d D M F ( 0 .5 m L ) w a s a d d ed 6 0 % N a H ( 9 .5 m g , 0 .2 4 m m o l ) a t 0 ° C . A f t e r b e i n g s t i r r ed a t

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0 ° C f o r 3 0 m i n , i o d o m e th a n e ( 0 . 0 1 5 m L , 0 . 2 4 m m o l ) w a s a d d ed t o th e m i x tu r e . T h e m ix t u r e w a s s t i r r e d a t a m b i e n t t e m p e r a t u r e o v e r n i g h t. T h e m ix t u r e w a s p o u r ed i n t o w a t er a n d ex t r a c t e d w i t h E t O A c . T h e o r g a n i c l a y e r w a s w a s h e d w i t h w a t er a n d b r i n e, d r i e d o v e r N a2S O4, a n d co n c en t r a t e d . T h e r e s i d u a l s o l i d w a s s u s p e n d e d i n d i i s o p r o p y l e t h e r an d c o l l e c t ed b y f i l t r a t i o n to g i v e 6 ( 4 4 m g , 8 5 % ) a s a y e l l o w s o l id . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 1 . 6 4 ( d , J = 1 0 . 0 H z , 2 H ) , 1 . 7 3–1 .9 3 ( m , 2 H) , 2 .4 1 ( t , J = 1 1 . 3 H z , 2 H ) , 2 . 8 8 ( s , 3 H ) , 3 . 7 7 ( d , J = 1 1 .9 H z , 2 H ) , 3 .9 0 ( s , 3 H ) , 4 . 3 9 ( b r s , 1 H ) , 6 . 7 8 ( d , J = 9 . 2 H z , 1 H ) , 7 . 6 7–7 .8 7 ( m , 5 H ) , 8 . 0 2 ( s , 1 H ) , 8 .3 3 ( s , 1 H ) , 8 . 4 0 ( d , J = 2 . 1 H z , 1 H) . ^{1 3}C N M R ( 1 5 1 M H z , D M S O -d6) δ 2 7 .5 ( 2 C ) , 2 9 . 5 , 3 8 .7 , 4 5 . 6 ( 2 C ) , 5 1 . 4 , 9 4 .5 , 1 0 6 .2 , 1 1 8 .8 , 1 2 0 .3 , 1 2 5 .2 ( 2 C ) , 1 2 8 . 2 ( 2 C ) , 1 2 8 . 9 , 1 3 2 . 1 , 1 3 6 . 6 , 1 3 7 . 4 , 1 3 9 . 5 , 1 5 2 .1 , 1 5 8 . 8 . M S m/z 4 3 7 .3 ( M + H )⁺. A n a l. C a l c d f o r C2 2H2 4N6O2S · 0 . 4 H2O : C , 5 9 .5 5 ; H , 5 . 6 3 ; N , 1 8 . 9 4 . F o u n d : C , 5 9 .9 3 ; H , 6 . 0 1 ; N , 1 9 . 2 5 .

2 - ( ( 1 - ( ( 4 - ( 1 - M e t h y l - 1H -p y r a zo l 4 y l ) p h e n y l ) s u l f o n y l ) p i p e r i d i n 4

-y l) a m i n o ) i s o n i c o t i n o n i t r i l e ( 7 ) . C o m p o u n d 7 w a s p r ep a r e d f r o m c o m p o u n d 3 2 an d 2 -c h lo r o i s o n i -c o t i n o n i t r i l e i n a s i m i l a r m a n n e r t o t h a t d e s c r i b e d f o r co m p o u n d 1 a n d o b t a i n e d in 5% y i e l d a s a l i g h t b r o w n s o l id . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 1 . 3 8–1 . 5 8 ( m , 2 H ) , 1 . 9 4 ( d , J = 1 0 . 3 H z , 2 H) , 2 .5 2–2 . 6 1 ( m , 2 H ) , 3 . 5 2 ( d , J = 1 2 . 4 H z , 2 H ) , 3 . 6 0– 3 . 7 7 ( m , 1 H ) , 3 . 8 9 ( s , 3 H) , 6 . 7 2–6 . 8 2 ( m , 2 H ) , 7 . 0 6 ( d , J = 7 . 3 H z , 1 H ) , 7 .6 5–7 .7 4 ( m , 2 H) , 7 .7 8–7 .8 8 ( m , 2 H ) , 8 .0 1 ( s , 1 H ) , 8 . 1 0 ( d , J = 5 .1 H z , 1 H) , 8 . 3 2 ( s , 1 H) . ^{1 3}C N M R ( 1 5 1 M H z, D M S O -d6) δ 3 0 . 3 6 ( 2 C ) , 3 8 .7 2 , 4 4 . 7 3 ( 2 C ) , 4 6 . 1 2 , 1 1 1 . 5 4 , 1 1 7 .3 5 , 1 1 9 . 4 8 , 1 2 0 .3 0 , 1 2 5 . 1 8 ( 2 C ) , 1 2 8 .0 9 ( 2 C ) , 1 2 8 . 9 2 , 1 3 2 .3 4 , 1 3 6 . 6 3 , 1 3 7 . 3 2 , 1 4 9 .2 7 , 1 5 7 . 7 9 . 1 C w a s n o t o b s e r v e d . M S m/z 4 2 3 .2 ( M + H )⁺. A n a l. C a l c d f o r C2 1H2 2N6O2S · 0 .2 5 H2O : C , 5 9 . 0 7 ; H , 5 . 3 1 ; N , 1 9 . 6 8 . F o u n d : C , 5 8 . 8 4 ; H , 5 . 1 9 ; N, 1 9 . 3 5 .

6 - ( ( 1 - ( ( 4 - ( 1 - M e t h y l - 1H p y r a zo l 4 y l ) p h e n y l ) s u l f o n y l ) p i p e r i d i n 4 y l) a m i n o ) p y r i d i n e 2 -c a r b o n i t r i l e ( 8 ) . C o m p o u n d 8 w a s p r ep a r ed f r o m co m p o u n d 3 2 a n d 6-c h l o r o-2 -p y r i d in e c a r b o n i t r i l e i n a s i m i l a r m an n e r t o th a t d e s c r i b ed f o r co m p o u n d 1 a n d o b t a i n ed in 6% y i e l d a s a l ig h t b r o w n s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z, D M S O -d6) δ 1 . 3 7 –1 .5 8 ( m , 2 H ) , 1 . 9 5 ( d d , J = 1 2 . 9 , 3 .5 H z , 2 H ) , 2 .5 8 ( t , J = 1 0 .1 H z , 2 H ) , 3 .5 1 ( d , J = 1 2 . 2 H z , 2 H) , 3 . 6 1–3 . 7 6 ( m , 1 H ) , 3 . 8 9 ( s , 3 H ) , 6 . 7 2 ( d d , J = 8 . 6 , 0 . 6 H z , 1 H) , 7 .0 2 ( d d , J = 6 . 4 , 0 . 6 H z , 1 H ) , 7 . 1 3 ( d , J = 7 . 2 H z , 1 H ) , 7 . 4 9 ( d d , J = 8 .7 , 7 . 1 H z , 1 H ) , 7 . 7 0 ( d , J = 8 . 4 H z , 2 H ) , 7 . 8 2 ( d , J =

74

8 . 6 H z , 2 H ) , 8 . 0 1 ( d , J = 0 .7 H z , 1 H ) , 8 .3 2 ( s , 1 H) . ^{1 3}C N M R ( 1 5 1 M H z , D M S O -d6) δ 3 0 . 3 ( 2 C ) , 3 8 . 7 , 4 4 .7 ( 2 C ) , 4 5 . 8 , 1 1 3 . 8 , 1 1 7 . 2 , 1 1 8 . 1 , 1 2 0 . 3 , 1 2 5 . 2 ( 2 C ) , 1 2 8 . 1 ( 2 C ) , 1 2 8 .9 , 1 3 0 .0 , 1 3 2 .4 , 1 3 6 . 6 , 1 3 7 .3 , 1 3 7 .3 , 1 5 8 . 1 . M S m/z 4 2 3 . 2 ( M + H )⁺. A n a l. C a l c d f o r C2 1H2 2N6O2S · 0 . 5 H2O : C , 5 8 . 4 5 ; H , 5 . 3 7 ; N , 1 9 . 4 8 . F o u n d : C , 5 8 . 6 8 ; H , 5 . 4 8 ; N , 1 9 . 7 7 . N -( 1 - ( ( 4 - ( 1 - M e t h y l -1 H -p y ra z o l - 4 - y l ) p h e n y l ) s u l f o n y l) p i p e r i d i n - 4 - y l ) p y r i d i n - 2 - a m i n e ( 9 ) . A m i x t u r e o f 2 - b r o m o p y r i d in e ( 0 .0 9 7 m L , 1 . 0 2 m m o l ) , 3 2 ( 2 0 0 m g , 0 .5 6 0 m m o l ) , P d2( d b a )3 ( 2 7 . 9 m g , 0 . 0 3 0 5 m m o l ) , 2 - d i c y c l o h e x y l p h o s p h i n o - 2 '- (N , N -d im e t h y l a m in o ) b i p h en y l ( 2 4 . 0 m g , 0 .0 6 1 0 m m o l) , a n -d t e r t- B u O N a ( 1 4 7 m g , 1 . 5 3 m m o l ) i n t o lu e n e ( 4 m L ) w a s s t i r r ed a t 1 0 0 ° C o v e r n i g h t . I n s o l u b l e m a t e r i a l s w e r e f i l t e r e d o f f , th e f i l t r a t e w a s p o u r ed i n t o w a t er a n d e x t r a c t ed w i t h E t O A c . T h e o r g a n i c l a y er w a s w a s h e d w i t h w a t er an d b r i n e, d r i e d o v er N a2S O4, an d c o n c e n t r a t ed . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i e d b y s i l i c a g e l c o l u m n ch r o m a to g r ap h y ( h e x a n e / E t O A c = 7 0 /3 0 to 0 /1 0 0 ) t o g i v e 9 ( 1 5 m g , 7 % ) a s a p a l e y e l l o w s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 1 . 3 5 –1 . 5 5 ( m , 2 H) , 1 . 8 7–1 . 9 9 ( m , 2 H) , 2 . 5 2–2 .5 9 ( m , 2 H ) , 3 .5 2 ( d , J = 1 2 .1 H z , 2 H) , 3 . 5 9–3 . 7 4 ( m , 1 H ) , 3 .8 9 ( s , 3 H ) , 6 . 3 6– 6 . 4 6 ( m , 3 H ) , 7 .2 5–7 .3 5 ( m , 1 H ) , 7 .7 0 ( d , J = 8 . 5 H z , 2 H) , 7 . 8 2 ( d , J = 8 .7 H z , 2 H ) , 7 .8 8 ( d d , J = 5 . 5 , 1 . 3 H z , 1 H ) , 8 .0 1 ( s , 1 H ) , 8 . 3 2 ( s , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 1 5 1 M H z , D M S O -d6) δ 3 0 . 7 ( 2 C ) , 3 8 .7 , 4 4 . 8 ( 2 C ) , 4 5 .9 , 1 0 8 . 3 , 1 1 1 .4 , 1 2 0 . 3 , 1 2 5 . 2 ( 2 C ) , 1 2 8 . 1 ( 2 C ) , 1 2 8 . 9 , 1 3 2 .4 , 1 3 6 .4 , 1 3 6 . 6 , 1 3 7 .3 , 1 4 7 .3 , 1 5 7 . 9 . M S m/z 3 9 8 . 2 ( M + H )⁺. A n a l. C a l c d f o r C2 0H2 3N5O2S · 0 . 4 H2O : C , 5 9 . 3 6 ; H , 5 . 9 3 ; N , 1 7 . 3 1 . F o u n d : C , 5 9 . 6 8 ; H , 6 . 2 9 ; N , 1 7 . 0 8 . 5 - M e t h o x y -N -( 1 - ( ( 4 - ( 1 - m e t h y l -1 H -py r a z o l 4 y l) p h e n y l ) s u l f o n y l ) p i p e r i d i n 4

-y l) p -y r i d i n - 2 - a m i n e ( 1 0 ) . C o m p o u n d 1 0 w a s p r e p a r e d f r o m co m p o u n d 3 2 a n d 2 b r o m o 5 -m e th o x y p y r i d i n e i n a s i m i l a r m a n n e r to t h a t d e s c r i b ed f o r c o m p o u n d 9 an d o b t a in e d in 2 9% y i e l d a s a l i g h t g r a y s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 1 .2 9 –1 .4 5 ( m , 2 H) , 1 .9 3 ( d , J = 1 0 . 7 H z , 2 H ) , 2 . 4 1–2 .4 9 ( m , 2 H ) , 3 . 0 8–3 .2 7 ( m , 1 H ) , 3 . 5 5 ( d , J = 1 2 .0 H z , 2 H ) , 3 . 6 9 ( s , 3 H ) , 3 . 8 9 ( s , 3 H ) , 5 . 1 5 ( d , J = 8 .4 H z , 1 H ) , 6 . 5 4 ( d , J = 8 . 8 H z , 1 H ) , 7 . 0 1 ( d d , J

= 8 .8 , 2 .9 H z , 1 H ) , 7 . 4 6 ( d , J = 2 . 8 H z , 1 H ) , 7 .7 0 ( d , J = 8 . 4 H z , 2 H ) , 7 . 8 2 ( d , J = 8 . 4 H z , 2 H) , 8 . 0 1 ( d , J = 0 .6 H z , 1 H) , 8 . 3 2 ( s , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 1 5 1 M H z , D M S O -d6) δ 3 0 . 8 ( 2 C ) , 3 8 . 7 , 4 4 . 9 ( 2 C ) , 4 8 . 1 , 5 2 . 6 , 1 1 0 .1 , 1 2 0 . 3 , 1 2 5 . 2 ( 2 C ) , 1 2 5 . 4 , 1 2 8 .1 ( 2 C ) , 1 2 8 . 9 , 1 2 9 .8 , 1 3 2 .3 , 1 3 6 .6 , 1 3 7 .3 , 1 3 8 . 7 , 1 5 5 . 5 . M S m/z 4 2 8 .2 ( M + H )⁺. A n a l. C a l c d f o r C2 1H2 5N5O3S : C , 5 9 . 0 0 ; H , 5 . 8 9 ; N , 1 6 . 3 8 . F o u n d : C , 5 8 . 7 9 ; H , 6 . 1 7 ; N , 1 6 . 0 3 .

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N -( 1 - ( ( 4 - ( 1 - M e t h y l -1 H -p y ra z o l 4 y l ) p h e n y l ) s u l f o n y l) p i p e r i d i n 4 y l ) 5

-( t r i f l u o r o m e t h y l) p y r i d i n - 2 - a m i n e -( 1 1 ) . C o m p o u n d 1 1 w a s p r e p a r e d f r o m co m p o u n d 3 2 a n d 2 - b r o m o - 5 - ( t r i f lu o r o m e t h y l ) p y r i d i n e i n a s i m i l a r m an n e r t o th a t d e s c r i b e d f o r c o m p o u n d 9 an d o b t a i n e d i n 2 9% y i e l d a s a p a l e y e l l o w s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 1 .4 1 –1 . 5 8 ( m , 2 H ) , 1 .9 5 ( d , J = 1 0 . 1 H z , 2 H ) , 2 . 5 2–2 . 6 3 ( m , 2 H ) , 3 .5 3 ( d , J = 1 2 .3 H z , 2 H) , 3 . 7 0–3 . 8 3 ( m , 1 H ) , 3 . 8 9 ( s , 3 H ) , 6 . 5 4 ( d , J = 9 .0 H z , 1 H ) , 7 . 2 8 ( d , J = 7 .3 H z , 1 H) , 7 . 5 9 ( d d , J = 8 . 8 , 2 .4 H z , 1 H ) , 7 . 7 1 ( d , J = 8 . 6 H z , 2 H ) , 7 .8 2 ( d , J = 8 .6 H z , 2 H ) , 8 . 0 1 ( d , J = 0 . 7 H z , 1 H ) , 8 . 2 0–8 . 2 3 ( m , 1 H ) , 8 .3 2 ( s , 1 H) . ^{1 3}C N M R ( 1 5 1 M H z , D M S O -d6) δ 3 0 .4 ( 2C ) , 3 8 . 7 , 4 4 . 7 ( 2 C ) , 4 6 . 0 , 1 0 8 .2 , 1 1 2 .4 ( q , JC– F = 3 2 . 1 H z , 1 C ) , 1 2 0 . 3 , 1 2 5 . 0 ( q , JC– F = 2 7 0 . 0 H z , 1 C ) , 1 2 5 . 2 ( 2 C ) , 1 2 8 .1 ( 2 C ) , 1 2 8 .9 , 1 3 2 .4 , 1 3 3 . 3 , 1 3 6 . 6 , 1 3 7 .3 , 1 4 5 .3 (q , JC– F = 4 .4 H z , 1 C) , 1 5 9 . 8 0 . M S m/z 4 6 6 .2 ( M + H )⁺. A n a l. C a l c d f o r C2 1H2 2F3N5O2S : C , 5 4 . 1 8 ; H , 4 . 7 6 ; N , 1 5 . 0 5 . F o u n d : C , 5 4 . 2 0 ; H , 4 . 9 7 ; N, 1 4 . 8 2 .

6-( ( 1-( 4-( 1-m e t h y l-1H-p y ra z o l-4-y l ) b e n z o y l ) p i p e r i d i n-4-y l ) a m i n o ) n i c o t i n o n i t r i l e ( 1 2 ) . T o a s u s p e n s i o n o f 3 4 ( 4 5 0 m g , 1 . 6 4 m m o l ) in T H F ( 1 0 m L ) w e r e a d d e d D I P E A ( 1 .4 2 m L , 8 . 1 8 m m o l ) a n d 4 - b r o m o b e n z o y l c h lo r i d e ( 4 3 1 m g , 1 . 9 6 m m o l ) i n T H F ( 5 m L ) a t 0 ° C . T h e m i x t u r e w a s s t i r r e d 0 ° C f o r 2 h . T h e m i x tu r e w a s p o u r e d i n t o w a t e r a n d e x t r a c t ed w i t h E t O A c . T h e o r g a n i c l a y er w a s s e p ar a t e d , w a s h e d w i t h w a t e r a n d b r i n e, d r i e d o v er M g S O4, a n d co n c en t r a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r if i e d b y N H s i l i c a g e l co l u m n c h r o m a to g r ap h y ( h e x an e / E t O A c = 9 0 / 1 0 t o 2 0 /8 0 ) t o g i v e 6 ( ( 1 ( 4 -b r o m o -b en z o y l) p i p er i d i n - 4 - y l ) a m in o ) n i c o t i n o n i t r i l e ( 5 6 0 m g , 8 9 % ) a s a w h i t e s o l id . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 1 . 2 2 –1 .5 8 ( m , 2 H) , 1 . 8 0–2 .0 5 ( m , 2 H ) , 2 .9 0–3 . 2 7 ( m , 2 H) , 3 . 4 4–3 .6 8 ( m , 1 H) , 3 .9 6–4 .1 7 ( m , 1 H) , 4 .3 2 ( b r s , 1 H ) , 6 . 5 6 ( d , J = 8 .8 H z , 1 H ) , 7 .3 5 ( d , J

= 8 . 5 H z , 2 H) , 7 .5 2–7 . 7 1 ( m , 4 H ) , 8 . 3 9 ( d , J = 2 . 0 H z , 1 H) . M S m/z 3 8 5 . 1 , 3 8 7 . 1 ( M + H )⁺.

A m i x tu r e o f 6 - ( ( 1 - ( 4 - b r o m o b en z o y l) p i p er i d i n - 4 - y l ) a m in o ) n i c o t i n o n i t r i l e ( 1 5 0 m g , 0 . 3 8 9 m m o l ) , 1 - m e t h y l - 4 - ( 4 , 4 , 5 ,5 - t e t r a m e th y l - 1 , 3 ,2 - d i o x ab o r o l a n - 2 - y l ) -1 H- p y r a zo l e ( 9 7 m g , 0 . 4 6 6 m m o l ) ,

c e s i u m c a r b o n a t e ( 2 5 4 m g , 0 . 7 8 0 m m o l ) , a n d P d C l2( A m p h o s )2 ( 2 6 . 2 m g , 0 . 0 3 9 0 m m o l ) i n D M F ( 3 m L ) a n d w a t e r ( 0 . 3 m L ) w a s h e a t e d a t 1 0 0 ° C f o r 1 h u n d e r m i c r o w a v e i r r ad i a t i o n . T h e m ix t u r e w a s p o u r e d i n to w a t e r a n d ex t r a c t ed w i t h E t O A c . T h e o r g an i c l a y er w a s

76

s e p a r a t ed , w a s h ed w i t h w a t e r a n d b r i n e, d r i ed o v e r Mg S O4, a n d co n c e n tr a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i ed b y s i l i c a g e l c o lu m n c h r o m a t o g r a p h y ( h ex a n e / E t O A c = 8 0 /2 0 t o 0 / 1 0 0 ) a n d s o l i d i f i ed w i t h h ex a n e / E t O H t o g i v e 1 2 ( 1 2 4 m g , 8 2 % ) a s a w h i t e s o l id . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 1 . 2 4 –1 .5 0 ( m , 2 H ) , 1 .8 1–2 . 0 4 ( m , 2 H) , 2 .9 4–3 .2 4 ( m , 2 H) , 3 .5 7–3 . 8 1 ( m , 1 H ) , 3 .8 7 ( s , 3 H ) , 4 . 0 1–4 .3 9 ( m , 2 H) , 6 . 5 6 ( d , J = 8 .9 H z , 1 H) , 7 . 3 7 ( d , J = 7 .5 H z , 2 H) , 7 . 5 8–7 . 7 0 ( m , 4 H ) , 7 . 9 1 ( d , J = 0 .7 H z , 1 H ) , 8 . 1 9 ( s , 1 H ) , 8 . 3 8–8 .4 0 ( m , 1 H) . ^{1 3}C N M R ( 1 5 1 M H z , D M S O -d6) δ 3 0 . 9 , 3 1 . 7 , 3 8 . 6 , 4 0 . 4 , 4 5 . 9 , 4 7 .1 , 9 4 .5 , 1 0 8 .7 , 1 1 8 . 9 , 1 2 1 .1 , 1 2 4 .6 ( 2 C ) , 1 2 7 . 4 ( 2 C ) , 1 2 8 . 1 , 1 3 3 .3 , 1 3 3 .8 , 1 3 6 .2 , 1 3 8 .5 , 1 5 3 .0 , 1 5 9 . 1 , 1 6 8 . 9 . M S m/z 3 8 7 .3 ( M + H )⁺. A n a l . C a l c d f o r C2 2H2 2N6O : C , 6 8 . 3 8 ; H , 5 . 7 4 ; N , 2 1 .7 5 . F o u n d : C , 6 8 . 4 1 ; H , 5 . 6 1 ; N , 2 1 . 6 5 . X-r ay c r y s t a l s t r u c t u r e i s a v a i l a b l e ( C C D C 1 8 3 5 9 9 3 ) .

6 - ( ( 1 - ( 4 - ( 1 - m e t h y l - 1H- p y ra z o l - 4 - y l ) b e n z y l) p i p e r i d i n - 4 - y l) a m i n o ) n i c o t i n o n i t r i l e ( 1 3 ) . A m i x t u r e o f 3 4 ( 6 0 0 m g , 2 . 1 8 m m o l) , 4 - b r o m o b e n z y l b r o m i d e ( 5 4 5 m g , 2 . 1 8 m m o l ) , an d K2C O3 ( 1 . 5 1 g , 1 0 . 9 m m o l ) in D M F ( 1 5 m L ) w a s s t i r r ed a t 8 0 ° C o v e r n i g h t. T h e m ix t u r e w a s p o u r ed i n to w a t e r an d ex t r a c t ed w i t h E t O A c . T h e o r g an i c l a y e r w a s w a s h e d w i t h w a t e r a n d b r in e , d r i e d o v e r M g S O4, an d co n c en t r a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i ed b y N H s i l i c a g e l co l u m n c h r o m a to g r ap h y ( h ex a n e / E t O A c = 9 0 / 1 0 t o 0 / 1 0 0 ) t o g iv e 6 ( ( 1 ( 4 -b r o m o -b en z y l ) p i p e r i d in - 4 - y l ) am i n o ) n i c o t i n o n i t r i l e ( 7 8 0 m g , 9 6 % ) a s a w h i t e s o l id . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l3) δ 1 . 3 5–1 . 6 2 ( m , 2 H ) , 2 . 0 2 ( d d , J = 1 4 . 8 , 2 . 5 Hz , 2 H ) , 2 .1 1–2 . 2 7 ( m , 2 H) , 2 . 8 2 ( d , J = 1 2 . 2 H z , 2 H ) , 3 .4 7 ( s , 2 H ) , 3 .7 2 ( b r s , 1 H ) , 4 . 8 9 ( d , J = 6 .8 H z , 1 H ) , 6 . 3 4 ( d d , J = 8 . 8 , 0 .6 H z , 1 H ) , 7 . 2 0 ( d , J = 8 . 4 H z , 2 H ) , 7 . 4 4 ( d , J = 8 .4 H z , 2 H) , 7 .5 4 ( d d , J = 8 .8 , 2 . 2 H z , 1 H ) , 8 . 3 4 ( d d , J = 2 . 2 , 0 . 6 H z , 1 H ) . M S m/z 3 7 1 . 2 , 3 7 3 . 2 ( M + H )⁺.

C o m p o u n d 1 3 w a s p r e p ar e d f r o m co m p o u n d 6 ( ( 1 ( 4 b r o m o b e n z y l ) p ip e r i d in 4 y l) a m i n o ) n i co t i n o n i t r i l e an d 1 m e t h y l 4 ( 4 ,4 , 5 ,5 t e t r am e t h y l 1 , 3 , 2 d i o x a b o r o l an 2 y l ) -1 H- p y r a z o l e i n a s i m i l a r m an n e r t o t h a t d e s c r i b ed f o r c o m p o u n d 1 2 a n d o b t a i n ed in 6 1% y i e ld a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l3) δ 1 . 4 7 –1 . 6 4 ( m , 2 H) , 1 . 9 7–2 . 1 1 ( m , 2 H) , 2 .1 1–2 . 2 9 ( m , 2 H ) , 2 . 7 5–3 . 0 3 ( m , 2 H) , 3 . 5 3 ( s , 2 H ) , 3 .6 4–3 . 8 4 ( m , 1 H ) , 3 . 9 4 ( s , 3 H ) , 4 . 9 3 ( d , J = 7 . 3 H z , 1 H ) , 6 . 3 4 ( d d , J = 8 . 8 , 0 . 5 H z , 1 H ) , 7 . 3 0 (d , J = 8 . 4 H z, 2 H ) , 7 . 3 8– 7 . 4 6 ( m , 2 H ) , 7 . 5 4 ( d d , J = 8 . 8 , 2 .2 H z , 1 H ) , 7 . 6 0 ( s , 1 H ) , 7 . 7 5 ( d , J = 0 .6 H z, 1 H ) , 8 .3 4 ( d , J = 1 . 8 H z, 1 H) . ^{1 3}C N M R ( 1 5 1 M H z , D M S O -d6) δ 3 1 . 4 ( 2 C ) , 3 8 .6 , 4 7 .4 , 5 1 .8 ( 2 C ) , 6 1 . 8 , 9 4 .1 , 1 0 8 .8 , 1 1 9 . 0 , 1 2 1 . 7 , 1 2 4 . 7 ( 2 C ) , 1 2 7 . 5 , 1 2 9 . 2 ( 2 C ) , 1 3 1 . 2 , 1 3 5 .8 , 1 3 6 .1 , 1 3 8 . 3 ,

77

1 5 3 .1 , 1 5 9 .2 . M S m/z 3 7 3 .3 ( M + H )⁺. A n a l. C a l c d f o r C2 2H2 4N6· 0 . 7 5 H2O : C , 6 8 . 4 6 ; H , 6 . 6 6 ; N, 2 1 . 7 7 . F o u n d : C , 6 8 . 8 1 ; H , 6 . 6 5 ; N , 2 1 . 4 4 .

N- (t r a n s- 4 - ( ( 5 - C y a n o p y r i d i n - 2 - y l ) a m i n o ) c y c l o h ex y l ) -N- ( 4 - ( 1 - m et h y l - 1H p y ra z o l 4 -y l) p h e n -y l ) a c e t a m i d e ( 1 4 ) . T o a s o l u t io n o f 3 7 ( 5 5 0 m g , 1 . 4 8 m m o l) i n T H F ( 2 0 m L ) w er e a d d e d D I P E A ( 1 .2 9 m L , 7 .4 2 m m o l ) a n d a c e t y l c h l o r i d e ( 0 .3 1 7 m L , 4 . 4 5 m m o l ) a t 0 ° C . T h e m i x t u r e w a s s t i r r e d a t 0 ° C f o r 3 h . T h e m ix t u r e w a s p o u r ed i n t o w a t er a n d ex t r a c t e d w i t h E t O A c . T h e o r g a n i c l a y er w a s s e p ar a t e d , w a s h e d w i t h w a t e r a n d b r i n e, d r i e d o v er M g S O4, a n d c o n c e n t r a t e d . T h e r e s i d u e w a s s o l i d i f i ed w i t h h e x a n e / E t O A c t o g iv e t e r t -b u t y l (t r a n s- 4 - (N- ( 4 - ( 1 - m e t h y l - 1H- p y r a z o l - 4 - y l ) p h e n y l) a c e t a m i d o ) c y c lo h ex y l ) c ar b a m a t e ( 4 8 2 m g , 7 9 % ) a s a wh i t e s o l id . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l3) δ 1 . 0 9 –1 . 3 4 ( m , 4 H ) , 1 .4 0 ( s , 9 H) , 1 .7 7 ( s , 3 H ) , 1 . 8 5 ( d , J = 9 . 9 H z , 2 H ) , 1 .9 4–2 .0 6 ( m , 2 H ) , 3 . 0 7–3 .2 9 ( m , 1 H ) , 3 . 9 7 ( s , 3 H) , 4 . 2 4–4 .4 0 ( m , 1 H ) , 4 . 5 1–4 . 6 7 ( m , 1 H ) , 7 . 0 4 ( d , J = 8 .2 H z , 2 H ) , 7 . 4 8 ( d , J = 8 .2 H z , 2 H) , 7 . 6 4 ( s , 1 H ) , 7 . 7 8 ( s , 1 H ) . M S m/z 4 1 3 .2 ( M + H)⁺.

A m i x tu r e o f t e r t- b u ty l (t r a n s- 4 - (N- ( 4 - ( 1 - m e th y l - 1H p y r a z o l 4 -y l) p h en -y l ) a ce t a m i d o ) c -y c l o h e x -y l ) c a r b a m a t e ( 1 5 0 m g , 0 . 3 6 4 m m o l ) a n d T F A ( 2 . 2 4 m L , 2 9 . 1 m m o l) w a s s t i r r e d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 3 0 m in . T h e m i x t u r e w a s c o n c e n t r a t ed a n d a z eo t r o p e d w i t h t o lu e n e . T h e r e s i d u e w a s n e u tr a l i z e d w i t h s a t u r a t e d a q u eo u s N a H C O3, e x tr a c t e d w i th E t O A c / 2 - p r o p an o l ( 4 / 1 ) . T h e o r g an i c l a y er w a s s e p a r a t ed , w a s h ed w i t h w a t e r a n d b r i n e , d r i e d o v e r M g S O4, an d c o n c e n t r a t e d . A m ix t u r e o f t h e r e s i d u e , 6 -c h lo r o n i -c o t i n o n i t r i l e ( 5 5 . 6 m g , 0 .4 0 1 m m o l) , a n d D I P E A ( 0 . 3 1 8 m L , 1 . 8 2 m m o l ) in D M F ( 5 m L ) w a s s t i r r e d a t 1 2 0 ° C o v e r n i g h t . T h e m ix t u r e w a s p o u r e d i n t o w a t e r a n d e x tr a c t e d w i t h E t O A c . T h e o r g a n i c l a y er w a s s e p ar a t e d , w a s h e d w i t h w a t e r a n d b r i n e, d r i e d o v er M g S O4, an d co n c en t r a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i ed b y s i l i c a g e l co l u m n ch r o m a t o g r a p h y ( h e x an e / E t O A c = 2 0 / 8 0 to 0 / 1 0 0 ) an d s o l i d i f i e d w i t h h e x a n e / E t O A c t o g iv e 1 4 ( 2 9 m g , 1 9 % f o r 2 s t e p s ) a s a w h i t e s o l id . ¹H N M R ( 6 0 0 M H z, D M S O -d6) δ 1 . 1 0 –1 . 2 1 ( m , 2 H ) , 1 . 2 9–1 .3 8 ( m , 2 H ) , 1 . 6 6 ( s , 3 H ) , 1 .8 1 ( d , J = 1 1 .4 H z, 2 H) , 1 . 9 3 ( d , J = 1 1 . 0 H z , 2 H ) , 3 . 5 1 ( b r s , 1 H ) , 3 . 8 8 ( s , 3 H ) , 4 . 4 4 ( t t , J = 1 2 .0 , 3 .4 H z , 1 H ) , 6 . 4 8 ( d , J = 9 .2 H z , 1 H ) , 7 . 1 8 ( d , J = 8 .4 H z , 2 H ) , 7 . 4 6 ( d , J = 6 .2 H z , 1 H ) , 7 . 5 8–7 . 6 6 ( m , 3 H) , 7 .9 0 ( s , 1 H) , 8 .1 8 ( s , 1 H) , 8 . 2 9 ( d , J = 2 . 2 H z , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 1 5 1 M H z , D M S O -d6) δ 2 3 . 1 , 2 9 . 4 ( 2 C ) , 3 1 . 1 ( 2 C ) , 3 8 . 6 , 4 8 . 4 , 5 2 .3 , 9 4 . 0 , 1 1 9 . 0 , 1 2 1 .0 , 1 2 5 . 5 ( 2 C ) , 1 2 8 . 0 , 1 3 0 . 4 ( 2 C ) , 1 3 2 .5 , 1 3 6 . 2 ,

78

1 3 6 .9 , 1 5 3 . 0 , 1 5 9 .2 , 1 6 8 . 6 . 2 C w e r e n o t o b s e r v e d . M S m/z 4 1 5 .2 ( M + H )⁺. A n a l. C a l c d f o r C2 4H2 6N6O · 0 . 5 C4H8O2· H2O : C , 6 5 .5 3 ; H , 6 . 7 7 ; N , 1 7 .6 3 . F o u n d : C , 6 5 . 5 9 ; H , 6 . 4 6 ; N , 1 7 . 5 5 . P u r i t y 9 7 . 8 % ( H P L C ) . X-r a y cr y s t a l s t r u c tu r e i s a v a i l a b l e ( C C D C 1 8 3 5 9 9 4 ) .

N -(c i s- 4 - ( ( 5 - Cy a n o p y r i d i n - 2 - y l ) a m i n o ) cy c l o h e x y l ) -N -( 4 - ( 1 - m e t h y l - 1H p y r a z o l 4

-y l) p h e n -y l ) a c e t a m i d e ( 1 5 ) . t e r t- B u t y l (c i s- 4 - ( a c e t y l ( 4 - ( 1 - m e t h y l - 1H p y r a zo l 4 -y l) p h en -y l ) am i n o ) c -y c l o h ex -y l ) ca r b am a t e w a s p r e p a r e d f r o m co m p o u n d 3 9 an d a c e t y l c h lo r i d e i n a s i m i l a r m a n n e r t o th a t d e s c r i b ed f o r c o m p o u n d 1 4 an d o b t a in e d i n 8 9% y i e l d a s a w h i t e s o l id . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l3) δ 1 . 1 3 –1 .3 2 ( m , 2 H ) , 1 . 3 9 ( s , 9 H ) , 1 . 6 3–1 . 8 7 ( m , 9 H ) , 3 .7 8 ( b r s , 1 H ) , 3 . 9 8 ( s , 3 H ) , 4 . 4 0–4 . 6 9 ( m , 2 H ) , 7 . 0 8 ( d , J = 7 . 8 H z , 2 H ) , 7 . 5 2 ( d , J = 8 .1 H z , 2 H) , 7 . 6 6 ( s , 1 H) , 7 . 7 9 ( s , 1 H) . M S m/z 3 1 3 . 2 ( M – B o c + H )⁺.

C o m p o u n d 1 5 w a s p r e p a r e d f r o m t e r t- b u t y l ( c i s- 4 - ( a c e ty l ( 4 - ( 1 - m e t h y l - 1H p y r a z o l 4 -y l) p h en -y l ) am i n o ) c -y c l o h ex -y l ) ca r b am a t e a n d 6-f lu o r o n i c o t in o n i t r i l e i n a s i m i l a r m a n n er t o t h a t d e s c r i b ed f o r c o m p o u n d 2 1 a n d o b t a i n ed i n 8 2% y i e ld a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 1 .2 5 –1 . 4 5 ( m , 2 H ) , 1 .5 4–1 . 7 3 ( m , 7 H ) , 1 .8 9 ( d , J = 1 3 .4 H z , 2 H ) , 3 . 8 8 ( s , 3 H) , 3 .9 4 ( b r s , 1 H ) , 4 . 4 5 ( t , J = 1 1 . 5 H z , 1 H) , 6 .5 4 ( d , J = 8 . 9 H z , 1 H) , 7 .1 9 ( d , J = 7 . 9 H z , 2 H ) , 7 . 3 4 ( d , J = 5 . 5 H z, 1 H ) , 7 .5 6 ( d d , J = 9 .0 , 1 . 2 H z, 1 H ) , 7 . 6 3 ( d , J = 8 . 0 H z , 2 H) , 7 . 9 1 ( s , 1 H ) , 8 . 1 9 ( s , 1 H ) , 8 .3 3 ( d , J = 1 .7 H z , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 1 5 1 M H z, D M S O -d6) δ 2 3 . 1 , 2 5 . 8 ( 2 C ) , 2 8 . 8 ( 2 C ) , 3 8 .6 , 4 4 . 4 , 5 3 .1 , 9 4 . 1 , 1 0 8 . 9 , 1 1 9 . 0 , 1 2 1 .0 , 1 2 5 . 6 ( 2 C ) , 1 2 8 .0 , 1 3 0 . 5 ( 2 C ) , 1 3 2 .4 , 1 3 6 . 1 , 1 3 7 . 2 , 1 3 8 .0 , 1 5 2 .8 , 1 5 9 . 3 , 1 6 8 . 5 . M S m/z 4 1 5 . 2 ( M + H )⁺. A n a l. C a l c d f o r C2 4H2 6N6O : C , 6 9 .5 4 ; H , 6 . 3 2 ; N , 2 0 . 2 7 . F o u n d : C , 6 9 .3 6 ; H , 6 . 4 2 ; N , 1 9 . 9 8 . X - r a y cr y s t a l s t r u c t u r e i s a v a i l a b l e ( C C D C 1 8 3 5 9 9 9 ) .

N-(t r a n s-4-( ( 5-C y a n o p y r i d i n-2-y l ) a m i n o ) c y c l o h ex y l )-N-( 4-( 1-m e t h y l-1H-p y ra z o l-4 -y l) p h e n -y l ) m e t h a n e s u l f o n a m i d e ( 1 6 ) . T o a s o l u t i o n o f 3 7 ( 5 5 0 m g , 1 . 4 8 m m o l ) i n p y r i d in e ( 1 5 m L ) w a s a d d ed m e t h a n e s u lf o n y l ch l o r id e ( 1 .1 5 m L , 1 4 . 9 m m o l ) a t r o o m t e m p e r a t u r e . T h e m i x t u r e w a s s t i r r e d a t r o o m t e m p e r a t u r e o v e r n ig h t . T h e m ix t u r e w a s c o n c e n tr a t e d , p o u r e d i n to w a t e r a n d ex t r a c t e d w i t h E t O A c . T h e o r g a n i c l ay e r w a s s e p a r a t ed , w a s h ed w i t h w a t e r a n d b r i n e, d r i ed o v e r Mg S O4, a n d co n c e n tr a t e d . T h e r e s i d u e w a s s o l i d i f i e d w i t h h ex a n e / E t O A c t o g i v e t e r t- b u t y l (t r a n s- 4 - ( ( 4 - ( 1 - m e t h y l - 1H p y r a z o l 4 -y l) p h en -y l ) ( m e t h -y l s u l f o n -y l ) a m in o ) c-y c l o h ex -y l ) c a r b a m a t e ( 5 4 1 m g , 8 1 % ) a s a p a l e -y e l l o w s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l3) δ 1 .1 0 –1 . 3 8 ( m , 4 H ) , 1 .4 0 ( s , 9 H ) , 1 .9 2–2 .1 1 ( m , 4 H ) ,

79

2 . 9 6 ( s , 3 H ) , 3 . 0 6–3 . 3 1 ( m , 1 H) , 3 . 9 7 ( s , 3 H ) , 4 . 0 3–4 .2 2 ( m , 1 H ) , 4 .2 6–4 .3 9 ( m , 1 H ) , 7 .2 2 ( d , J = 8 . 3 H z , 2 H ) , 7 . 4 8 ( d , J = 8 .3 H z , 2 H) , 7 .6 2 ( s , 1 H ) , 7 . 7 6 ( s , 1 H ) . M S m/z 4 4 9 .2 ( M + H )⁺.

C o m p o u n d 1 6 w a s p r e p a r e d f r o m t e r t- b u ty l (t r a n s- 4 - ( ( 4 - ( 1 - m e t h y l - 1H p y r a z o l 4 -y l) p h en -y l ) ( m e t h -y l s u l f o n -y l ) a m in o ) c-y c l o h ex -y l ) c a r b a m a t e a n d 6-ch l o r o n i co t i n o n i t r i l e i n a s i m i l a r m a n n e r t o t h a t d e s c r ib e d f o r c o m p o u n d 1 4 a n d o b t a in e d i n 2 3% y i e l d f o r 2 s t e p s a s a p a l e y e l l o w s o l i d . ¹H N M R ( 6 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 1 . 2 0 –1 . 2 9 ( m , 2 H) , 1 . 3 2–1 . 4 3 ( m , 2 H) , 1 . 8 9–2 .0 1 ( m , 4 H) , 3 . 0 9 ( s , 3 H ) , 3 . 4 8 ( b r s , 1 H) , 3 .8 8 ( s , 3 H ) , 3 . 9 6 ( t t , J = 1 1 . 9 , 3 . 7 H z , 1 H ) , 6 .4 8 ( d , J = 8 . 8 H z, 1 H ) , 7 . 2 4 ( d , J = 8 . 4 H z , 2 H ) , 7 . 4 7 ( d , J = 7 . 0 H z , 1 H ) , 7 . 5 6–7 .6 5 ( m , 3 H ) , 7 .8 9 ( d , J = 0 . 7 H z, 1 H ) , 8 . 1 8 ( s , 1 H ) , 8 . 2 8 ( d , J = 2 . 2 H z , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 1 5 1 M H z , D M S O -d6) δ 3 0 . 8 ( 2 C ) , 3 1 . 0 ( 2 C ) , 3 8 .6 , 4 0 . 5 , 4 8 . 2 , 5 7 .0 , 9 4 . 0 , 1 1 9 .0 , 1 2 1 .0 , 1 2 5 . 3 ( 2 C ) , 1 2 8 .1 , 1 3 2 .4 ( 2 C ) , 1 3 2 .9 , 1 3 3 .1 , 1 3 6 . 2 , 1 3 8 . 4 , 1 5 3 . 0 , 1 5 9 .2 . 1 C w a s n o t o b s e r v e d . M S m/z 4 5 1 . 2 ( M + H )⁺. A n a l. C a l c d f o r C2 3H2 6N6O2S : C , 6 1 . 3 1 ; H , 5 . 8 2 ; N , 1 8 . 6 5 . Fo u n d : C , 6 1 .2 0 ; H , 5 . 7 4 ; N , 1 8 . 2 8 . X-r a y cr y s t a l s t r u c tu r e i s a v a i l a b l e ( C C D C 1 8 3 5 9 9 5 ) .

6 - ( (t r a n s- 4 - ( ( 4 - ( 1 - M e t h y l - 1H p y ra z o l 4

-y l) p h e n -y l ) a m i n o ) c -y c l o h e x -y l ) a m i n o ) n i c o t i n o n i t r i l e ( 1 7 ) . C o m p o u n d 1 7 w a s p r e p ar e d f r o m c o m p o u n d 3 7 a n d 6-f l u o r o n i co t i n o n i t r i l e in a s i m i l a r m an n e r t o t h a t d e s c r ib e d f o r c o m p o u n d 2 1 a n d o b t a i n ed i n 4 2% y i e l d a s a c o lo r l e s s s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 1 .1 2 –1 . 4 7 ( m , 4 H ) , 2 .0 0 ( t , J = 1 1 .7 H z , 4 H) , 3 .2 1 ( d , J = 7 . 4 H z , 1 H ) , 3 . 7 0–3 . 9 0 ( m , 4 H) , 5 .3 7 ( d , J = 8 .2 H z , 1 H) , 6 .4 7–6 .6 3 ( m , 3 H ) , 7 .2 4 ( d , J = 8 .3 H z , 2 H) , 7 .5 3 ( d , J = 7 . 2 H z, 1 H) , 7 . 5 9–7 . 7 1 ( m , 2 H ) , 7 . 8 5 ( s , 1 H ) , 8 . 3 8 ( d , J = 1 . 8 H z, 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 7 5 M H z , D M S O -d6) δ 3 1 . 4 ( 2 C ) , 3 1 .7 ( 2 C ) , 3 9 .0 , 4 9 .5 , 5 0 . 8 , 9 4 . 5 , 1 1 3 .2 ( 2 C ) , 1 1 9 . 7 , 1 2 0 .4 , 1 2 3 . 2 , 1 2 6 .4 ( 2 C ) , 1 2 6 . 5 , 1 3 5 . 5 , 1 3 8 . 9 , 1 4 6 . 9 , 1 5 3 . 7 , 1 5 9 . 8 . 1 C w a s n o t o b s e r v e d . M S m/z 3 7 3 .2 ( M + H )⁺. A n a l. C a l c d f o r C2 2H2 4N6: C , 7 0 . 9 4 ; H , 6 . 4 9 ; N , 2 2 . 5 6 . F o u n d : C , 7 0 .7 4 ; H, 6 . 3 2 ; N, 2 2 . 7 1 .

N -( 4 - ( 1 - M e t h y l -1 H -p y r a z o l - 4 - y l ) p h e n y l ) -N-(t r a n s 4 ( q u i n a z o l i n 2

-y la m i n o ) c -y c l o h ex -y l ) a c e t a m i d e ( 1 8 ) . A m i x t u r e o f t e r t- b u ty l (t r a n s- 4 - (N ( 4 ( 1 m e t h y l -1H- p y r a z o l - 4 - y l) p h en y l ) a c e t am i d o ) c y c l o h e x y l ) c a r b a m a t e ( 1 0 5 m g , 0 . 2 5 5 m m o l ) a n d T F A ( 1 . 5 7 m L , 2 0 . 4 m m o l) w a s s t i r r ed a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 1 5 m i n . T h e m i x tu r e w a s

80

c o n c e n tr a t e d a n d a z eo t r o p e d w i t h t o l u en e . T h e r e s i d u e w a s b a s i f i ed w i t h s a t u r a t ed a q u e o u s N a H C O3 a t r o o m t e m p er a t u r e a n d e x tr a c t e d w i t h E t O A c / 2 - p r o p a n o l ( 4 :1 ) . T h e o r g an i c l a y er w a s s e p ar a t e d , w a s h e d w i th w a t er a n d b r i n e , d r i e d o v e r Mg S O4 a n d c o n c e n tr a t e d . A m i x tu r e o f t h e r e s i d u e, 2 - ch l o r o q u i n a zo l i n e ( 6 2 . 8 m g , 0 . 3 8 1 m m o l ) , an d D B U ( 0 . 1 1 4 m L , 0 .7 6 2 m m o l ) i n D M F ( 3 m L ) w a s s t i r r e d a t 1 2 0 ° C f o r 4 h . T h e m i x t u r e w a s p o u r e d in t o w a t e r a t r o o m t em p e r a tu r e a n d e x tr a c t e d w i t h E t O A c . T h e o r g a n i c l a y er w a s s e p a r a t e d , w a s h e d w i t h w a t e r an d b r i n e , d r i e d o v e r M g S O4 a n d co n c en t r a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i e d b y N H s i l i c a g e l c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y ( h e x a n e / E t O A c = 9 5 /5 t o 0 /1 0 0 ) an d s o l i d i f i ed w i t h h ex a n e / E t O H to g iv e 1 8 ( 4 1 m g , 3 7 % ) a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 1 . 0 5 –1 .2 7 ( m , 2 H ) , 1 . 3 1–1 .5 4 ( m , 2 H) , 1 .6 7 ( s , 3 H ) , 1 .8 3 ( d , J = 1 1 .6 H z , 2 H ) , 1 . 9 9 ( d , J = 1 1 . 6 H z, 2 H ) , 3 .5 2–3 . 7 2 ( m , 1 H ) , 3 .8 9 ( s , 3 H ) , 4 . 4 6 ( t , J = 1 1 . 6 H z , 1 H ) , 7 .1 0–7 . 2 9 ( m , 4 H ) , 7 . 3 8 ( d , J = 8 . 4 H z , 1 H ) , 7 . 5 4–7 . 7 0 ( m , 3 H ) , 7 . 7 4 ( d , J

= 7 . 8 H z , 1 H ) , 7 . 9 3 ( s , 1 H) , 8 .2 1 ( s , 1 H ) , 9 . 0 5 ( s , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 7 5 M H z, D M S O -d6) δ 2 3 . 7 , 3 0 . 2 ( 2 C ) , 3 1 .7 ( 2 C ) , 4 9 .0 , 5 3 .0 , 1 1 2 . 0 , 1 2 1 .6 , 1 2 2 . 2 , 1 2 5 .2 , 1 2 6 . 1 ( 2 C ) , 1 2 8 . 3 , 1 2 8 .6 , 1 3 1 .1 ( 2 C ) , 1 3 3 . 0 , 1 3 4 .4 , 1 3 6 .8 , 1 3 7 .5 , 1 5 2 . 1 , 1 5 9 . 3 , 1 6 2 . 5 , 1 6 9 . 1 . 1 C w a s n o t o b s e r v ed . M S m/z 4 4 1 . 2 ( M + H )⁺. A n a l. C a l c d f o r C2 6H2 8N6O · 0 . 1 H2O : C , 7 0 .6 0 ; H , 6 .4 3 ; N , 1 9 .0 0 . Fo u n d : C , 7 0 . 5 1 ; H , 6 . 2 3 ; N , 1 8 . 9 3 .

M e t h y l (t r a n s-4-( ( 5-c y a n o p y r i d i n-2-y l ) a m i n o ) cy c l o h e x y l ) ( 4-( 1-m e t h y l-1 H-p y r a zo l-4 -y l) p h e n -y l ) c a r b a m a t e (1 9 ) . T o a s o l u t i o n o f 3 7 ( 3 0 0 m g , 0 . 8 0 9 m m o l ) a n d D I P E A ( 0 .4 2 3 m L , 2 . 4 3 m m o l ) i n C H2C l2 ( 5 m L ) w a s a d d ed m e t h y l c h l o r o f o r m a t e ( 0 . 3 3 6 m L , 4 . 3 4 m m o l ) a t r o o m t e m p er a t u r e . T h e m i x tu r e w a s s t i r r e d f o r 1 6 h a t r o o m t em p e r a tu r e . To t h e m ix t u r e w a s a d d ed w a t e r, a n d t h e m i x t u r e w a s e x t r a c t ed w i t h C H2C l2. T h e o rg a n i c l a y e r s w a s s e p ar a t e d , d r i ed o v er N a2S O4, a n d c o n c e n tr a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r if i e d b y s i l i c a g e l c o lu m n c h r o m a t o g r a p h y ( p e tr o l e u m e t h er / E t O A c = 3 / 1 t o 2 / 1 ) t o g iv e m e th y l (t r a n s 4 -( -(t e r t- b u t o x y c ar b o n y l ) a m in o ) cy c l o h ex y l ) ( 4 - ( 1 - m e th y l -1 H- p y r a z o l - 4 - y l ) p h en y l ) c ar b a m a t e ( 3 5 0 m g , 8 5 % ) a s a w h i t e s o l i d . M S m/z 4 2 9 . 2 ( M + H )⁺.

C o m p o u n d 1 9 w a s p r e p a r e d f r o m m e t h y l (t r a n s- 4 - ( (t e r t

-b u t o x y c a r -b o n y l ) a m in o ) c y c l o h ex y l ) ( 4 - ( 1 - m e th y l -1 H- p y r a z o l - 4 - y l ) p h e n y l) c a r b am a t e an d 6 -f lu o r o n i c o t in o n i t r i l e i n a s i m i l a r m an n e r to t h a t d e s c r ib e d f o r c o m p o u n d 2 1 a n d o b t a in e d i n 3 3% y i e l d f o r 2 s t e p s a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 4 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 1 .1 6–1 . 3 9 ( m ,

81

4 H) , 1 .8 1–1 .9 9 ( m , 4 H ) , 3 . 5 1–3 . 5 2 ( m , 4 H ) , 3 . 8 7 ( s , 3 H) , 4 . 0 2–4 .1 3 ( m , 1 H ) , 6 . 4 8 ( d , J = 8 . 8 H z , 1 H ) , 7 . 1 1 ( d , J = 8 . 4 H z , 2 H ) , 7 . 4 9 ( d , J = 6 . 4 H z , 1 H ) , 7 . 5 5 ( d , J = 8 . 4 H z , 2 H ) , 7 . 6 1 ( d , J = 8 .8 H z , 1 H ) , 7 . 8 7 ( s , 1 H ) , 8 .1 5 ( s , 1 H ) , 8 .3 0 ( d , J = 2 . 0 H z , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 1 5 1 M H z , D M S O -d6) δ 2 9 . 7 ( 2 C ) , 3 1 .0 ( 2 C ) , 3 8 .6 , 4 8 . 4 , 5 2 . 3 , 5 5 .5 , 9 4 .0 , 1 0 8 .8 , 1 1 9 .0 , 1 2 1 .2 , 1 2 5 . 2 ( 2 C ) , 1 2 7 . 9 , 1 3 0 .2 ( 2 C ) , 1 3 1 .8 , 1 3 5 . 9 , 1 3 6 .1 , 1 3 8 . 3 , 1 5 3 .0 , 1 5 5 . 1 , 1 5 9 . 2 . M S m/z 4 3 1 . 2 ( M + H )⁺. A n a l. C a l c d f o r C2 4H2 6N6O2· H2O : C , 6 4 . 2 7 ; H , 6 . 2 9 ; N , 1 8 .7 4 . F o u n d : C , 6 4 .4 9 ; H , 6 . 3 7 ; N, 1 8 . 8 2 .

1 - (t r a n s -4 - ( ( 5 - Cy a n o p y r i d i n - 2 - y l ) a m i n o ) c y c l o h ex y l ) - 3 - e t hy l - 1 - ( 4 - ( 1 - m et h y l -1 H

-p y ra z o l - 4 - y l ) -p h e n y l ) u r ea ( 2 0 ) . T o a s o lu t i o n o f 3 7 ( 3 0 0 m g , 0 . 8 0 9 m m o l ) in T H F ( 1 0 m L ) w a s a d d e d e th y l i s o cy a n a t e ( 0 .0 7 7 m L , 0 .9 7 2 m m o l) a t r o o m t e m p er a t u r e. T h e m ix t u r e w a s s t i r r e d a t r o o m t e m p er a t u r e f o r 6 0 h . T h e p r e c i p i t a t e s o l i d w a s c o l l e c t e d b y f i l t r a t io n t o g i v e t e r t- b u t y l (t r a n s- 4 - ( ( e t h y l c a r b am o y l) ( 4 - ( 1 - m e th y l - 1H p y r a z o l 4 -y l) p h e n -y l ) am i n o ) c -y c l o h ex -y l ) ca r b am a t e ( 2 1 0 m g , 5 3 % ) a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 4 0 0 M H z , C D C l3) δ 1 . 0 0 ( t , J = 7 . 2 H z , 3 H ) , 1 . 1 7–1 . 2 9 ( m , 4 H ) , 1 . 4 1 ( s , 9 H) , 1 .8 8 ( d , J = 1 2 .0 H z , 2 H ) , 1 .9 8 ( d , J = 1 2 . 0 H z , 2 H) , 3 . 1 4–3 . 2 0 ( m , 3 H ) , 3 . 9 1 ( t , J = 5 . 6 H z, 1 H) , 3 . 9 8 ( s , 3 H) , 4 . 3 4–4 .3 6 ( m , 1 H ) , 4 . 4 5–4 . 5 2 ( m , 1 H ) , 7 . 1 0 ( d , J = 8 .4 H z , 2 H ) , 7 . 5 0 ( d , J = 8 .4 H z , 2 H) , 7 . 6 5 ( s , 1 H ) , 7 . 7 9 ( d , J = 0 .4 H z , 1 H ) . M S m/z 4 4 2 .3 ( M + H )⁺.

A m i x t u r e o f t e r t- b u t y l (t r a n s- 4 - ( ( e t h y l c a r b am o y l) ( 4 - ( 1 - m e th y l - 1H p y r a z o l 4 -y l) p h en -y l ) am i n o ) c -y c l o h ex -y l ) ca r b am a t e ( 2 2 0 m g , 0 . 4 9 8 m m o l ) a n d 4 M H C l i n d i o x a n e ( 1 0 m L , 4 0 .0 m m o l ) w a s s t i r r e d a t r o o m t e m p e r a tu r e f o r 2 h , a n d th e n t h e m ix t u r e w a s c o n c e n tr a t e d . T o a s o l u t io n o f th e r e s i d u e a n d 6-b r o m o n i c o t i n o n i t r i l e ( 1 6 7 m g , 0 . 9 1 3 m m o l ) i n D M F ( 1 0 m L ) w a s a d d e d c e s i u m c ar b o n a t e ( 5 9 5 m g , 1 . 8 3 m m o l) a t r o o m t e m p e r a t u r e . T h e m i x tu r e w a s s t i r r ed a t 1 0 0 ° C f o r 6 h . I n s o l u b l e m a t e r i a l s w er e f i l t e r e d o f f , a n d t h e f i l t r a t e w a s c o n c e n t r a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i e d b y p r ep a r a t i v e H P L C (0 . 0 2 2 5 % aq u e o u s f o r m i c a c id s o l u t i o n / M e C N = 5 4 / 4 6 t o 2 4 / 7 6) t o g iv e 2 0 ( 3 9 m g , 1 5 % f o r 2 s t e p s ) a s a b r o w n s o l id . ¹H N M R ( 6 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 0 . 9 1 ( t , J = 7 . 0 H z , 3 H) , 1 . 0 7–1 .1 7 ( m , 2 H) , 1 . 2 7–1 .3 8 ( m , 2 H) , 1 . 7 9 ( d , J = 1 1 . 4 H z , 2 H ) , 1 .9 1 ( d , J = 1 1 .0 H z, 2 H) , 2 . 9 4–3 . 0 3 ( m , 2 H ) , 3 . 4 9 ( b r s , 1 H) , 3 . 8 8 ( s , 3 H ) , 4 .2 3 - 4 . 3 2 ( m , 1 H) , 5 . 1 2 ( t , J = 5 . 7 H z , 1 H ) , 6 .4 7 ( d , J = 8 . 8 H z, 1 H ) , 7 . 1 0 ( d , J = 8 . 1 H z , 2 H ) , 7 . 4 6 ( d , J = 5 . 5 H z , 1 H ) , 7 . 5 8–7 .6 4 ( m , 3 H ) , 7 . 8 9 ( s , 1 H ) , 8 .1 6 ( s , 1 H ) , 8 . 2 8 ( d , J = 2 . 2 H z , 1 H) . ^{1 3}C N M R ( 1 5 1

82

M H z , D M S O -d6) δ 1 5 . 6 , 3 0 . 1 ( 2 C ) , 3 1 . 3 ( 2 C ) , 3 4 . 8 , 3 8 .6 , 4 8 . 5 , 5 2 .9 , 9 3 . 9 , 1 0 8 . 9 , 1 1 9 .0 , 1 2 1 .3 , 1 2 5 . 7 ( 2 C ) , 1 2 7 . 9 , 1 3 1 .4 ( 2 C ) , 1 3 2 .1 , 1 3 5 . 8 , 1 3 6 .1 , 1 3 8 . 3 , 1 5 3 .0 , 1 5 6 . 3 , 1 5 9 . 2 . M S m/z 4 4 4 . 2 ( M + H )⁺. A n a l. C a l c d f o r C2 5H2 9N7O · 0 . 5 H2O : C , 6 6 . 3 5 ; H , 6 . 6 8 ; N , 2 1 .6 7 . F o u n d : C , 6 6 .1 9 ; H , 6 . 6 4 ; N, 2 1 . 9 0 .

N -(t r a n s- 4 - ( ( 5 - c y a n o p y r i d i n - 2 - y l ) a m i n o ) c y c l o h ex y l ) -N-( 4 - ( 1 - m et h y l -1 H p y ra z o l 4 -y l) p h e n -y l ) - 3 - p h e n -y l p r o p a na m i d e ( 2 1 ) . t e r t- B u t y l (t r a n s- 4 - ( ( 4 - ( 1 - m e th y l - 1H p y r a z o l 4 -y l) p h en -y l ) ( 3 - p h en -y l p r o p an o -y l ) a m i n o ) c -y c l o h ex -y l) c a r b am a t e w a s p r e p a r ed f r o m c o m p o u n d 3 7 a n d 3 - p h e n y lp r o p i o n y l c h lo r i d e in a s i m i l a r m a n n e r to t h a t d e s c r i b ed f o r co m p o u n d 1 4 a n d o b t a i n ed in 8 6% y i e l d a s a w h i t e s o l id . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 0 .9 1–1 . 1 1 ( m , 2 H) , 1 . 2 5 ( d , J = 1 2 . 7 H z , 2 H ) , 1 . 3 4 ( s , 9 H ) , 1 . 6 6–1 .8 3 ( m , 4 H) , 2 . 1 2 ( t , J = 7 . 6 H z , 2 H ) , 2 . 7 3 ( t , J = 7 .6 H z , 2 H ) , 2 . 9 4 ( b r s , 1 H ) , 3 . 8 6 ( s , 3 H) , 4 .3 7 ( t, J = 1 1 . 6 H z , 1 H ) , 6 . 6 7 ( d , J

= 8 .0 H z , 1 H ) , 7 . 0 1 ( t , J = 7 . 7 H z , 4 H ) , 7 .0 8–7 . 2 5 ( m , 3 H ) , 7 . 5 6 ( d , J = 8 . 1 H z , 2 H ) , 7 .8 7 ( s , 1 H ) , 8 . 1 5 ( s , 1 H ) . M S m/z 5 2 5 . 3 ( M + N a )⁺.

A m i x t u r e o f te r t- b u t y l (t r a n s- 4 - ( ( 4 - ( 1 - m e t h y l - 1H p y r a zo l 4 y l ) p h e n y l ) ( 3 -p h e n y l -p r o -p a n o y l ) am i n o ) cy c l o h e x y l ) c a r b am a t e ( 1 7 0 m g , 0 .3 3 8 m m o l ) a n d 4 M H C l i n E t O A c ( 2 . 0 m L , 8 . 0 0 m m o l ) w a s s t i r r e d a t r o o m t e m p er a t u r e. A f t e r b e in g s t i r r e d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 2 h , t h e m i x t u r e w a s c o n ce n t r a t e d . A m i x t u r e o f t h e r e s i d u e , 6 -f lu o r o n i c o t in o n i t r i l e ( 1 2 4 m g , 1 .0 1 m m o l ) , a n d D I P E A ( 0 .2 9 5 m L , 1 . 6 9 m m o l ) i n N M P ( 2 m L ) w a s s t i r r e d a t 8 0 ° C o v e r n ig h t . T h e m i x t u r e w a s p o u r e d i n t o w a t e r a n d e x t r a c t e d w i t h E t O A c . T h e o r g an i c l a y e r w a s s e p a r a t e d , w a s h e d w i t h w a t e r an d b r i n e , d r i e d o v e r N a2S O4, a n d co n c en t r a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i e d b y s i l i c a g e l co l u m n c h r o m a t o g r a p h y ( h e x an e / E t O A c = 8 0 /2 0 t o 2 0 / 8 0 ) to g i v e 2 1 ( 1 3 0 m g , 7 6 % ) a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 6 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 1 .0 8 –1 . 1 7 ( m , 2 H ) , 1 . 2 8–1 . 4 0 ( m , 2 H ) , 1 . 7 8 ( d , J = 1 1 . 4 H z , 2 H ) , 1 . 9 3 ( d , J = 1 1 .4 H z , 2 H) , 2 . 1 5 ( t , J = 7 .7 H z , 2 H ) , 2 .7 5 ( t, J = 7 . 5 H z , 2 H) , 3 . 5 0 ( b r s , 1 H) , 3 .8 7 ( s , 3 H ) , 4 . 4 7 ( t t , J = 1 2 .1 , 3 .5 H z , 1 H ) , 6 . 4 8 ( d , J = 9 .2 H z , 1 H ) , 6 . 9 9–7 .0 7 ( m , 4 H) , 7 . 1 0–7 .1 6 ( m , 1 H ) , 7 . 1 8–7 . 2 3 ( m , 2 H ) , 7 . 4 6 ( d , J = 5 .9 H z , 1 H ) , 7 . 5 7 ( d , J = 8 . 4 H z , 2 H) , 7 .6 0 ( d d , J = 9 .0 , 1 . 7 H z , 1 H ) , 7 . 8 8 ( s , 1 H) , 8 .1 6 ( s , 1 H ) , 8 . 2 8 ( d , J = 2 . 2 H z , 1 H ) .

1 3C N M R ( 1 5 1 M H z , D M S O -d6) δ 2 9 . 4 ( 2 C ) , 3 0 . 9 , 3 1 . 1 ( 2 C ) , 3 6 .3 , 3 8 . 6 , 4 8 . 4 , 5 2 . 5 , 9 4 . 0 , 1 0 8 .8 , 1 1 9 . 0 , 1 2 0 .9 , 1 2 5 . 5 ( 2 C ) , 1 2 5 .8 , 1 2 8 . 0 , 1 2 8 . 1 ( 2 C ) , 1 2 8 .1 ( 2 C ) , 1 3 0 .5 ( 2 C ) , 1 3 2 . 5 , 1 3 6 .1 , 1 3 6 .2 , 1 3 8 . 3 , 1 4 1 . 1 , 1 5 3 .0 , 1 5 9 .2 , 1 7 0 . 3 . M S m/z 5 0 5 . 3 ( M + H )⁺. A n a l. C a l c d f o r

83

C3 1H3 2N6O · 0 . 5 C6H1 4O · 0 . 5 H2O : C , 7 2 . 3 1 ; H , 7 .1 4 ; N , 1 4 . 8 8 . F o u n d : C , 7 2 . 5 3 ; H , 7 . 2 9 ; N , 1 5 . 2 0 . P u r i t y 9 8 . 8 % ( H P L C ) . X-r a y cr y s t a l s t r u c tu r e i s a v a i l a b l e ( C C D C 1 8 3 5 9 9 6 ) .

B e n z y l (t r a n s- 4 - ( ( 5 - c y a n o p y r i d i n - 2 - y l ) a m i n o ) cy c l o h e x y l ) ( 4 - ( 1 - m e t h y l -1 H p y r a zo l 4 -y l) p h e n -y l ) c a r b a m a t e ( 2 2 ) . B e n z y l (t r a n s- 4 - ( (t e r t b u t o x y c ar b o n y l ) a m in o ) cy c l o h ex y l ) ( 4 -( 1 - m e th y l -1 H -p y r a z o l - 4 - y l ) p h e n y l ) c a r b a m a t e w a s p r e p a r ed f r o m c o m p o u n d 3 7 an d b e n zy l c h lo r o f o r m a t e i n a s i m i l a r m a n n er t o t h a t d e s c r ib e d f o r c o m p o u n d 1 9 a n d o b t a i n e d in 6 2% y i e ld a s a w h i t e s o l id . M S m/z 4 4 9 . 2 ( M + H )⁺.

C o m p o u n d 2 2 wa s p r ep a r e d f r o m b en z y l (t r a n s 4 ( (t e r t

-b u t o x y c a r -b o n y l ) a m in o ) c y c l o h ex y l ) ( 4 - ( 1 - m e th y l -1 H -p y r a z o l - 4 - y l ) p h e n y l) c a r b am a t e an d 6 -f lu o r o n i c o t in o n i t r i l e i n a s i m i l a r m an n e r to t h a t d e s c r ib e d f o r c o m p o u n d 2 1 a n d o b t a in e d i n 3 7% y i e l d f o r 2 s t e p s a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 6 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 1 .2 0 –1 . 4 3 ( m , 4 H) , 1 .8 1–2 . 0 3 ( m , 4 H ) , 3 . 5 4 ( b r s , 1 H ) , 3 . 8 7 ( s , 3 H) , 4 .0 6–4 . 1 4 ( m , 1 H ) , 5 .0 5 ( s , 2 H ) , 6 . 4 8 ( d , J = 8 . 8 H z , 1 H ) , 7 .1 4 ( d , J = 8 . 4 H z, 2 H) , 7 . 1 7–7 .2 4 ( m , 2 H ) , 7 . 2 3–7 . 2 9 ( m , 1 H ) , 7 . 2 9–7 .3 4 ( m , 2 H ) , 7 . 4 6 ( d , J = 5 . 5 H z , 1 H ) , 7 . 5 7 ( d , J = 8 . 4 H z , 2 H ) , 7 .6 1 ( d d , J = 8 . 8 , 1 . 5 H z , 1 H ) , 7 .8 7 ( b r s , 1 H ) , 8 . 1 4 ( s , 1 H ) , 8 . 3 0 ( d , J = 2 . 2 H z , 1 H ) .^{1 3}C N M R ( 1 5 1 M H z , D M S O -d6) δ 2 9 . 7 ( 2 C ) , 3 1 . 0 ( 2 C ) , 3 8 . 6 , 4 8 .4 , 5 5 . 7 , 6 5 .9 , 9 4 . 0 , 1 0 8 . 9 , 1 1 9 .0 , 1 2 1 .2 , 1 2 5 . 1 ( 2 C ) , 1 2 6 . 8 ( 2 C ) , 1 2 7 .5 , 1 2 7 . 9 , 1 2 8 .2 ( 2 C ) , 1 3 0 . 1 ( 2 C ) , 1 3 1 . 9 , 1 3 5 . 8 , 1 3 6 .1 , 1 3 7 .0 , 1 3 8 .4 , 1 5 3 .0 , 1 5 4 .4 , 1 5 9 .2 . M S m/z 5 0 7 .2 ( M + H )⁺. A n a l. C a l c d f o r C3 0H3 0N6O2· 0 .5 H2O : C , 6 9 . 8 8 ; H , 6 . 0 6 ; N , 1 6 . 3 0 . F o u n d : C , 6 9 . 5 4 ; H , 6 . 1 2 ; N , 1 6 .4 4 . X-r a y c r y s t a l s t r u c t u r e i s a v a i l a b l e ( C C D C 1 8 3 5 9 9 7 ) .

3 - B e n z y l - 1 - (t r a n s 4 ( ( 5 c y a n o p y r i d i n 2 y l) a m i n o ) c y c lo h e x y l ) 1 ( 4 ( 1 m e t h y l 1 H

-p y ra z o l - 4 - y l ) -p h e n y l ) u r ea ( 2 3 ) . T o a s o l u t io n o f 3 7 ( 5 0 0 m g , 1 . 3 5 m m o l ) an d E t3N ( 0 . 5 6 3 m L , 4 .0 5 m m o l ) in T H F ( 1 2 m L ) w a s a d d ed b e n z y l i s o c y an a t e ( 0 . 5 0 0 m L , 4 . 0 5 m m o l ) a t r o o m t em p e r a tu r e . T h e m ix t u r e w a s s t i r r e d a t r o o m t em p e r a tu r e o v e r n i g h t. T h e m i x t u r e w a s p o u r e d i n t o w a t e r a t r o o m t e m p er a t u r e. T h e r e s u l t a n t p r e c i p i t a t e d s o l i d w a s c o l l e c t e d b y f i l t r a t io n . T h e r e s u l t a n t c o l o r l e s s s o l i d w a s d i s s o l v ed i n T H F an d p u r i f i e d b y N H s i l i c a g e l c o lu m n ch r o m a t o g r a p h y ( h ex a n e / E t O A c = 9 0 /1 0 t o 0 / 1 0 0 ) a n d s o l i d i f i e d w i t h h ex a n e / E t O A c to g i v e t e r t- b u t y l (t r a n s- 4 - ( ( b en z y l c ar b a m o y l ) ( 4 - ( 1 - m e th y l - 1H p y r a z o l 4 -y l) p h en -y l ) am i n o ) c -y c l o h ex -y l ) ca r b am a t e ( 6 1 0 m g , 9 0 % ) a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 0 . 9 4 –1 . 1 6 ( m , 2 H ) , 1 . 1 7–1 . 3 1 ( m , 2 H ) , 1 . 3 4 ( s , 9 H ) , 1 . 7 5 ( d , J = 1 0 .1

84

H z , 4 H ) , 2 .8 3–3 .0 2 ( m , 1 H ) , 3 . 8 7 ( s , 3 H ) , 4 . 0 7–4 . 2 7 ( m , 3 H ) , 5 . 7 7 ( t , J = 5 . 6 H z, 1 H ) , 6 . 6 6 ( d , J = 7 . 3 H z , 1 H ) , 7 .0 9–7 .2 0 ( m , 5 H ) , 7 .2 2–7 . 3 1 ( m , 2 H) , 7 . 6 2 ( d , J = 8 .1 H z , 2 H ) , 7 . 8 8 ( s , 1 H ) , 8 . 1 6 ( s , 1 H ) . M S m/z 5 0 4 .3 ( M + H )⁺.

C o m p o u n d 2 3 w a s p r e p a r ed f r o m t e r t- b u t y l (t r a n s- 4 - ( ( b e n zy l c a r b a m o y l ) ( 4 - ( 1 - m e t h y l - 1 H-p y r a zo l - 4 - y l ) H-p h e n y l ) a m i n o ) c y c lo h ex y l ) c ar b a m a t e a n d 6-f l u o r o n i co t i n o n i t r i l e i n a s i m i l a r m an n e r t o th a t d e s c r i b e d f o r c o m p o u n d 2 1 a n d o b t a i n e d i n 8 2% y i e l d a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 1 .0 2 –1 . 2 3 ( m , 2 H ) , 1 .2 5–1 .4 3 ( m , 2 H ) , 1 . 8 1 ( d , J = 1 0 .1 H z , 2 H) , 1 . 9 2 ( d , J = 1 1 . 3 H z, 2 H ) , 3 . 5 0 ( b r s , 1 H ) , 3 .8 7 ( s , 3 H ) , 4 .1 5 ( d , J = 6 . 0 H z , 2 H ) , 4 . 2 9 ( t , J = 1 1 . 5 H z, 1 H ) , 5 . 8 1 ( t , J = 5 . 9 H z , 1 H) , 6 .4 7 ( d , J = 9 . 1 H z , 1 H ) , 7 . 0 9–7 .2 1 ( m , 5 H) , 7 .2 4–7 . 3 4 ( m , 2 H ) , 7 . 4 6 ( d , J = 7 .2 H z , 1 H ) , 7 . 5 7–7 . 6 6 ( m , 3 H ) , 7 . 8 9 ( s , 1 H ) , 8 .1 7 ( s , 1 H) , 8 .2 8 ( d , J = 1 . 6 H z , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 1 5 1 M H z , D M S O -d6) δ 3 0 . 1 ( 2 C ) , 3 1 . 3 ( 2 C ) , 3 8 . 6 , 4 3 . 4 , 4 8 . 5 , 5 3 . 1 , 9 3 . 9 , 1 0 9 .0 , 1 1 9 . 0 , 1 2 1 .2 , 1 2 5 .7 ( 2 C ) , 1 2 6 .1 , 1 2 6 .6 ( 2 C ) , 1 2 7 .8 6 , 1 2 7 .9 1 ( 2 C ) , 1 3 1 . 4 ( 2 C ) , 1 3 2 . 2 , 1 3 5 . 6 , 1 3 6 . 1 , 1 3 8 .3 , 1 4 1 .2 , 1 5 3 . 0 , 1 5 6 . 4 , 1 5 9 . 2 . M S m/z 5 0 6 .3 ( M + H )⁺. A n a l . C a l c d f o r C3 0H3 1N7O : C , 7 1 . 2 6 ; H , 6 . 1 8 ; N , 1 9 .3 9 . F o u n d : C , 7 1 . 0 7 ; H , 6 . 2 4 ; N , 1 9 . 4 0 . X-r ay c r y s t a l s t r u c t u r e i s a v a i l a b l e ( C C D C 1 8 3 5 9 9 8 . )

1 - (t r a n s 4 ( ( 5 Cy a n o p y r i d i n 2 y l ) a m i n o ) c y c l o h ex y l ) 3 ( cy c l o h e x y l m e t h y l ) 1 ( 4 ( 1 -m e t h y l -1 H -p y ra z o l - 4 - y l) p h e n y l ) u r e a ( 2 4 ) . t e r t-B u t y l (t r a n s-4 -( -( -( c y c lo h ex y l m e t h y l ) c a r b a m o y l ) -( 4-( 1-m e t h y l-1H-p y r a zo l-4

-y l) p h en -y l ) am i n o ) c -y c l o h ex -y l ) ca r b am a t e w a s p r e p a r e d f r o m c o m p o u n d 3 7 an d c y c l o h ex a n e m e th y l i s o c y a n a t e i n a s i m i l a r m a n n e r t o t h a t d e s c r ib e d f o r co m p o u n d 2 3 an d o b t a i n e d i n 6 9% y i e l d a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 0 . 6 0 –0 . 8 4 ( m , 2 H) , 0 .9 0–1 . 3 1 ( m , 8 H ) , 1 . 3 4 ( s , 9 H ) , 1 . 4 4–1 . 6 6 ( m , 5 H ) , 1 . 6 6–1 .8 3 ( m , 4 H ) , 2 . 7 9 ( t , J = 6 . 1 H z , 2 H ) , 2 . 8 6–3 . 0 3 ( m , 1 H ) , 3 . 8 7 ( s , 3 H ) , 4 .1 6 ( t , J = 1 1 . 8 H z , 1 H) , 4 .9 6 ( t , J = 5 .6 H z , 1 H ) , 6 . 6 5 ( d , J = 7 . 4 H z , 1 H) , 7 . 0 7 ( d , J = 8 . 0 H z , 2 H ) , 7 .6 1 ( d , J = 8 . 1 H z , 2 H) , 7 . 8 9 ( s , 1 H ) , 8 . 1 7 ( s , 1 H ) . M S m/z 5 1 0 . 4 ( M + H )⁺.

C o m p o u n d 2 4 w a s p r e p ar e d f r o m t e r t-b u t y l (t r a n s-4-( ( ( cy c l o h ex y l m e th y l ) c ar b a m o y l ) ( 4 -( 1-m e th y l-1H-p y r a z o l-4-y l ) p h e n y l ) a m in o ) cy c l o h e x y l ) c a r b a m a t e an d 6 -f lu o r o n i c o t in o n i t r i l e i n a s i m i l a r m an n e r to t h a t d e s c r ib e d f o r c o m p o u n d 2 1 a n d o b t a in e d i n 4 8% y i e l d a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 0 .6 1 –0 . 8 2 ( m , 2 H ) , 0 .9 5– 1 . 2 0 ( m , 5 H ) , 1 . 2 3–1 . 4 1 ( m , 3 H ) , 1 . 4 4–1 . 6 7 ( m , 5 H ) , 1 .7 9 ( d , J = 1 0 .9 H z , 2 H ) , 1 .9 1 ( d , J

85

= 1 0 .3 H z , 2 H ) , 2 . 8 0 ( t , J = 6 . 1 H z, 2 H ) , 3 . 4 9 ( b r s , 1 H) , 3 . 8 8 ( s , 3 H ) , 4 . 2 6 ( t , J = 1 1 .8 H z , 1 H) , 5 . 0 0 ( t , J = 5 . 7 H z , 1 H ) , 6 .4 7 ( d , J = 8 . 9 H z , 1 H ) , 7 .1 0 ( d , J = 8 . 2 H z , 2 H ) , 7 .4 6 ( d , J = 7 . 8 H z, 1 H) , 7 . 5 5–7 . 6 7 ( m , 3 H) , 7 . 9 0 ( s , 1 H) , 8 . 1 8 ( s , 1 H ) , 8 . 2 8 ( d , J = 1 .9 H z , 1 H ) .

1 3C N M R ( 7 5 M H z , D M S O -d6) δ 2 5 . 9 ( 2 C ) , 2 6 . 7 , 3 0 .7 ( 2 C ) , 3 0 . 8 ( 2 C ) , 3 1 . 8 ( 2 C ) , 3 8 . 3 , 4 6 . 7 , 4 9 . 1 , 5 3 . 5 , 9 4 . 5 , 1 1 9 .6 , 1 2 1 . 8 , 1 2 6 . 2 ( 2 C ) , 1 2 8 . 5 , 1 3 1 . 9 ( 2 C ) , 1 3 2 .7 , 1 3 6 . 3 , 1 3 6 . 7 , 1 3 8 .9 , 1 5 3 . 6 , 1 5 6 .9 , 1 5 9 . 7 . 2 C w e r e n o t o b s e r v e d . M S m/z 5 1 2 .4 ( M + H )⁺. A n a l. C a l c d f o r C3 0H3 7N7O : C , 7 0 . 4 2 ; H, 7 .2 9 ; N , 1 9 . 1 6 . F o u n d : C , 7 0 . 4 2 ; H , 7 .3 0 ; N , 1 9 .2 3 .

3 - B e n z y l - 1 - (c i s- 4 - ( ( 5 - c y a n o p y r i d i n - 2 - y l ) a m i n o ) c y c l o h ex y l ) - 1 - ( 4 - ( 1 - m e t h y l - 1H p y ra z o l -4 - y l ) p h e n y l ) u r e a ( 2 5 ) . t e r t- B u t y l (c i s- 4 - ( ( b e n z y l c a r b a m o y l ) ( 4 - ( 1 - m e th y l - 1H p y r a z o l 4 -y l) p h en -y l ) am i n o ) c -y c l o h ex -y l ) ca r b am a t e w a s p r e p a r e d f r o m c o m p o u n d 3 9 a n d b en z y l i s o c y an a t e i n a s i m i l a r m a n n e r to t h a t d e s c r i b ed f o r c o m p o u n d 2 3 a n d o b t a i n ed i n 6 8% y i e ld a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 1 .3 2 ( s , 9 H ) , 1 . 3 4–1 . 5 8 ( m , 6 H ) , 1 . 7 1 ( d , J = 1 3 .5 H z , 2 H ) , 3 . 4 6 ( b r s , 1 H ) , 3 . 8 7 ( s , 3 H ) , 4 . 1 0–4 . 2 7 ( m , 3 H ) , 5 . 6 7 ( t , J = 6 .0 H z , 1 H ) , 6 .6 3 ( b r s , 1 H ) , 7 .1 0–7 . 2 0 ( m , 5 H) , 7 . 2 2–7 . 3 1 ( m , 2 H ) , 7 . 6 2 ( d , J = 8 . 3 H z , 2 H ) , 7 . 8 9 ( s , 1 H ) , 8 . 1 6 ( s , 1 H ) . M S m/z 5 2 6 .2 ( M + N a )⁺.

C o m p o u n d 2 5 w a s p r e p ar e d f r o m t e r t- b u t y l (c i s- 4 - ( ( b e n zy l c a r b a m o y l) ( 4 - ( 1 - m e t h y l - 1 H-p y r a zo l - 4 - y l ) H-p h e n y l ) a m i n o ) c y c lo h ex y l ) c ar b a m a t e a n d 6-f l u o r o n i c o t i n o n i t r i l e i n a s i m i l a r m an n e r t o th a t d e s c r i b e d f o r c o m p o u n d 2 1 a n d o b t a i n e d i n 5 2% y i e l d a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 1 .2 7–1 . 4 6 ( m , 2 H ) , 1 . 5 2–1 . 7 2 ( m , 4 H ) , 1 . 8 9 ( d , J = 1 2 .1 H z , 2 H) , 3 . 8 7 ( s , 3 H ) , 3 .9 3 ( b r s , 1 H ) , 4 . 1 5 ( d , J = 6 . 1 H z , 2 H) , 4 . 2 7 ( t , J = 1 1 .7 H z , 1 H ) , 5 . 7 1 ( t , J = 5 . 9 H z , 1 H) , 6 . 5 4 ( d , J = 8 .9 H z , 1 H ) , 7 . 1 1–7 .2 1 ( m , 5 H ) , 7 . 2 2–7 .3 7 ( m , 3 H ) , 7 . 5 6 ( d d , J = 8 . 8 , 2 . 2 H z , 1 H ) , 7 . 6 3 ( d , J = 8 . 3 H z , 2 H ) , 7 . 8 9 ( s , 1 H ) , 8 . 1 7 ( s , 1 H ) , 8 .3 3 ( d , J = 2 . 2 H z , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 1 5 1 M H z, D M S O -d6) δ 2 6 . 5 ( 2 C ) , 2 9 . 0 ( 2 C ) , 3 8 . 6 , 4 3 . 4 , 4 4 .4 , 5 4 . 0 , 9 4 . 0 , 1 0 8 . 8 , 1 1 9 . 0 , 1 2 1 .3 , 1 2 5 . 8 ( 2 C ) , 1 2 6 .1 , 1 2 6 .6 ( 2 C ) , 1 2 7 . 8 , 1 2 7 .9 ( 2 C ) , 1 3 1 . 4 ( 2 C ) , 1 3 2 .1 , 1 3 5 .9 , 1 3 6 .1 , 1 3 8 . 0 , 1 4 1 . 2 , 1 5 2 . 8 , 1 5 6 . 4 , 1 5 9 . 3 . M S m/z 5 0 6 . 2 ( M + H )⁺. A n a l. C a l c d f o r C3 0H3 1N7O · 0 .5 C4H8O2: C , 6 9 .9 2 ; H , 6 . 4 2 ; N , 1 7 .8 4 . F o u n d : C , 6 9 . 5 9 ; H , 6 . 7 0 ; N , 1 7 .8 0 . Pu r i t y 9 8 .1 % ( H P L C ) .

3 - B e n z y l - 1 - (t r a n s- 4 - ( ( 5 - c y a n o p y r i d i n - 2 - y l) a m i n o ) c y c lo h e x y l ) - 1 - p h e n y l u r e a ( 2 6 ) . C o m p o u n d 2 6 w a s p r e p ar e d f r o m c o m p o u n d 4 1 an d 6-f l u o r o n i c o t i n o n i t r i l e in a s i m i l a r m an n e r t o th a t d e s c r i b e d f o r c o m p o u n d 2 1 a n d o b t a i n e d i n 7 1% y i e l d a s a w h i t e s o l i d . ¹H

86

N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 1 .0 1 –1 . 1 9 ( m , 2 H ) , 1 .2 3–1 .4 2 ( m , 2 H ) , 1 . 8 1 ( d , J = 1 1 .3 H z , 2 H) , 1 . 9 1 ( d , J = 1 0 . 8 H z , 2 H ) , 3 .4 8 ( b r s , 1 H ) , 4 .1 6 ( d , J = 5 . 9 H z , 2 H ) , 4 .2 8 ( t , J = 1 2 . 0 H z , 1 H) , 5 .6 9 ( t , J = 6 . 0 H z , 1 H ) , 6 . 4 7 ( d , J = 8 . 9 H z , 1 H) , 7 .1 8 ( t , J = 8 . 2 H z , 5 H ) , 7 .2 3– 7 . 3 2 ( m , 2 H ) , 7 . 3 7–7 . 5 2 ( m , 4 H ) , 7 . 6 0 ( d d , J = 8 . 8 , 2 . 0 H z , 1 H ) , 8 . 2 9 ( d , J = 2 .1 H z , 1 H ) .

1 3C N M R ( 1 5 1 M H z , D M S O -d6) δ 3 0 . 1 ( 2 C ) , 3 1 .2 ( 2 C ) , 4 3 . 4 , 4 8 . 5 , 5 3 . 1 , 9 3 . 9 , 1 0 8 . 8 , 1 1 9 .0 , 1 2 6 . 2 , 1 2 6 .6 ( 2 C ) , 1 2 7 . 9 , 1 2 7 .9 ( 2 C ) , 1 2 9 .3 ( 2 C ) , 1 3 1 . 0 ( 2 C ) , 1 3 8 .0 , 1 3 8 . 4 , 1 4 1 .1 , 1 5 3 .0 , 1 5 6 . 3 , 1 5 9 .2 . M S m/z 4 2 6 .2 ( M + H )⁺. A n a l. C a l c d f o r C2 6H2 7N5O : C , 7 3 .3 9 ; H, 6 . 4 0 ; N, 1 6 . 4 6 . F o u n d : C , 7 3 . 7 3 ; H , 6 . 4 4 ; N , 1 6 . 6 1 .

3 - B e n z y l - 1 - (t r a n s 4 ( ( 5 c y a n o p y r i d i n 2 y l) a m i n o ) c y c lo h e x y l ) 1 ( 4 ( p y r i d i n 3

-y l) p h e n -y l ) u r e a ( 2 7 ) . C o m p o u n d 2 7 w a s p r ep a r e d f r o m c o m p o u n d 4 2 a n d 6 -f lu o r o n i c o t in o n i t r i l e i n a s i m i l a r m a n n er t o t h a t d e s c r i b e d f o r c o m p o u n d 2 1 a n d o b t a i n ed i n 5 3% y i e l d a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 1 .0 8 –1 . 2 5 ( m , 2 H ) , 1 .2 6– 1 . 4 2 ( m , 2 H ) , 1 .7 9–1 . 9 8 ( m , 4 H ) , 3 .4 3–3 . 5 8 ( m , 1 H ) , 4 . 1 7 ( d , J = 5 . 9 H z , 2 H ) , 4 . 2 6–4 .3 8 ( m , 1 H ) , 5 .9 4 ( t , J = 6 . 1 H z , 1 H ) , 6 .4 7 ( d , J = 8 . 9 H z , 1 H ) , 7 .1 4–7 . 2 3 ( m , 3 H ) , 7 . 2 7 ( d , J

= 6 . 9 H z , 2 H ) , 7 .3 2 ( d , J = 8 . 1 H z , 2 H ) , 7 . 4 4–7 . 5 4 ( m , 2 H ) , 7 . 6 0 ( d d , J = 8 . 8 , 1 .9 H z , 1 H ) , 7 . 8 4 ( d , J = 8 .2 H z , 2 H ) , 8 . 1 3 ( d , J = 8 . 2 H z , 1 H) , 8 .2 9 ( d , J = 2 . 0 H z , 1 H) , 8 .5 9 ( d , J = 4 . 7 H z , 1 H ) , 8 .9 5 ( d , J = 1 . 8 H z , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 1 5 1 M H z , D M S O -d6) δ 3 0 . 2 ( 2 C ) , 3 1 . 3 ( 2 C ) , 4 3 . 5 , 4 8 . 5 , 5 3 .3 , 9 3 . 9 , 1 0 8 . 9 , 1 1 9 .0 , 1 2 3 . 8 , 1 2 6 . 2 , 1 2 6 . 7 ( 2 C ) , 1 2 7 . 7 , 1 2 7 . 9 ( 2 C ) , 1 3 1 .8 ( 2 C ) , 1 3 4 . 0 ( 2 C ) , 1 3 4 . 7 , 1 3 6 . 4 , 1 3 8 . 1 , 1 3 8 .3 , 1 4 1 .2 , 1 4 7 . 6 , 1 4 8 .6 , 1 5 3 .0 , 1 5 6 .3 , 1 5 9 .2 . M S m/z 5 0 3 .3 ( M + H )⁺. A n a l. C a l c d f o r C3 1H3 0N6O · 0 . 2 C4H8O2: C , 7 3 .4 2 ; H , 6 . 1 2 ; N , 1 6 .1 5 . Fo u n d : C , 7 3 . 2 5 ; H , 5 . 9 7 ; N , 1 6 . 0 7 . P u r i ty 9 9 . 7 % ( H P L C ) .

3 - B e n z y l - 1 - (t r a n s 4 ( ( 5 c y a n o p y r i d i n 2 y l) a m i n o ) c y c lo h e x y l ) 1 ( 4 ( 1 m e t h y l 2 o x o -1 , 2 - d i h y d r o p y r i d i n - 3 - y l) p h e n y l ) u r e a ( 2 8 ) . C o m p o u n d 2 8 w a s p r e p ar e d f r o m c o m p o u n d 4 3 an d 1-m e t h y l-3-( 4 ,4 ,5 , 5-t e t r a m e t h y l-1 ,3 , 2-d io x a b o r o l a n-2-y l ) p y r i d in-2 ( 1H)-o n e (4 5) i n a s i m i l a r m an n e r t o t h a t d e s c r i b ed f o r c o m p o u n d 2 a n d o b t a in e d i n 6 9% y i e l d a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 6 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 1 . 1 0–1 . 2 1 ( m , 2 H ) , 1 . 2 8–1 . 3 8 ( m , 2 H ) , 1 . 8 3 ( d , J

= 1 1 . 4 H z , 2 H ) , 1 . 9 2 ( d , J = 1 1 . 7 H z , 2 H ) , 3 . 4 3–3 . 6 0 ( m , 4 H ) , 4 . 1 8 ( d , J = 5 . 9 H z , 2 H ) , 4 . 3 0 ( t t , J = 1 2 . 0 , 3 . 6 H z , 1 H ) , 5 . 7 9 ( t , J = 5 . 9 H z , 1 H ) , 6 . 3 4 ( t , J = 6 . 8 H z , 1 H ) , 6 . 4 7 ( d , J = 8 . 8 H z , 1 H ) , 7 . 1 5–7 . 2 2 ( m , 5 H ) , 7 . 2 4–7 . 3 0 ( m , 2 H ) , 7 . 4 6 ( d , J = 6 . 2 H z , 1 H ) , 7 . 6 0 ( d d , J = 9 . 0 , 2 . 0 H z , 1 H ) , 7 . 6 9 ( d d , J = 7 . 0 , 2 . 2 H z , 1 H ) , 7 . 7 6 ( d d , J = 6 . 8 , 2 . 0 H z , 1 H ) , 7 . 8 2

87

( d , J = 8 . 8 H z , 2 H ) , 8 . 2 9 ( d , J = 1 . 8 H z , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 1 5 1 M H z , D M S O -d6) δ 3 0 . 2 ( 2 C ) , 3 1 . 2 ( 2 C ) , 3 7 .4 , 4 3 .4 , 4 8 . 5 , 5 3 .3 , 9 3 .9 , 1 0 5 .1 , 1 0 8 .8 , 1 1 9 . 0 , 1 2 6 . 2 , 1 2 6 . 6 ( 2 C ) , 1 2 7 .9 ( 2 C ) , 1 2 8 .1 , 1 2 9 .0 ( 2 C ) , 1 3 0 . 4 ( 2 C ) , 1 3 6 . 3 , 1 3 7 . 0 , 1 3 7 . 9 , 1 3 8 .3 , 1 3 9 .4 , 1 4 1 .1 , 1 5 3 .0 , 1 5 6 .4 , 1 5 9 .2 , 1 6 0 . 7 . M S m/z 5 3 3 .2 ( M + H )⁺. A n a l. C a l c d f o r C3 2H3 2N6O2· C4H8O2: C , 6 9 .6 6 ; H , 6 . 5 0 ; N, 1 3 . 5 4 . F o u n d : C , 6 9 . 5 4 ; H , 6 . 8 1 ; N , 1 3 . 8 0 . P u r i t y 9 9 . 6 % ( H P L C ) .

3 - B e n z y l - 1 - (t r a n s 4 ( ( 5 c y a n o p y r i d i n 2 y l) a m i n o ) c y c lo h e x y l ) 1 ( 4 ( 1 m e t h y l 6 o x o -1 , 6 - d i h y d r o p y r i d i n - 2 - y l) p h e n y l ) u r e a ( 2 9 ) . C o m p o u n d 2 9 w a s p r e p ar e d f r o m c o m p o u n d 4 7 an d 6 - b r o m o - 1 - m e t h y l p y r i d i n - 2 (1 H) - o n e i n a s i m i l a r m a n n e r t o th a t d e s c r i b e d f o r c o m p o u n d 3 7 a n d o b t a i n ed in 4 4% y i e l d a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 6 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 1 . 1 3–1 .2 3 ( m , 2 H) , 1 . 3 0–1 .4 0 ( m , 2 H) , 1 . 8 5 ( d , J = 1 1 . 4 H z , 2 H ) , 1 .9 4 ( d , J = 1 1 .0 H z, 2 H) , 3 .3 2 ( s , 3 H ) , 3 . 4 8–3 . 6 1 ( m , 1 H ) , 4 . 2 0 ( d , J = 5 . 9 H z , 2 H) , 4 .3 2 ( t t , J = 1 2 .1 , 3 .5 H z , 1 H) , 5 .9 8 ( t , J = 6 . 1 H z , 1 H ) , 6 .1 9 ( d d , J = 6 .8 , 1 .3 H z , 1 H ) , 6 . 4 5 ( d d , J = 9 .0 , 1 .3 H z , 1 H) , 6 . 4 8 ( d , J = 8 . 8 H z , 1 H ) , 7 . 1 6–7 . 2 2 ( m , 3 H) , 7 . 2 7–7 .3 2 ( m , 4 H ) , 7 . 4 3–7 . 5 1 ( m , 2 H ) , 7 . 5 6 ( d , J = 8 .1 H z , 2 H ) , 7 .6 1 ( d , J = 7 .7 H z , 1 H ) , 8 .3 0 ( d , J = 2 . 2 H z , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 1 5 1 M H z , D M S O -d6) δ 3 0 . 1 ( 2 C ) , 3 1 .3 ( 2 C ) , 3 4 .1 , 4 3 . 4 , 4 8 . 4 , 5 3 .4 , 9 4 .0 , 1 0 7 .0 , 1 0 8 .9 , 1 1 7 .9 , 1 1 9 . 0 , 1 2 6 .2 , 1 2 6 . 5 ( 2 C ) , 1 2 8 .0 ( 2 C ) , 1 2 9 . 5 ( 2 C ) , 1 3 1 . 2 ( 2 C ) , 1 3 4 .5 , 1 3 8 . 3 , 1 3 8 .8 , 1 3 8 .9 , 1 4 1 .1 , 1 4 9 . 6 , 1 5 3 . 0 , 1 5 6 .3 , 1 5 9 .1 , 1 6 2 . 3 . M S m/z 5 3 3 . 2 ( M + H )⁺. A n a l. C a l c d f o r C3 2H3 2N6O2· 0 . 5 H2O : C , 7 0 .9 6 ; H , 6 . 1 4 ; N , 1 5 . 5 2 . F o u n d : C , 7 1 .1 0 ; H , 6 . 0 1 ; N , 1 5 . 5 2 . 3 - B e n z y l - 1 - (t r a n s 4 ( ( 5 c y a n o p y r i d i n 2 y l) a m i n o ) c y c lo h e x y l ) 1 ( 4 ( 1 m e t h y l 2 o x o -1 , 2 - d i h y d r o p y r i d i n - 4 - y l) p h e n y l ) u r e a ( 3 0 ) . C o m p o u n d 3 0 w a s p r e p ar e d f r o m c o m p o u n d 4 7 an d 4 - b r o m o - 1 - m e t h y l p y r i d i n - 2 ( 1H) - o n e i n a s i m i l a r m a n n e r t o th a t d e s c r i b e d f o r c o m p o u n d 3 7 a n d o b t a i n ed i n 4 8% y i e ld a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 6 0 0 M H z , C D C l3) δ 1 . 2 8–1 .3 6 ( m , 2 H) , 1 . 3 9–1 .4 8 ( m , 2 H) , 2 . 0 0 ( d , J = 1 1 . 7 H z , 2 H ) , 2 .1 2 ( d , J = 1 1 .7 H z, 2 H) , 3 . 5 6 ( b r s , 1 H ) , 3 . 6 0 ( s , 3 H ) , 4 .2 8–4 . 3 5 ( m , 1 H ) , 4 .3 8 ( d , J = 5 . 5 H z , 2 H ) , 4 . 6 2 ( t t , J

= 1 2 . 1 , 3 . 5 H z , 1 H) , 5 . 1 0 ( d , J = 7 . 7 H z , 1 H ) , 6 .2 8 ( d , J = 8 . 8 H z , 1 H ) , 6 . 4 0 ( d d , J = 7 . 0 , 1 . 8 H z , 1 H ) , 6 .7 9 ( d , J = 1 . 8 H z , 1 H ) , 7 .1 8 ( d , J = 7 . 3 H z , 2 H ) , 7 . 2 0–7 . 2 4 ( m , 1 H ) , 7 .2 5– 7 . 3 0 ( m , 4 H ) , 7 .3 8 ( d , J = 7 .3 H z , 1 H ) , 7 . 4 2 ( d d , J = 9 .0 , 2 .0 H z , 1 H ) , 7 . 6 2 ( d , J = 8 . 4 H z , 2 H) , 8 .2 7 ( d , J = 1 .8 H z , 1 H ) . ^{1 3}C N M R ( 1 5 1 M H z , C D C l3) δ 3 0 . 5 ( 2 C ) , 3 2 . 2 ( 2 C ) , 3 7 . 4 , 4 4 . 7 , 4 9 .4 , 5 3 . 7 , 9 6 . 5 , 1 0 5 .1 , 1 0 7 .6 , 1 1 7 . 4 , 1 1 8 . 7 , 1 2 7 . 1 ( 2 C ) , 1 2 7 . 2 , 1 2 8 . 2 ( 2 C ) , 1 2 8 .6 ( 2 C ) , 1 3 1 . 8 ( 2 C ) , 1 3 8 . 0 , 1 3 8 .5 , 1 3 8 . 9 , 1 3 9 .2 , 1 3 9 . 5 , 1 5 0 .4 , 1 5 3 . 2 , 1 5 6 .7 , 1 5 9 . 0 , 1 6 3 .1 .

88

M S m/z 5 3 3 . 2 ( M + H )⁺. A n a l. C a l c d f o r C3 2H3 2N6O2· 0 . 4 H2O : C , 7 1 . 2 0 ; H , 6 . 1 2 ; N , 1 5 . 5 7 . F o u n d : C , 7 1 .3 6 ; H , 6 . 1 0 ; N, 1 5 . 4 0 .

1-( ( 4-( 1-M e t h y l-1H-p y r a z o l-4-y l ) p h e n y l ) s u l f o n y l) p i p e r i d i n-4-a m i n e h y d ro c h l o r i d e ( 3 2 ) . T o a s o lu t i o n o f t e r t- b u t y l p i p e r i d i n - 4 - y l c a r b am a t e (3 1) ( 2 . 5 4 g , 1 2 . 7 m m o l) a n d E t3N ( 2 . 6 5 m L , 1 9 .0 m m o l ) i n T H F ( 1 0 0 m L ) w a s a d d ed 4 - b r o m o b e n z en e s u l f o n y l c h l o r i d e ( 3 . 5 6 g , 1 4 . 0 m m o l ) p o r t i o n w i s e a t 0 ° C . T h e m ix t u r e w a s s t i r r e d a t r o o m t e m p er a t u r e o v e r n i g h t . T h e m i x t u r e w a s p o u r e d i n t o w a t e r an d e x t r a c t ed w i t h E t O A c . T h e o r g an i c l a y er w a s s e p a r a t ed , w a s h ed w i t h w a t e r a n d b r i n e , d r i ed o v e r N a2S O4 an d co n c en t r a t e d . T h e r e s i d u e w a s w a s h e d w i t h d i i s o p r o p y l e t h e r a n d c o l l e c t e d b y f i l t r a t i o n t o g i v e t e r t -b u t y l N -( 1 - ( 4 - b r o m o p h e n y l ) s u l f o n y l - 4 - p i p e r id y l) c a r b am a t e ( 5 . 1 0 g , 9 6 % ) a s a w h i t e s o l i d .

1H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l3) δ 1 . 4 2 ( s , 9 H ) , 1 .4 8 ( d d , J = 1 2 . 3 , 3 . 5 H z , 2 H) , 1 .9 9 ( d , J = 1 0 . 5 H z , 2 H) , 2 .4 7 ( t , J = 1 2 . 0 H z , 2 H ) , 3 . 4 0 ( b r s , 1 H ) , 3 .6 8 ( d , J = 1 1 . 6 H z , 2 H ) , 4 . 3 8 ( b r s , 1 H) , 7 . 5 8 – 7 .6 4 ( m , 2 H ) , 7 . 6 5 – 7 . 7 2 ( m , 2 H ) . M S m/z 4 4 1 .1 ( M + N a )⁺.

A m ix t u r e o f t e r t- b u ty l N -( 1 - ( 4 - b r o m o p h e n y l ) s u lf o n y l - 4 - p i p er i d y l ) c a r b am a t e ( 5 .1 0 g , 1 2 . 2 m m o l ) , 1-m e t h y l-4-( 4 , 4 , 5 ,5-t e t r a m e th y l-1 , 3 ,2-d i o x ab o r o l a n-2-y l )-1H-p y r a zo l e ( 2 . 5 3 g , 1 2 . 2 m m o l ) , P d ( d p p f ) C l2·C H2C l2 ( 9 9 3 m g , 1 . 2 2 m m o l ) , a n d K2C O3 ( 3 .3 6 g , 2 4 .3 m m o l ) i n D M F ( 1 0 0 m L ) a n d w a t e r ( 2 0 m L ) w a s s t i r r e d a t 1 0 0 ° C u n d e r A r o v e r n i g h t . I n s o l u b l e m a t er i a l s w e r e f i l t e r ed o ff , an d t h e f i l t r a t e w a s p o u r e d i n t o w a t e r a n d ex t r a c t e d w i t h E t O A c . T h e o rg a n i c l a y e r w a s s e p a r a t e d , w a s h e d w i t h w a t e r a n d b r i n e , d r i e d o v e r N a2S O4, a n d co n c en t r a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i e d b y s i l i c a g e l co l u m n c h r o m a t o g r a p h y (h e x an e / E t O A c = 9 8 / 2 to 5 0 /5 0) to g i v e t e r t- b u t y l ( 1 - ( ( 4 - ( 1 - m e th y l - 1H p y r a z o l 4 -y l) p h en -y l ) s u lf o n -y l ) p ip e r id i n - 4 - -y l ) ca r b am a t e ( 4 .2 3 g , 8 3 % ) a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O-d6) δ 1 .3 4 ( s , 9 H ) , 1 . 3 7 – 1 . 5 0 ( m , 2 H ) , 1 . 7 6 ( d , J = 1 0 .4 H z , 2 H ) , 2 . 3 5 – 2 . 4 8 ( m , 2 H) , 3 . 2 4 ( b r s , 1 H ) , 3 . 4 7 ( d , J = 1 2 . 1 H z , 2 H) , 3 . 8 9 ( s , 3 H ) , 6 . 8 5 ( d , J = 6 . 1 H z, 1 H ) , 7 . 6 7 ( d , J = 8 .1 H z , 2 H ) , 7 .8 0 ( d , J = 8 . 0 H z , 2 H ) , 8 .0 0 ( s , 1 H ) , 8 .3 1 ( s , 1 H ) . M S m/z 4 4 3 .2 ( M + N a )⁺.

A m i x t u r e o f t e r t- b u t y l ( 1 - ( ( 4 - ( 1 - m e t h y l - 1H p y r a zo l 4 y l ) p h e n y l ) s u l f o n y l) p i p er i d i n 4 -y l) c a r b am a t e ( 3 . 8 0 g , 9 . 0 4 m m o l) a n d 1 0 % H C l i n M e O H ( 2 0 m L ) w a s s t i r r ed a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 3 h . T h e m i x t u r e w a s c o n c e n tr a t e d . T h e r e s i d u e w a s s o l i d i f i e d w i t h d i i s o p r o p y l e th e r an d c o l l e c t ed b y f i l t r a t i o n t o g i v e 3 2 ( 3 . 2 0 g , 9 9 % ) a s a w h i t e s o l i d . ¹H

89

N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O-d6) δ 1 . 4 9 – 1 .6 9 ( m , 2 H) , 1 . 9 2 – 2 .0 3 ( m , 2 H ) , 2 .3 1 – 2 . 4 6 ( m , 2 H) , 2 . 9 6 – 3 .1 4 ( m , 1 H) , 3 . 6 5 ( d , J = 1 2 . 1 H z , 2 H ) , 3 . 8 9 ( s , 3 H ) , 7 .6 5 – 7 . 7 3 ( m , 2 H ) , 7 . 7 7 – 7 . 8 6 ( m , 2 H ) , 8 .0 1 ( d , J = 0 . 6 H z , 1 H ) , 8 . 0 7–8 . 2 1 ( m , 3 H) , 8 . 3 3 ( s , 1 H ) . M S m/z 3 2 1 . 1 ( M + H )⁺.

6 - ( P i p e r i d i n - 4 - y la m i n o ) n i c o t i n o n i t r i l e d i h y d r o c h l o r i d e ( 3 4 ) . A m i x tu r e o f 3 3 ( 5 . 0 0 g , 2 5 . 0 m m o l ) , 6 - ch l o r o n i c o t in o n i t r i l e ( 4 . 1 5 g , 3 0 .0 m m o l ) , a n d D I P E A ( 8 . 7 0 m L , 4 9 . 9 m m o l ) in D M F ( 5 0 m L ) w a s s t i r r e d a t 1 2 0 ° C o v er n i g h t . T h e m i x t u r e w a s p o u r e d in t o w a t e r a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d e x t r a c t e d w i t h E t O A c . T h e o r g a n i c l a y er w a s s e p a r a t e d , w a s h e d w i t h w a t e r an d b r in e , d r i e d o v e r M g S O4, an d co n c en t r a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i ed b y s i l i c a g e l c o l u m n c h r o m a to g r ap h y ( h ex a n e / E t O A c = 9 5 / 5 t o 5 0 / 5 0 ) a n d s o l i d i f i ed w i t h h e x a n e / T H F t o g i v e t e r t b u ty l 4 ( ( 5 cy a n o p y r id i n 2 y l) a m i n o ) p i p e r i d i n e -1 - c a r b o x y l a t e ( 5 .0 0 g , 6 6 % ) a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l3) δ 1 . 2 4 –1 . 5 3 ( m , 1 1 H ) , 1 . 9 0–2 .1 5 ( m , 2 H ) , 2 . 9 3 ( t , J = 1 1 . 6 H z , 2 H ) , 3 . 7 8–4 .2 3 ( m , 3 H) , 4 .8 5 ( d , J = 8 .2 H z , 1 H ) , 6 . 3 6 ( d d , J = 8 . 8 , 0 . 6 H z, 1 H ) , 7 . 5 5 ( d d , J = 8 . 8 , 2 .3 H z , 1 H ) , 8 .3 4–8 . 3 7 ( m , 1 H ) . M S m/z 2 4 7 . 2 ( M + H − 5 6 )⁺.

T o a s o l u t i o n o f t e r t- b u ty l 4 - ( ( 5 - cy a n o p y r i d i n - 2 - y l ) a m in o ) p i p e r id i n e - 1 - c a r b o x y l a t e ( 1 . 0 0 g , 3 .3 1 m m o l ) i n E t O H ( 1 5 m L ) w a s a d d ed 4 M H C l i n E t O A c ( 1 9 . 8 m L , 7 9 . 4 m m o l ) a t r o o m t e m p e r a t u r e . T h e m ix t u r e w a s s t i r r ed a t r o o m t e m p e r a t u r e o v er n i g h t a n d c o n c e n tr a t e d . T h e r e s i d u a l s o l i d w a s s u s p e n d ed i n E t O A c a n d co l l e c t e d b y f i l t r a t i o n t o g iv e 3 4 ( 0 . 8 9 6 g , 9 8 % ) a s a w h i t e s o l i d . M S m/z 2 0 3 .2 ( M + H )⁺.

t e r t- B u t y l (t r a n s- 4 - ( ( 4 - b r o m o p h e n y l ) a m i n o ) c y c lo h e x y l ) c a r b a m a t e ( 3 6 ) . A m i x t u r e o f 3 5 ( 1 . 5 0 g , 7 .0 0 m m o l ) , 1 - b r o m o - 4 - io d o b e n z en e ( 1 .9 8 g , 7 . 0 0 m m o l) , t e r t- B u O N a ( 1 . 0 1 g , 1 0 . 5 m m o l ) , X a n t p h o s ( 0 . 4 8 6 g , 0 . 8 4 0 m m o l ) i n to l u e n e ( 3 0 m L ) w a s d eg a s s e d a n d p u r g e d w i t h A r . T o t h e m i x t u r e w a s a d d e d Pd2( d b a )3 ( 0 . 3 8 5 g , 0 .4 2 0 m m o l ) a t r o o m t em p e r a tu r e , a n d t h e m i x t u r e w a s s t i r r e d a t 8 0 ° C u n d e r A r o v e r n i g h t. T h e m i x t u r e w a s p o u r e d in t o w a t e r a n d ex t r a c t e d w i t h E t O A c . T h e o r g an i c l a y e r w a s s e p a r a t ed , w a s h e d w i t h w a t e r a n d b r i n e , d r i e d o v e r Mg S O4, an d c o n c e n tr a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i e d b y s i l i c a g e l c o l u m n c h r o m a to g r ap h y ( h ex a n e / E t O A c = 9 5 / 5 t o 4 0 / 6 0 ) a n d N H s i l i c a g e l c o l u m n c h r o m a to g r ap h y ( h ex a n e / E t O A c = 9 5 / 5 to 3 0 /7 0 ) t o g i v e 3 6 ( 1 . 1 6 g , 4 5 % ) a s a w h i t e s o l i d .

1H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l3) δ 1 .0 6 –1 . 3 4 ( m , 4 H) , 1 . 4 5 ( s , 9 H ) , 1 .9 4–2 . 2 3 ( m , 4 H ) , 3 .0 4–

90

3 . 2 4 ( m , 1 H ) , 3 .3 3–3 . 6 4 ( m , 2 H ) , 4 .3 2–4 . 4 7 ( m , 1 H ) , 6 . 4 4 ( d , J = 8 . 7 H z , 2 H ) , 7 . 2 2 ( d , J

= 8 . 7 H z, 2 H ) . M S m/z 3 6 9 .1 , 3 7 1 . 1 ( M + H )⁺.

t e r t- B u t y l (t r a n s- 4 - ( ( 4 - ( 1 - m e t h y l -1 H -py r a z o l - 4 - y l) p h e n y l ) a m i n o ) c y c l o h e x y l ) ca r b a m a t e ( 3 7 ) . A m i x tu r e o f 3 6 ( 1 .6 7 g , 4 .5 2 m m o l ) , 1-m e t h y l-4-( 4 , 4 , 5 , 5-t e t r a m e t h y l-1 ,3 , 2 -d io x a b o r o l a n-2-y l )-1H-p y r a zo l e ( 1 .4 1 g , 6 .7 8 m m o l ) , c e s i u m c a r b o n a t e ( 2 . 9 5 g , 9 . 0 4 m m o l ) i n D M F ( 3 0 m L ) a n d w a t e r ( 3 m L ) w a s d eg a s s e d a n d p u rg ed w i t h A r. To t h e m ix t u r e w a s a d d ed P d C l2( A m p h o s )2 ( 0 . 3 0 4 g , 0 . 4 5 1 m m o l ) a t r o o m t e m p e r a t u r e , a n d t h e m ix t u r e w a s s t i r r e d a t 1 0 0 ° C u n d e r A r o v e r n i g h t . T h e m i x tu r e w a s p o u r e d i n t o w a t e r a t r o o m t e m p e r a t u r e an d e x tr a c t e d w i t h E t O A c . T h e o rg an i c l ay e r w a s s e p ar a t e d , w a s h e d w i t h w a t e r a n d b r i n e , d r i e d o v er Mg S O4 a n d c o n c e n t r a t ed . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i e d b y s i l i c a g e l c o lu m n c h r o m a to g r ap h y (h e x an e / E t O A c = 9 5 / 5 to 2 0 / 8 0) to g i v e 3 7 ( 1 . 4 1 g , 8 4 % ) a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l3) δ 1 .1 0 –1 .3 0 ( m , 4 H) , 1 . 4 5 ( s , 9 H ) , 2 . 0 0–2 .2 5 ( m , 4 H ) , 3 .0 6–3 .3 1 ( m , 1 H ) , 3 .3 6–3 . 6 1 ( m , 2 H ) , 3 . 9 1 ( s , 3 H ) , 4 . 2 9–4 .5 3 ( m , 1 H) , 6 .5 8 ( d , J = 8 . 3 H z , 2 H ) , 7 .2 1–7 .3 2 ( m , 2 H ) , 7 . 4 7 ( s , 1 H ) , 7 . 6 5 ( s , 1 H ) . M S m/z 3 7 1 .2 ( M + H )⁺.

t e r t- B u t y l (c i s- 4 - ( ( 4 - ( 1 - m e t h y l -1 H -py r a z o l - 4 - y l) p h e n y l ) a m i n o ) c y c l o h e x y l ) ca r b a m a t e ( 3 9 ) . t e r t- B u t y l (c i s- 4 - ( ( 4 - b r o m o p h e n y l ) a m in o ) c y c l o h e x y l ) c a r b a m a t e w a s p r ep a r ed f r o m 3 8 a n d 1 - b r o m o - 4 - i o d o b en z e n e in a s i m i l a r m a n n e r t o th a t d e s c r i b ed f o r c o m p o u n d 3 6 an d o b t a i n e d i n 2 6% y i e l d a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l3) δ 1 . 4 5 ( s , 9 H) , 1 . 5 7 – 1 . 6 6 ( m , 4 H ) , 1 . 6 9–1 . 8 8 ( m , 4 H ) , 3 . 4 0 ( b r s , 1 H ) , 3 . 5 4–3 .7 6 ( m , 2 H ) , 4 .5 4 ( b r s , 1 H ) , 6 . 4 6 ( d , J = 8 .7 H z , 2 H ) , 7 . 2 3 ( d , J = 8 . 7 H z, 2 H ) . M S m/z 3 6 9 . 1 , 3 7 1 . 1 ( M + H)⁺.

C o m p o u n d 3 9 w a s p r e p a r e d f r o m t e r t- b u t y l (c i s 4 ( ( 4

-b r o m o p h e n y l ) a m i n o ) c y c l o h e x y l ) c a r -b a m a t e a n d 1 m e t h y l 4 ( 4 ,4 , 5 ,5 t e t r a m e th y l 1 , 3 ,2 -d io x a b o r o l a n - 2 - y l ) -1 H- p y r a zo l e i n a s i m i l a r m an n e r to t h a t d e s c r i b e d f o r co m p o u n d 3 7 a n d o b t a in e d i n 9 6% y i e l d a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l3) δ 1 .4 5 ( s , 9 H ) , 1 . 5 9–1 .6 8 ( m , 4 H) , 1 . 7 0–1 .8 9 ( m , 4 H) , 3 . 4 7 ( b r s , 1 H) , 3 . 5 5–3 . 7 4 ( m , 2 H ) , 3 . 9 1 ( s , 3 H ) , 4 . 4 5–4 .6 9 ( m , 1 H ) , 6 . 5 9 ( d , J = 8 .3 H z , 2 H ) , 7 .2 2–7 . 3 0 ( m , 2 H ) , 7 .4 7 ( s , 1 H) , 7 .6 5 ( s , 1 H ) . M S m/z 3 7 1 . 2 ( M + H )⁺.

t e r t- B u t y l (t r a n s- 4 - ( ( b e n z y l c a r b a m o y l) ( 4 - b r o m o p h e n y l ) a m i n o ) c y c lo h e x y l ) c a r b a m a t e ( 4 0 ) . C o m p o u n d 4 0 w a s p r ep a r e d f r o m co m p o u n d 3 6 a n d b e n z y l i s o c y a n a t e i n a s i m i l a r

91

m an n e r t o th a t d e s c r i b e d f o r c o m p o u n d 2 3 a n d o b t a i n e d i n 9 3% y i e l d a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 0 .8 8 –1 .1 2 ( m , 2 H) , 1 . 1 4–1 . 3 1 ( m , 2 H ) , 1 . 3 4 ( s , 9 H ) , 1 . 6 7– 1 . 8 2 ( m , 4 H ) , 2 . 8 5–3 . 0 4 ( m , 1 H ) , 4 . 0 7–4 . 2 4 ( m , 3 H ) , 5 .9 8 ( t , J = 5 .8 H z , 1 H ) , 6 . 6 6 ( d , J = 7 . 5 H z , 1 H ) , 7 . 0 7–7 . 2 0 ( m , 5 H ) , 7 . 2 3–7 . 3 1 ( m , 2 H ) , 7 . 6 2 ( d , J = 8 .3 H z , 2 H) . M S m/z 5 0 2 .2 , 5 0 4 . 2 ( M + H )⁺.

t e r t-B u t y l (t r a n s -4-( ( b e n z y l c a r b a m o y l ) ( p h e n y l ) a m i n o ) c y c l o h ex y l ) c a r b a m a t e ( 4 1 ) . A m ix t u r e o f 4 0 ( 1 5 7 m g , 0 .3 1 2 m m o l) , E t3N ( 0 . 0 6 5 m L , 0 . 4 6 8 m m o l ) , a n d 1 0 % P d / C ( 3 3 . 3 m g , 0 . 0 3 1 2 m m o l ) i n E t O H ( 3 m L ) a n d T H F ( 3 m L ) w a s p u r g e d w i t h H2. T h e m i x t u r e w a s s t i r r e d a t r o o m t e m p er a t u r e u n d er H2 f o r 3 h . T h e c a t a ly s t w a s r em o v e d b y f i l t r a t i o n , an d t h e f i l t r a t e w a s c o n c e n tr a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r i f i ed b y N H s i l i c a g e l c o l u m n c h r o m a to g r ap h y ( h ex a n e / E t O A c = 9 5 /5 t o 2 0 / 8 0 ) a n d s o l i d i f i e d w i t h h e x a n e /E t O A c t o g iv e 4 1 ( 1 3 3 m g , q u a n t i t a t i v e ) a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 0 . 8 5 – 1 . 2 8 ( m , 4 H ) , 1 . 3 4 ( s , 9 H) , 1 . 7 4 ( d , J = 1 0 . 5 H z , 4 H ) , 2 . 9 0 ( b r s , 1 H ) , 4 . 1 0–4 . 2 4 ( m , 3 H ) , 5 . 6 5 ( t , J = 6 . 0 H z , 1 H ) , 6 .6 7 ( d , J = 8 . 2 H z , 1 H) , 7 . 0 4–7 .3 2 ( m , 7 H ) , 7 . 3 6–7 . 5 2 ( m , 3 H ) . M S m/z 4 2 4 . 2 ( M + H )⁺.

t e r t- B u t y l (t r a n s 4 ( ( b e n z y l c a r ba m o y l) ( 4 ( p y r i d i n 3 -y l) p h e n -y l ) a m i n o ) c -y c l o h e x -y l ) c a r b a m a t e ( 4 2 ) . C o m p o u n d 4 2 w a s p r ep a r ed f r o m c o m p o u n d 4 0 a n d 3 - p y r i d i n y l b o r o n i c a c i d i n a s i m i l a r m a n n e r to t h a t d e s c r i b e d f o r co m p o u n d 3 7 a n d o b t a i n e d i n 9 5% y i e l d a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 0 . 9 6–1 . 3 7 ( m , 4 H) , 1 . 3 4 ( s , 9 H ) , 1 . 6 6–1 . 9 0 ( m , 4 H ) , 2 . 9 5 ( d , J = 6 . 5 H z , 1 H ) , 4 .0 9–4 . 3 5 ( m , 3 H ) , 5 .9 1 ( t , J = 6 . 0 H z , 1 H ) , 6 . 5 8–6 . 7 6 ( m , 1 H ) , 7 . 0 9–7 . 2 1 ( m , 3 H ) , 7 . 2 2–7 . 3 7 ( m , 4 H ) , 7 .5 0 ( d d , J = 7 . 9 , 4 . 8 H z , 1 H ) , 7 . 8 3 ( d , J = 8 . 2 H z , 2 H ) , 8 . 1 3 ( d , J = 8 . 0 H z, 1 H ) , 8 . 5 9 ( d , J = 4 . 7 H z , 1 H) , 8 . 9 4 ( d , J = 1 . 8 H z , 1 H ) . M S m/z 5 0 1 .3 ( M + H)⁺.

3 - B e n z y l - 1 - ( 4 - b r o m o p h e n y l ) - 1 - (t r a n s- 4 - ( ( 5 - c y a n o p y r i d i n - 2 - y l ) a m i n o ) c y c l o h ex y l ) u r e a ( 4 3 ) . C o m p o u n d 4 3 w a s p r e p a r e d f r o m c o m p o u n d 4 0 an d 6-f lu o r o n i c o t i n o n i t r i l e in a s i m i l a r m an n er t o th a t d e s c r ib e d f o r c o m p o u n d 2 1 a n d o b t a i n e d in 8 0% y i e l d a s a wh i t e s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z , D M S O -d6) δ 0 . 9 3 –1 . 1 9 ( m , 2 H ) , 1 .2 4–1 .4 2 ( m , 2 H ) , 1 .7 9 ( d , J

= 1 1 . 6 H z , 2 H ) , 1 . 9 1 ( d , J = 1 0 . 5 H z , 2 H ) , 3 . 4 9 ( b r s , 1 H) , 4 .1 4 ( d , J = 5 . 8 H z , 2 H) , 4 .2 7 ( t , J = 1 2 .0 H z , 1 H ) , 6 . 0 2 ( t , J = 5 . 9 H z , 1 H ) , 6 . 4 7 ( d , J = 8 . 9 H z , 1 H ) , 7 .1 1–7 . 2 1 ( m , 5 H ) , 7 . 2 3–7 .3 1 ( m , 2 H ) , 7 . 4 6 ( d , J = 7 . 2 H z , 1 H) , 7 . 5 7–7 .6 7 ( m , 3 H ) , 8 . 3 0 ( d , J = 2 . 0 H z , 1 H) .

92 M S m/z 5 0 4 . 2 , 5 0 6 . 1 ( M + H)⁺.

3 - B e n z y l - 1 - (t r a n s 4 ( ( 5 c y a n o p y r i d i n 2 y l) a m i n o ) c y c lo h e x y l ) 1 ( 4 ( 4 , 4 , 5 , 5

-t e-t r a m e -t h y l - 1 , 3 , 2 - d i o x a b o r o l a n - 2 - y l ) p h e n y l ) u r e a ( 4 7 ) . A m i x t u r e o f 4 3 ( 2 . 4 0 g , 4 . 7 6 m m o l ) , p o t a s s i u m a c e t a t e ( 1 .8 7 g , 1 9 . 0 m m o l ) , 4 6 ( 2 .4 2 g , 9 . 5 2 m m o l) , an d P d ( d p p f ) C l2

( 0 . 6 9 6 g , 0 . 9 5 m m o l ) i n D M S O ( 4 0 m L ) w a s d eg a s s e d an d p u r g ed w i t h N2 th r e e t i m e s . T h e m i x t u r e w a s s t i r r e d a t 8 0 ° C u n d er N2 f o r 2 .5 h . T h e m ix t u r e w a s p o u r ed i n t o w a t e r a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d e x tr a c t e d w i t h E t O A c . T h e o r g an i c l a y e r w a s s e p a r a t e d , w a s h ed w i t h w a t e r an d b r i n e , d r i e d o v e r M g S O4, an d c o n c e n tr a t e d . T h e r e s i d u e w a s p u r if i e d b y s i l i c a g e l c o l u m n c h r o m a to g r ap h y ( h e x an e / E t O A c = 9 0 /1 0 t o 2 0 / 8 0 ) , a n d t h e r e s u l t a n t p r o d u c t w a s w a s h ed w i t h h ex a n e a n d c o l l e c t e d b y f i l t r a t io n to g iv e 4 7 ( 2 . 3 1 g , 8 8 % ) a s a w h i t e s o l i d . ¹H N M R ( 3 0 0 M H z, D M S O -d6) δ 1 .0 8 –1 .4 3 ( m , 1 6 H) , 1 . 7 1–1 .8 5 ( m , 2 H ) , 1 . 8 6–1 .9 8 ( m , 2 H ) , 3 .4 1–3 .5 5 ( m , 1 H ) , 4 .1 3 ( d , J = 5 . 9 H z , 2 H ) , 4 . 2 9 ( t , J = 1 1 . 7 H z , 1 H) , 5 . 8 1 ( t , J = 6 . 2 H z , 1 H ) , 6 .4 6 ( d , J = 8 . 9 H z , 1 H) , 7 . 1 0–7 .2 2 ( m , 5 H ) , 7 . 2 3–7 . 3 2 ( m , 2 H ) , 7 . 4 6 ( d , J = 7 . 6 H z, 1 H ) , 7 .6 0 ( d d , J = 8 . 9 , 2 .4 H z , 1 H ) , 7 .7 6 ( d , J = 8 .2 H z , 2 H ) , 8 . 2 8 ( d , J = 1 .9 H z , 1 H) . M S m/z 5 5 2 .3 ( M + H )⁺.

X-ra y c r y s t a l s t r u c t u re a n a l y s i s o f c o m p o u n d s . A l l m e a s u r e m en t s w e r e m a d e o n a R i g a k u R-A X I S R A P I D-1 9 1 R d i ff r a c to m e t e r ( f o r c o m p o u n d s 1, 1 4 a n d 2 3) o r a R i g a k u X t a L A B P 2 0 0 d i ff r a c t o m e t e r ( f o r co m p o u n d s 1 2 , 1 5 , 1 6 , 2 1 a n d 2 2) u s i n g g r a p h i t e m o n o ch r o m a t e d C u-K α r ad i a t i o n . T h e s t r u c t u r e w a s s o l v ed b y d i r e c t m e th o d s w i t h S I R 2 0 0 8 ( B u r l a e t a l. , 2 0 0 7 ) a n d w a s r e f i n e d u s i n g f u l l-m a tr i x l e a s t-s q u a r e s o n F² w i t h S H E L X L-2 0 1 3 / 4 o r S H E L X L-2 0 1 4 / 7 ( S h e l d r i c k , 2 0 0 8 ) . A l l n o n-H a t o m s w e r e r e f in e d w i t h a n i s o t r o p i c d i s p l a c e m en t p a r am e t e r s . T h e s e d a t a c a n b e o b t a in e d f r e e o f ch a rg e f r o m

T h e C a m b r id g e C r y s t a l l o g r a p h i c D a t a C e n t r e v i a

h t tp : / / w w w. c c d c . c am . a c .u k / C o m m u n i t y / R e q u e s t a s t r u c tu r e / P a g e s / D a t a R e q u e s t . a s p x ? .

93

F i g u re 2-1 5. O RT E P o f 1, t h er m a l e l l i p s o id s a r e d r a wn a t 5 0 % p r o b a b i l i t y.

C r y s t a l d a t a f o r 1 ( C C D C 1 8 3 5 9 9 2 ) : C2 1H2 2N6O2S , M W = 4 2 2 .5 0 ; c r y s t a l s i z e , 0 .3 0 x 0 . 0 8 x 0 .0 6 m m ; c o l o r l e s s , b l o ck ; m o n o c l in i c , s p a c e g r o u p P21/ n , a = 6 . 2 2 1 4 6 ( 1 9 ) Å , b = 1 6 . 7 9 1 2 ( 5 ) Å , c = 1 9 .1 4 0 8 ( 6 ) Å , α = γ = 9 0 ° , β = 9 0 .9 1 9 ( 6 ) ° , V = 1 9 9 9 . 3 0 ( 1 0 ) ų, Z = 4 , D x = 1 . 4 0 4 g / c m³, T = 1 0 0 K , μ = 1 . 7 0 4 m m^-1, λ = 1 .5 4 1 8 7 Å , R1 = 0 . 0 7 3 , w R2 = 0 .1 5 0 .

F i g u re 2-1 6. O RT E P o f 1 2, th e r m a l e l l i p s o i d s a r e d r a wn a t 5 0 % p r o b a b i l i t y.

C r y s t a l d a t a fo r 1 2 ( C C D C 1 8 3 5 9 9 3 ) : C2 2H2 2N6O , M W = 3 8 6 . 4 6 ; c r y s t a l s i z e , 0 . 1 2 x 0 .1 0 x 0 .0 4 m m ; c o l o r l e s s , b l o c k ; m o n o c l i n i c , s p a c e g r o u p P21/ n , a = 1 0 . 7 1 6 4 0 ( 1 4 ) Å, b = 8 . 2 5 4 2 5 ( 1 4 ) Å , c = 2 2 . 3 9 7 7 ( 3 ) Å , α = γ = 9 0 ° , β = 9 6 .2 0 0 1 ( 1 4 ) ° , V = 1 9 6 9 . 6 2 ( 5 ) ų, Z = 4 , D x = 1 . 3 0 3 g / c m³, T = 1 0 0 K , μ = 0 .6 7 8 m m^-1, λ = 1 .5 4 1 8 7 Å , R1 = 0 . 0 4 5 , w R2 = 0 . 11 5 .

94

F i g u re 2-1 7. O RT E P o f 1 4, th e r m a l e l l i p s o i d s a r e d r a wn a t 5 0 % p r o b a b i l i t y.

C r y s t a l d a t a f o r 1 4 ( C C D C 1 8 3 5 9 9 4 ) : C2 4H2 6N6O ∙ 0 . 4 H2O , M W = 4 2 1 . 7 2 ; c r y s t a l s i z e , 0 . 2 1 x 0 . 11 x 0 .0 6 m m ; c o l o r l e s s , p l a t e l e t ; t r i c l i n i c , s p a c e g r o u p P-1 , a = 9 . 6 5 2 9 ( 4 ) Å , b

= 11 . 5 1 4 1 ( 5 ) Å , c = 1 2 .0 4 0 4 ( 5 ) Å , α = 9 2 . 0 9 1 ( 7 ) ° , β = 11 0 .4 9 9 ( 8 ) ° , γ = 111 . 5 8 0 ( 8 ) ° , V = 11 4 4 . 4 4 ( 1 3 ) ų, Z = 2 , D x = 1 .2 2 4 g / c m³, T = 1 0 0 K , μ = 0 . 6 3 6 m m^-1, λ = 1 .5 4 1 8 7 Å , R1 = 0 . 1 3 0 , w R2 = 0 . 2 3 6 .

F i g u re 2-1 8. O RT E P o f 1 6, th e r m a l e l l i p s o i d s a r e d r a wn a t 5 0 % p r o b a b i l i t y.

C r y s t a l d a t a f o r 1 6 ( C C D C 1 8 3 5 9 9 5 ) : C2 3H2 6N6O2S , M W = 4 5 0 . 5 6 ; c r y s t a l s i z e , 0 . 3 4 x 0 . 2 3 x 0 . 0 6 m m ; c o lo r l e s s , b l o c k ; o r th o r h o m b i c , s p a c e g r o u p P212121, a = 9 . 2 8 5 6 3 ( 7 ) Å , b

= 1 0 . 4 5 1 0 0 ( 8 ) Å , c = 2 3 . 9 1 5 9 0 ( 1 5 ) Å , α = β = γ = 9 0 ° , V = 2 3 2 0 .9 0 ( 3 ) ų, Z = 4 , D x = 1 . 2 8 9 g / cm³, T = 1 0 0 K , μ = 1 . 5 0 0 m m^-1, λ = 1 . 5 4 1 8 7 Å , R1 = 0 . 0 2 6 , w R2 = 0 .0 6 8 .

95

F i g u re 2-1 9. O RT E P o f 2 1, th e r m a l e l l i p s o i d s a r e d r a wn a t 5 0 % p r o b a b i l i t y.

C r y s t a l d a t a f o r 2 1 ( C C D C 1 8 3 5 9 9 6 ) : C3 1H3 2N6O ∙ 1 . 0 C3H8O , M W = 5 6 4 . 7 3 ; c r y s t a l s i z e , 0 . 1 4 x 0 . 0 4 x 0 . 0 4 m m ; c o lo r l e s s , b l o c k ; t r i c l i n i c, s p a c e g r o u p P-1 , a = 8 .4 8 7 6 ( 3 ) Å , b = 11 . 3 9 0 3 ( 3 ) Å , c = 1 6 . 0 3 7 9 ( 5 ) Å , α = 8 3 . 4 0 3 ( 2 ) ° , β = 8 1 . 9 1 9 ( 3 ) ° , γ = 8 6 . 6 0 1 ( 2 ) ° , V = 1 5 2 3 . 4 6 ( 8 ) ų, Z = 2 , D x = 1 . 2 3 1 g / cm³, T = 1 0 0 K , μ = 0 . 6 2 1 m m^-1, λ = 1 . 5 4 1 8 4 Å , R1 = 0 . 0 4 6 , w R2 = 0 . 1 2 4 .

F i g u re 2-2 0. O RT E P o f 2 2, th e r m a l e l l i p s o i d s a r e d r a wn a t 5 0 % p r o b a b i l i t y.

C r y s t a l d a t a f o r 2 2 ( C C D C 1 8 3 5 9 9 7 ) : C3 0H3 0N6O2∙ C3H8O , M W = 5 6 6 . 7 0 ; c r y s t a l s i z e , 0 . 1 8 x 0 . 11 x 0 . 0 5 m m ; co l o r l e s s , b l o c k ; t r i c l i n i c, s p a c e g r o u p P-1 , a = 8 .4 3 8 1 4 ( 1 9 ) Å , b

= 11 .0 8 9 0 ( 2 ) Å , c = 1 6 .3 1 2 7 ( 3 ) Å , α = 8 1 .3 4 3 2 ( 1 6 ) ° , β = 8 2 .8 8 1 5 ( 1 6 ) ° , γ = 8 6 .0 3 1 8 ( 1 7 ) ° , V = 1 4 9 5 .3 8 ( 5 ) ų, Z = 2 , D x = 1 .2 5 8 g / c m³, T = 1 0 0 K , μ = 0 .6 6 2 m m^-1, λ = 1 .5 4 1 8 4 Å , R1 = 0 .0 4 1 , w R2 = 0 .1 0 3 .

96

F i g u re 2-2 1. O RT E P o f 2 3, th e r m a l e l l i p s o i d s a r e d r a wn a t 5 0 % p r o b a b i l i t y.

C r y s t a l d a t a f o r 2 3 ( C C D C 1 8 3 5 9 9 8 ) : C3 0H3 1N7O , M W = 5 0 5 .6 2 ; c r y s t a l s i z e , 0 .1 3 x 0 . 11 x 0 .0 7 m m ; c o l o r l e s s , p l a t e l e t ; t r i c l i n i c , s p a c e g r o u p P-1 , a = 9 .1 7 4 2 ( 2 ) Å , b = 1 2 . 0 4 6 1 ( 3 ) Å , c = 1 3 . 0 7 0 0 ( 3 ) Å , α = 8 8 . 6 4 1 ( 6 ) ° , β = 6 9 . 9 4 6 ( 5 ) ° , γ = 7 4 .9 7 0 ( 5 ) ° , V = 1 3 0 7 .0 3 ( 8 ) ų, Z

= 2 , D x = 1 . 2 8 5 g / c m³, T = 1 0 0 K , μ = 0 . 6 4 8 m m^-1, λ = 1 .5 4 1 8 7 Å , R1 = 0 . 0 6 9 , w R2 = 0 . 1 6 3 .

F i g u re 2-2 2. O RT E P o f 1 5, th e r m a l e l l i p s o i d s a r e d r a wn a t 5 0 % p r o b a b i l i t y.

C r y s t a l d a t a fo r 1 5 ( C C D C 1 8 3 5 9 9 9 ) : C2 4H2 6N6O , M W = 4 1 4 . 5 1 ; c r y s t a l s i z e , 0 . 2 1 x 0 .0 4 x 0 . 0 4 m m ; c o l o r l e s s , n ee d l e ; m o n o c l i n i c , s p a c e g r o u p P21/ c , a = 1 6 . 5 9 9 9 0 ( 1 6 ) Å , b = 1 3 . 4 1 8 4 0 ( 1 2 ) Å , c = 2 1 .1 7 7 2 ( 2 ) Å , α = γ = 9 0 ° , β = 11 0 . 9 8 6 0 ( 1 2 ) ° , V = 4 4 0 4 .2 0 ( 8 ) ų, Z

= 8 , D x = 1 . 2 5 0 g / c m³, T = 1 0 0 K , μ = 0 . 6 3 9 m m^-1, λ = 1 .5 4 1 8 7 Å , R1 = 0 . 0 3 7 , w R2 = 0 . 0 9 3 .

97 P h y s i c o c h em i c a l p r o p e r t y

E v a l u a t i o n o f s o l u b i l i t y . S m a l l v o l u m e s o f c o m p o u n d s o l u t i o n d i s s o lv e d i n D M S O w e r e a d d e d to t h e a q u e o u s b u f f er s o l u t i o n ( p H 6 . 8 ) . Af t e r i n cu b a t i o n , p r e c ip i t a t e s w e r e s e p a r a t ed b y f i l t r a t io n . T h e s o l u b i l i t y w a s d e t e r m i n e d b y U V ab s o r b a n c e o f e a ch f i l t r a t e.

P a r a l l e l a rt i f i c i a l m e m b ra n e p e r m ea b i l i t y a s s a y ( P A M P A ) . T h e d o n o r w e l l s w e r e f i l l e d w i t h 2 0 0 µ L o f P R I S M A H T b u f f e r ( p H 7 . 4 , p I O N i n c .) c o n t a i n i n g 1 0 µ m o l / L t e s t c o m p o u n d . T h e f i l t e r o n th e b o t t o m o f e a c h a c c ep t o r w e l l w a s c o a t e d w i t h 4 µ L o f a G I T -0 L i p i d So l u t i o n ( p I O N I n c . ) a n d f i l l e d w i t h 2 -0 -0 µ L o f A c c ep t o r S i n k B u f f e r ( p I O N i n c. ) . T h e a c c e p t o r f i l t e r p l a t e w a s p u t o n t h e d o n o r p l a t e a n d i n cu b a t e d f o r 3 h a t r o o m t e m p e r a t u r e . Af t e r th e in c u b a t i o n , t h e a m o u n t o f t e s t c o m p o u n d i n b o t h th e d o n o r a n d a c c ep t o r w e l l s w a s m e a s u r ed b y L C / M S / M S .

E v a l u a t i o n o f L o g D . L o g D 7 .4 , w h i c h i s a p a r t i t i o n co e f f i c i en t b e t w e e n 1 - o c t a n o l an d a q u e o u s b u f f e r p H 7 . 4 , o f t h e c o m p o u n d s w a s m e a s u r e d o n th e c h r o m a t o g r a p h i c p r o c ed u r e w h o s e c o n d i t i o n w a s d e v e l o p ed b a s e d o n a p u b l i s h e d m e t h o d ( N a k a s h i m a e t a l., 2 0 1 3 ; M a s u m o t o e t a l. , 1 9 9 5 ) .

98 2 . 5 参 考 文 献

B ö s k e n C . A . , F a r n u n g L . , H i n t e r m a i r C . , M e r z e l S c h a c h t e r M ., Vo g e l - B a c h m a y r K . , B l a z e k D . , A n a n d K . , F i s h e r R P. , E i c k D . , G ey e r M . T h e s t r u c t u r e a n d s u b s t r a t e s p e c i f i c i t y o f h u m a n C d k 1 2 / C y c l i n K . N a t . C o m m u n . 2 0 1 4, 5, 3 5 0 5 .

B r a m e l d , K . A . ; K u h n , B . ; R e u t e r, D . C . ; S t a h l , M. S m a l l m o l e cu l e c o n f o r m a t i o n a l p r e f e r en c e s d e r i v e d f r o m c r y s t a l s t r u c t u r e d a t a . A m e d i c i n a l ch e m i s t r y f o cu s e d a n a l y s i s . J . C h e m . I n f. M o d e l . 2 0 0 8, 4 8, 1 – 2 4 .

B u r l a , M . C . ; C a l i a n d r o , R . ; C a m a l l i , M . ; C a r r o z z i n i , B . ; C a s c a r a n o , G . L . ; D e C a r o , L . ; G i a c o v a z z o , C . ; P o l i d o r i , G . ; S i l i q i , D . ; S p a g n a , R . I L M I L I O N E : a s u i t e o f c o m p u t e r p r o g r a m s f o r c r y s t a l s t r u c t u r e s o lu t i o n o f p r o t e i n s . J. A p p l. C r y s t a l l o g r. 2 0 0 7, 4 0, 6 0 9 – 6 1 3 .

C h e n V. B . , A r e n d a l l W. B . 3 r d , H e a d d J . J . , K e ed y D . A . , I m m o r m i n o R . M ., K a p r a l G . J., M u r r a y L . W. , R i c h a r d s o n J . S . , R i c h a r d s o n D . C . Mo l P r o b i t y : a l l-a t o m s t r u c t u r e v a l id a t i o n f o r m a c r o m o l e cu l a r cr y s t a l l o g r a p h y. A c t a C r y s t a l l o g r. D B i o l. C r y s t a l l o g r.

2 0 1 0, 6 6, 1 2 – 2 1 .

C h o , S .-J . ; K i m , Y.-J . ; S u r h , Y.-J . ; K i m , B . M. ; L e e , S .-K . I b u l o c y d i n e i s a n o v e l p r o d r u g C d k i n h i b i t o r t h a t e ff e c t i v e ly i n d u c e s a p o p to s i s i n h e p a t o c e l l u l a r c ar c i n o m a c e l l s . J . B i o l . C h e m . 2 0 11, 2 8 6, 1 9 6 6 2 – 1 9 6 7 1 .

C h u , X .-J . ; D e P i n t o , W. ; B a r t k o v i t z , D . ; S o , S .-S . ; Vu , B . T. ; P a c k m an , K . ; L u k a c s , C . ; D i n g , Q . ; J i a n g , N . ; Wa n g , K . ; G o e l z e r, P. ; Yi n , X . ; S m i t h , M. A . ; H i g g i n s , B . X. ; C h e n , Y. ; X i a n g , Q . ; M o l i t e r n i , J . ; K a p l a n , G . ; G r a v e s , B . ; L o v e y, A . ; F o to u h i , N . D i s c o v er y o f [ 4-a m in o-2-( 1-m e t h a n e s u l f o n y lp i p e r id i n-4-y l a m in o ) p y r i m id i n-5-y l] ( 2 ,3-d i f lu o r o-6

-m e th o x y p h e n y l) -m e t h an o n e ( R 5 4 7 ) , a p o t e n t an d s e l e c t i v e cy c l i n-d e p en d en t k i n a s e i n h i b i t o r w i t h s i g n i f i c a n t in v iv o an t i t u m o r a c t i v i t y. J. M e d . C h e m . 2 0 0 6, 4 9, 6 5 4 9 – 6 5 6 0 .

C o l l a b o r a t i v e C o m p u t i n g P r o j e c t T h e C C P 4 s u i t e : p r o g r a m s f o r p r o t e i n cr y s t a l l o g r a p h y.

A c t a C r y s t a l l o g r. D B i o l . C r y s t a l l o g r. 1 9 9 4, 5 0, 7 6 0 – 7 6 3 .

99

D i x o n-C l a r k e, S . E . ; E l k in s , J . M . ; C h e n g , S . W. G . ; M o r i n , G . B . ; B u l l o c k , A . N . S t r u c tu r e s o f t h e C D K 1 2 / C y c K c o m p l e x w i t h A M P-P N P r e v e a l a f l e x i b l e C-t e r m i n a l k in a s e e x t e n s i o n i m p o r t a n t f o r AT P b i n d i n g . S c i . R e p. 2 0 1 5, 5, 1 7 1 2 2 .

E m s l e y, P. , C o w t a n , K . C o o t : m o d e l-b u i l d in g t o o l s f o r m o l e c u l ar g r a p h i c s . A c ta C r y s t a l l o g r. D B i o l. C r y s t a l l o g r. 2 0 0 4, 6 0, 2 1 2 6 – 2 1 3 2 .

G u r a m , A . S . ; K i n g , A . O . ; A l l e n , J . G . ; Wa n g , X . ; S c h e n k e l , L . B . ; C h a n , J . ; B u n e l , E . E . ; F a u l , M . M . ; L a r s en , R . D . ; M a r t i n e l l i , M . J . ; R e i d e r, P. J . N e w a i r-s t a b l e c a t a l y s t s f o r g en e r a l a n d e ff i c i en t S u zu k i − M i y au r a c r o s s-c o u p l i n g r e a c t i o n s o f h e t er o a r y l ch l o r id e s . O rg . L e t t . 2 0 0 6, 8, 1 7 8 7 – 1 7 8 9 .

H i l p e r t, H . ; M a u s e r, H . ; H u m m , R . ; A n s e l m , L . ; K u eh n e , H . ; H ar t m a n n , G . ; G r u e n e r, S . ; B a n n e r, D . W. ; B e n z , J . ; G s e l l , B . ; K u g l s t a t t e r, A . ; S t i h l e , M . ; T h o m a , R . ; S a n ch e z , R . A . ; I d i n g , H . ; Wi r z , B . ; H a a p , W. I d en t i f i c a t i o n o f p o t e n t a n d s e l e c t i v e c a t h ep s i n S i n h i b i t o r s c o n t a i n i n g d i ff er e n t c e n tr a l c y c l i c s c a ff o l d s . J . M ed . C h e m . 2 0 1 3, 5 6 , 9 7 8 9 – 9 8 0 1 .

H u an g , Q . ; J o h n s o n , T. W. ; B a i l e y, S . ; B r o o u n , A . ; B u n k e r, K . D . ; B u r k e , B . J . ; C o l l i n s , M . R . ; C o o k , A . S . ; C u i , J . J . ; D a c k , K . N . ; D e a l , J . G . ; D e n g , Y.-L . ; D i n h , D . ; E n g s t r o m , L . D . ; H e , M . ; Ho ff m a n , J . ; H o ff m a n , R . L . ; J o h n s o n , P. S . ; K a n i a , R . S . ; L a m , H. ; L a m , J . L . ; L e, P. T. ; L i , Q. ; L i n g ar d o , L . ; L i u , W. ; L u , M . W. ; M c Tig u e , M . ; P a l m e r, C . L . ; R i c h a r d s o n , P. F. ; S a c h , N . W. ; S h en , H . ; S m e a l , T. ; S m i t h , G . L . ; S t e w a r t , A . E . ; Ti m o f e e v s k i, S . ; Ts a p a r ik o s , K . ; Wa n g , H . ; Z h u , H . ; Z h u , J . ; Z o u , H . Y. ; E d w a r d s , M . P.

D e s i g n o f p o t e n t an d s e l e c t i v e in h i b i t o r s t o o v er c o m e c l i n i c a l a n ap l a s t i c l y m p h o m a k in a s e m u t a t i o n s r e s i s t a n t t o c r i zo t i n i b . J . M e d . C h e m . 2 0 1 4, 5 7, 11 7 0 – 11 8 7 .

I s h iy a m a , T. ; M i y a u r a , N . M e t a l-c a t a ly z e d r e a c t i o n s o f d i b o r o n s f o r s y n t h e s i s o f o rg a n o b o r o n c o m p o u n d s . T h e C h e m i ca l R e c o rd 2 0 0 4, 3, 2 7 1 – 2 8 0 .

J o h an n e s , J . ; D e n z, C . R . ; S u , N . ; Wu , A . ; I m p a s t a t o , A . C . ; M l y n a r s k i , S . ; Va r n e s , J . G . ; P r i n c e, D . B . ; C i d a d o , J . ; G a o , N . ; H a d d r i c k , M . ; J o n e s , N . H . ; L i , S . ; L i , X . ; L i u , Y. ; N g u y e n , T. B . ; O ' C o n n e l l , N . ; R i v e r s , E . ; R o b b i n s , D . W. ; To m l i n s o n , R . ; Yao , T. ;

100

F e rg u s o n , A . D . ; L a m b , M . L . ; M a n ch e s t e r, J . I . ; G u i c h a r d , S . S t r u c t u r e b a s e d s e s i g n o f a e l e c t i v e n o n-c o v a l e n t C D K 1 2 i n h i b i t o r s . C h e m M ed C h e m 2 0 1 8, 1 3, 2 3 1-2 3 5 .

K a r am a n , M . W. ; H e r rg a r d , S . ; Tr e i b e r, D. K . ; G a l l an t , P. ; A t t e r i d g e , C . E . ; C a m p b e l l , B . T. ; C h a n , K . W. ; C i c e r i , P. ; D a v i s , M . I . ; E d e e n , P. T. ; F a r ao n i , R . ; F l o y d , M . ; Hu n t , J . P. ; L o c k h ar t , D . J . ; M i l a n o v, Z . V. ; Mo r r i s o n , M . J . ; P a l l a r e s , G . ; P a t e l , H . K . ; P r i t c h ar d , S . ; Wo d i c k a , L . M . ; Z ar r i n k a r, P. P. A q u a n t i t a t i v e a n a ly s i s o f k i n a s e i n h i b i t o r s e l e c t i v i t y.

N a t u re B io t e c h n o l . 2 0 0 8, 2 6, 1 2 7 – 1 3 2 .

K o ch , P. ; L au f e r, S . U n e x p e c t e d r e a c t io n o f 2-a l k y l s u l f a n y l i m i d a z o l e s to i m id a z o l-2-o n e s : P y r id i n y l i m id a z o l-2-o n e s a s n o v e l p o t en t p 3 8 α m i t o g en-a c t i v a t e d p r o t e in k i n a s e i n h i b i t o r s . J . M e d . C h e m . 2 0 1 0, 5 3, 4 7 9 8 – 4 8 0 2 .

L i m , S . ; K a l d i s , P. C d k s , cy c l i n s a n d C K I s : r o l e s b ey o n d c e l l cy c l e r e g u l a t i o n . D e v e l o p m e n t 2 0 1 3, 1 4 0, 3 0 7 9 – 3 0 9 3 .

M a s u m o t o , K . ; T ak e y a s u , A . ; O i zu m i , K . ; K o b a y a s h i , T . S t u d i e s o f n o v e l 1 , 4 -d ih y -d r o p y r i -d in e C a a n t a g o n i s t C S - 9 0 5 . I . M e a s u r em e n t o f p ar t i t i o n c o ef f i c i e n t ( l o g P ) b y h ig h p e r f o r m an c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( H P L C ) . Y a ku g a k u Z a s s h i 1 9 9 5, 1 1 5, 2 1 3–2 2 0 .

M c C o y, A . J . , G r o s s e-K u n s t l e v e , R . W. , A d a m s , P. D . , Wi n n , M . D . , S t o r o n i , L . C . , R e a d , R . J . P h a s e r cr y s t a l l o g r a p h i c s o f t w a r e. J . A p p l . C r y s t . 2 0 0 7, 4 0, 6 5 8 – 6 7 4 .

M i y au r a , N . ; S u z u k i , A . P a l l a d iu m-c a t a ly z e d c r o s s-c o u p l i n g r e a c t i o n s o f o rg an o b o r o n c o m p o u n d s . C h e m . R e v. 1 9 9 5, 9 5, 2 4 5 7 – 2 4 8 3 .

M u r s h u d o v G . N . , Va g i n A . A . , D o d s o n E . J . R e f i n e m en t o f m a c r o m o l e cu l a r s t r u c t u r e s b y t h e m ax i m u m-l i k e l i h o o d m e th o d . A c t a C r y s t a l l o g r. D B i o l . C r y s t a l l o g r. 1 9 9 7, 5 3, 2 4 0 – 2 5 5 .

N a k a s h im a , S . ; Y a m a m o to , K . ; A r a i , Y . ; I k e d a , Y . I m p a c t o f p h y s i c o ch e m i c a l p r o f i l i n g f o r r a t i o n a l ap p r o a c h o n d r u g d i s c o v e r y . C h e m . P h a r m . B u l l . 2 0 1 3, 6 1, 1 2 2 8–1 2 3 8 .

101

N a t r a j an , R . ; Wi l k e r s o n , P. M . ; M ar c h i ò , C . ; P i s c u o g l i o , S . ; N g , C . K . Y. ; Wa i , P. ; L a m b r o s , M . B . ; S a m a r t z i s , E . P. ; D e d e s , K . J . ; F r a n k u m , J . ; B a j r a m i , I . ; K o p e c , A . ; M a c k a y, A . ; A ' H e r n , R . ; F e n w i c k , K . ; K o za r e w a , I . ; H a k a s , J . ; M i t s o p o u lo s , C . ; H a r d i s s o n , D . ; L o r d , C . J . ; K u m a r-S i n h a , C . ; A s h w o r t h , A . ; We i g e l t , B . ; S a p i n o , A . ; C h i n n a i y a n , A . M . ; M a h e r, C . A . ; R e i s-F i l h o , J . S . C h ar a c t e r i z a t i o n o f t h e g en o m i c f e a tu r e s a n d ex p r e s s e d f u s i o n g en e s i n m i c r o p a p i l l ar y c a r c in o m a s o f t h e b r e a s t . J . P a th o l . 2 0 1 4, 2 3 2, 5 5 3 – 5 6 5 .

O n o , K . ; I t o , M . ; Ta n ak a , T. ; A s a n o , M . ; H i r a y a m a, T. ; F u j i m o t o , J . ; S a k a u c h i , N . ; H ir a t a , Y. ; To i t a , A . ; M o r i s h i t a , N . ; K o k u b o , H . ; I m a e d a , Y. ; M a e za k i , H . ; C a r y, D . R . ; M i z o j i r i , R . ; C h o , N . ; B a n n o , H . ; To k u h ar a , H . ; A r i k a w a , Y. H e t e r o cy c l i c c o m p o u n d . P C T I n t . A p p l.

W O 2 0 1 9 / 1 8 9 5 5 5 A 1 , O c t . 3 , 2 0 1 9 .

O s b o r n e , J . D . ; M a t t h e w s , T. P. ; M c H ar d y, T. ; P r o i s y, N . ; C h e u n g , K .-M . J . ; L a in c h b u r y, M . ; B r o w n , N . ; Wa l t o n , M. I . ; E v e, P. D . ; B o x a l l , K. J . ; H a y e s , A . ; H e n l e y, A . T. ; Va l e n t i , M . R . ; D e H a v en B r a n d o n , A. K . ; B o x , G . ; J a m in , Y. ; R o b i n s o n , S . P. ; We s t w o o d , I . M . ; v an Mo n t f o r t , R . L . M . ; L e o n a r d , P. M . ; L a m e r s , M . B . A . C . ; R e a d e r, J . C . ; A h e r n e , G . W. ; R a y n a u d , F. I . ; E c c l e s , S . A . ; G a r r e t t , M . D . ; C o l l i n s , I . M u l t i p ar a m e t e r l e a d o p t i m i z a t i o n t o g i v e a n o r a l c h e ck p o in t k i n a s e 1 ( C H K 1 ) i n h i b i t o r c l i n i c a l c a n d i d a t e : ( R ) -5-( ( 4-( ( M o r p h o l in-2-y l m e th y l ) a m in o )-5-( t r i f l u o r o m e th y l ) p y r id i n-2-y l ) am i n o ) p y r a z i n e-2 -c a r b o n i t r i l e ( C C T 2 4 5 7 3 7 ) . J . M e d . C h e m . 2 0 1 6, 5 9, 5 2 2 1 – 5 2 3 7 .

O t w i n o w s k i , Z . , M i n o r, W. P r o c e s s i n g o f X-r a y d i ff r a c t i o n d a t a co l l e c t e d i n o s c i l l a t i o n m o d e . M e t h o d s E n z y m o l . 1 9 9 7, 2 7 6, 3 0 7 – 3 2 6 .

P a c u l o v á , H . ; K o h o u t e k , J . , T h e e m e rg in g r o l e s o f C D K 1 2 i n t u m o r ig e n e s i s . C e l l D i v.

2 0 1 7, 1 2, 7 .

P h i l i p , S . ; K u m a r a s i r i , M . ; Te o , T. ; Yu , M . ; Wa n g , S . , C y c l i n-D e p e n d e n t K in a s e 8 : A N e w H o p e i n Ta rg e t ed C a n c e r T h e r a p y ? J . M e d . C h e m . 2 0 1 8, 6 1, 5 0 7 3 – 5 0 9 2 .

102

Q u er e d a , V. ; B a y l e , S . ; Ve n a, F. ; F r y d m an , S. M . ; M o n a s t y r s k y i , A . ; R o u s h , W. R . ; D u ck e t t , D. R . T h er a p e u t i c t a rg e t i n g o f C D K 1 2 / C D K 1 3 in tr i p l e-n e g a t iv e b r e a s t ca n c e r.

C a n c e r C e l l 2 0 1 9, 3 6, 5 4 5 – 5 5 8 . e 7 .

R u i z-C a s t i l l o , P. ; B u c h w a ld , S . L . A p p l i c a t i o n s o f p a l l a d i u m-c a t a l y z ed C – N c r o s s-c o u p l i n g r e a s-c t io n s . C h e m i c a l R e v i e w s 2 0 1 6, 11 6, 1 2 5 6 4 – 1 2 6 4 9 .

S a l o m o n - F e r r e r , R . ; C a s e , D . A . ; W a l k e r , R . C . , A n o v er v i e w o f t h e A m b er b i o m o l e c u l a r s i m u l a t i o n p a ck a g e . W I R E s C o m p u t . M o l . S c i . 2 0 1 3, 3, 1 9 8–2 1 0 .

S c h är f e r, C . ; S c h u l z-G a s c h , T. ; E h r l i c h , H.-C . ; G u b a , W. ; R a r e y, M . ; S t a h l , M . To r s i o n a n g l e p r e f er e n c e s i n d r u g l i k e c h e m i c a l s p a c e : A c o m p r e h e n s i v e g u id e . J. M e d . C h e m . 2 0 1 3, 5 6, 2 0 1 6 – 2 0 2 8 .

S h e l d r i c k , G . A s h o r t h i s t o r y o f S H E L X . A c t a C r y s t a l l o g r. S e c t. A 2 0 0 8, 6 4, 11 2 – 1 2 2 .

S a i t o S . ; T o r i u m i Y . ; T o m i o k a N. ; I t a i A . T h e o r e t i c a l s t u d i e s o n c i s- am i d e p r e f e r en c e i n N- m e t h y l a n i l i d e s . J. O rg . C h e m . 1 9 9 5, 6 0, 4 7 1 5–4 7 2 0 .

Z h a n g , T. ; K w i a t k o w s k i , N . ; O l s o n , C . M. ; D ix o n-C l a r k e , S . E . ; A b r a h am , B . J . ; G r e i f en b e rg , A . K . ; F i c a r r o , S . B . ; E l k in s , J . M . ; L i a n g , Y. ; H a n n e t t , N . M . ; M an z , T. ; H a o , M . ; B a r t k o w i a k , B . ; G r e en l e a f , A . L . ; M a r to , J . A . ; G e y e r, M . ; B u l l o c k , A . N . ; Yo u n g , R . A . ; G r a y, N . S . C o v a l e n t t a rg e t i n g o f r e m o t e cy s t e i n e r e s i d u e s t o d e v e lo p C D K 1 2 an d C D K 1 3 in h i b i t o r s . N a t . C h e m . B io l . 2 0 1 6, 1 2, 8 7 6 – 8 8 4 .

103

第 三 章 選 択 的 B r r 2阻 害 剤 、4 , 6 -ジ ヒ ド ロ ピ リ ド[ 4 ,3 - d ]ピ リ ミ ジ ン- 2 , 7 ( 1 H , 3 H ) -ジ オ ン 誘 導 体 お よ び ス ピ ロ[イ ン ド ー ル- 3 , 2 ’ -ピ ロ リ ジ ン] - 2 ( 1 H ) -オ ン 誘 導 体 の 発 見

3 . 1 化 合 物 探 索 戦 略 、 化 合 物 発 見 ま で の 過 程 お よ び 生 物 活 性 の 評 価

筆 者 は 、 癌 治 療 薬 の 標 的 と し て の B r r 2 の バ リ デ ー シ ョ ン を 目 的 と し 、 低 分 子 プ ロ ー ブ と し て 利 用 可 能 な 選 択 的 B r r 2阻 害 剤 の 創 出 に 取 り 組 ん だ^*。

一 般 に ヘ リ カ ー ゼ ア ッ セ イ を 用 い て 化 合 物 ス ク リ ー ニ ン グ を 行 う と 、 核 酸 結 合 性 物 質 の よ う な 擬 陽 性 化 合 物 が 多 数 得 ら れ る 。 こ の た め 選 択 的 な ヘ リ カ ー ゼ 阻 害 剤 の 探 索 は 難 し い と 言 わ れ て い る ( S h ad r i c k e t a l. , 2 0 1 3 )。 ヘ リ カ ー ゼ は 、D N A や R N A の 二 本 鎖 を 解 く た め に AT P の 加 水 分 解 に よ る エ ネ ル ギ ー を 利 用 す る 。 言 い 換 え れ ば 、 ヘ リ カ ー ゼ は ヘ リ カ ー ゼ 活 性 に 加 え て AT P a s e 活 性 と い う も う 一 つ の 酵 素 活 性 を 持 っ て お り 、 標 的 と す る ヘ リ カ ー ゼ の

AT P a s e 活 性 を 阻 害 す る 化 合 物 は 、 同 時 に R N A u n w i n d i n g 活 性 (ヘ リ カ ー ゼ 活 性) も 阻 害 す

る と 考 え ら れ る 。R N A ヘ リ カ ー ゼ フ ァ ミ リ ー に 属 す る タ ン パ ク 質 は R N A 依 存 AT P a s e と も 呼 ば れ て お り 、 基 質 と な る R N A や s n R N Pの 非 共 存 下 で は 無 駄 な AT P の 加 水 分 解 を 起 こ さ な い 様 に 制 御 さ れ て い る ( A b s m e i e r e t a l. , 2 0 2 0 )。 つ ま り 、R N A 共 存 下 で AT P a s e活 性 を 評 価 す る こ と に よ り 阻 害 剤 を ス ク リ ー ニ ン グ す る こ と も 可 能 と 考 え ら れ る ( S h ad r i c k e t a l. ,

2 0 1 3 )。 筆 者 は 、 ま ず R N A 依 存 AT P a s e ア ッ セ イ を 用 い て ハ イ ス ル ー プ ッ ト ス ク リ ー ニ ン グ

を 行 い 、 ヒ ッ ト 化 合 物 の プ ロ フ ァ イ ル の 検 証 を し 、 化 合 物 の 化 学 最 適 化 に よ り AT P a s e 活 性 を 増 強 し た 後 、 最 後 に ヘ リ カ ー ゼ 阻 害 活 性 を 確 認 す る と い う 戦 略 を 採 用 す る こ と と し た^{* *}。

*本 章 の 生 物 活 性 評 価 は 、 岩 谷 美 沙 博 士 に 、 タ ン パ ク 質 の 調 製 お よ び ハ イ ス ル ー プ ッ ト ス ク リ ー ニ ン グ は 、 三 輪 真 敬 氏 、 伊 藤 隆 司 氏 、 大 久 保 尚 一 博 士 、 邊 田 勉 氏 、 山 東 尚 氏 、 大 西 智 美 氏 に 、 リ ガ ン ド-タ ン パ ク 質 の 共 結 晶 化 お よ び X -線 共 結 晶 構 造 解 析 は 、M i c h a e l G . K l e i n 博 士 、 R i c h a r d T j h en 博 士 、L i n g Q i n 博 士 、 ド ッ キ ン グ モ デ ル の 構 築 は 、 米 森 和 子 氏 に そ れ ぞ れ 実 施 し て 頂 い た 。

* *評 価 化 合 物 の B r r 2 お よ び そ の 他 の ヘ リ カ ー ゼ の R N A 依 存 AT P a s e 活 性 の 阻 害 能 は 、

A D P - G l o ア ッ セ イ ( P r o m eg a ) を 用 い て 評 価 し 、 産 生 す る A D P量 を 発 光 値 と し て 検 出 し 、

結 果 を I C5 0 値 と し て 算 出 し た 。 化 合 物 の B r r 2 の R N A u n w i n d i n g 阻 害 活 性 (ヘ リ カ ー ゼ 阻 害 活 性) は 、 蛍 光 ラ ベ ル 化 し た R N A を 用 い た 電 気 泳 動 法 に よ り 、 二 本 鎖 の ま ま の R N A と 解 か れ た 一 本 鎖 の R N A の 量 を そ れ ぞ れ 蛍 光 値 と し て 定 量 す る こ と で 評 価 し 、 結 果 を I C5 0値 と し て 算 出 し た (詳 細 は 実 験 の 部 に 記 載)。

104

筆 者 は 、 武 田 薬 品 工 業 の 社 内 化 合 物 ラ イ ブ ラ リ ー の ハ イ ス ル ー プ ッ ト ス ク リ ー ニ ン グ に よ り 、3 つ の 構 造 的 に 異 な る ヒ ッ ト 化 合 物 、4 , 6 -ジ ヒ ド ロ ピ リ ド [ 4 , 3 -d]ピ リ ミ ジ ン

-2 , 7 ( 1H, 3H) -ジ オ ン 誘 導 体 4 8お よ び 5 -イ ミ ノ- 7 -オ キ ソ- 5H- [ 1 , 3 , 4 ]チ ア ジ ア ゾ ロ[ 3 , 2 -a]ピ リ ミ ジ ン 誘 導 体 4 9、 ス ピ ロ[イ ン ド ー ル- 3 , 2 ’ -ピ ロ リ ジ ン] - 2 ( 1H) -オ ン 誘 導 体 5 0 を 見 出 し た ( F i g u r e 3 - 1 )。

< 4 , 6 -ジ ヒ ド ロ ピ リ ド[ 4 , 3 -d]ピ リ ミ ジ ン- 2 , 7 ( 1H, 3H) -ジ オ ン 誘 導 体>

F i g u r e 3 - 1 ハ イ ス ル ー プ ッ ト ス ク リ ー ニ ン グ に よ り 見 出 さ れ た ヒ ッ ト 化 合 物 の 構 造

本 節 で は 、 ま ず 化 合 物 4 8 お よ び 4 9 に 関 し て 記 述 す る 。 こ の 節 で は 、2 つ の シ リ ー ズ の 検 証 、 最 適 化 の 過 程 を 平 行 し て 記 述 す る こ と に よ る 混 乱 を 避 け る た め 、 あ ら か じ め F i g u r e 3 - 2 に そ れ ぞ れ の シ リ ー ズ の 検 証 、 最 適 化 過 程 の 概 要 を 示 し た 。

ま ず 、 ス ク リ ー ニ ン グ で 見 出 さ れ た そ れ ぞ れ の ケ ミ カ ル シ リ ー ズ を 構 造 活 性 相 関 、X 線 共 結 晶 構 造 解 析 、 選 択 性 試 験 に よ り さ ら に 検 証 し た 。 化 合 物 4 8 の 類 縁 体 で あ る 化 合 物 5 2 は 、

B r r 2 の ア ロ ス テ リ ッ ク サ イ ト に 結 合 す る こ と が X 線 共 結 晶 構 造 解 析 に よ り 明 ら か と な り 、 一

方 で 化 合 物 4 9 の 類 縁 体 で あ る 化 合 物 5 5 は 、R N A サ イ ト に 結 合 す る こ と が 判 明 し た 。 ア ロ ス テ リ ッ ク 阻 害 剤 5 2 の 方 が R N A サ イ ト 結 合 化 合 物 5 5 と 比 較 し て よ り B r r 2 選 択 性 に 優 れ て い た こ と か ら 、 化 合 物 5 2 を リ ー ド 化 合 物 と し て 選 択 し 、 さ ら な る 最 適 化 を 行 っ た 。S t r u c t u r e B a s e d D r u g D e s i g n ( S B D D ) を 用 い た 構 造 の 単 純 化 に よ り 、 よ り 活 性 の 強 い 化 合 物 5 7 を 見 出 し た 。 さ ら に S B D D を 駆 使 し て 5 7 の 最 適 化 を 行 い 、1 0^{- 8}M オ ー ダ ー の B r r 2 A T P a s e 阻 害 活 性 と 優 れ た B r r 2 選 択 性 、 良 好 な 水 溶 性 と 膜 透 過 性 、B r r 2 ヘ リ カ ー ゼ 阻 害 活 性 を 示 す 化 合 物 6 0 を 見 出 す こ と に 成 功 し た 。 各 過 程 の 詳 細 を 以 下 に 示 す 。

105

F i g u r e 3 - 2 . B r r 2 阻 害 剤 の 発 見 プ ロ セ ス の フ ロ ー チ ャ ー ト

ま ず B r r 2 阻 害 活 性 を 示 す た め の 鍵 と な る 官 能 基 や 部 分 構 造 を 明 ら か に す る た め に 、 化 合 物

4 8 お よ び 4 9 の 初 期 構 造 活 性 相 関 を 調 査 し た 。T a b l e 3 - 1 に 示 し た よ う に 、4 8 の ト リ フ ル オ ロ エ チ ル 基 を メ チ ル 基 (5 1) に 変 換 し た と こ ろ 大 幅 な 活 性 の 減 弱 が 見 ら れ 、 一 方 で よ り 嵩 高 い ベ ン ジ ル 基 (5 2) で は 活 性 の 向 上 が 見 ら れ た 。 化 合 物 5 2 の R2を 水 素 原 子 か ら メ チ ル 基 (5 3) に 変 換 す る と 活 性 が 減 弱 し 、R3 の メ チ ル 基 を 水 素 原 子 (5 4) に 変 換 し て も 活 性 は 保 持 さ れ た 。

一 方 で 、4 9 の 構 造 活 性 相 関 研 究 で は カ ル ボ キ シ 基 が 活 性 発 現 に 必 須 で あ る こ と が 明 ら か と な っ た (4 9 v s 5 6)、 ま た 末 端 の プ ロ ピ ル 鎖 は シ ク ロ ヘ キ サ ン 環 で 置 き 換 え 可 能 で あ る こ と が 判 明 し た (5 5) ( T a b l e 3 - 2 )。

106 T a b l e 3 - 1 . 化 合 物 4 8, 5 1–5 4 の 構 造 活 性 相 関

Compound R

1

R

2

R

3

Brr2 ATPase IC

5 0

(  M)

^a

48 (hit) C H

2

C F

3

H Me 36 (23 – 55)

51 M e H Me >100

52 B n H M e 5.3 (2.9 – 9.4) 53 B n Me M e >100 54 B n H H 1.7 (0.96– 3.2)

a n = 2 , 9 5 % c o n f i d e n ce i n t e r v a l s s h o w n i n p a r e n th e s e s .

T a b l e 3 - 2 . 化 合 物 4 9, 5 5 , 5 6の 構 造 活 性 相 関

Compound R

1

R

2

Brr2 ATPase

IC

5 0

(  M)

^a

49 C O O H n - P r 4.2 (2.6 –6.8)

55 C O O H c - H e x 5.3 (4.0 –7.1)

56 C l n -Pr >100

a n = 2 o r n = 4 , 9 5 % c o n f i d en c e i n t er v a l s s h o w n in p ar e n t h e s e s .

107

活 性 を 示 し た 化 合 物 に 関 し て B r r 2 と の 共 結 晶 化 を 試 み 、 化 合 物 5 2 お よ び 5 5 と B r r 2 の そ れ ぞ れ の 複 合 体 の X線 結 晶 構 造 を 明 ら か に し た ( F i g u r e 3 - 3 A )。F i g u r e 3 - 3 Bに は 、 そ れ ぞ れ の 化 合 物 の 結 合 様 式 の 拡 大 図 を 示 し て あ る 。

B r r 2 は 、2 つ の マ ル チ ド メ イ ン ヘ リ カ ー ゼ カ セ ッ ト か ら 構 成 さ れ る 。 い ず れ の カ セ ッ ト も 、

二 つ の R e c A 様 ド メ イ ン 、 ウ ィ ン グ へ リ ッ ク ス ( W H ) ド メ イ ン 、 お よ び 3 種 の ド メ イ ン (ヘ リ カ ル ブ ン ド ル ( H B ) ド メ イ ン 、 へ リ ッ ク ス-ル ー プ-へ リ ッ ク ス ( H L H ) ド メ イ ン 、 イ ム ノ グ ロ ブ リ ン 様 ( I G ) ) か ら 成 る S e c 6 3 ホ モ ロ ジ ー ユ ニ ッ ト で 構 成 さ れ て い る ( S a n t o s e t a l. ,

2 0 1 2 )。 二 つ の ヘ リ カ ー ゼ カ セ ッ ト の う ち N 末 端 カ セ ッ ト の み が A T P a s e 活 性 と R N A

u n w i n d i n g 活 性 (ヘ リ カ ー ゼ 活 性) を 有 す る こ と が 報 告 さ れ て い る ( K i m , e t a l. , 1 9 9 9 ; S a n t o s

e t a l. , 2 0 1 2 )。 一 方 で C 末 端 カ セ ッ ト は 不 活 性 で あ り 、 カ セ ッ ト 間 相 互 作 用 に よ り N 末 端 カ

セ ッ ト の 酵 素 活 性 を 増 強 し た り ( S a n t o s e t a l. , 2 0 1 2 )、 タ ン パ ク 質-タ ン パ ク 質 間 相 互 作 用 を 仲 介 す る プ ラ ッ ト ホ ー ム と し て 機 能 し た り し て い る と 考 え ら れ て い る ( A b s m e i e r e t a l. , 2 0 1 7 ; P e n a e t a l. , 2 0 0 9 ; v a n N u e s e t a l. , 2 0 0 1 ; Z h a n g e t a l. , 2 0 0 9 )。

共 結 晶 構 造 解 析 に よ り 、 化 合 物 5 2が C末 端 ヘ リ カ ー ゼ カ セ ッ ト の 第 二 R e c A ド メ イ ン と N 末 端 ヘ リ カ ー ゼ カ セ ッ ト の I g ド メ イ ン の 境 目 に 新 た に 形 成 さ れ た ア ロ ス テ リ ッ ク サ イ ト に 結 合 し て い る こ と が 明 ら か と な っ た ( F i g u r e 3 - 3 B 左 、F i g u r e 3 - 3 C お よ び F i g u r e 3 - 3 D )。 化 合

物 5 2 と B r r 2 の 共 結 晶 構 造 に は 以 下 の 4 つ の 重 要 な 特 徴 が あ っ た 。( 1 ) 化 合 物 5 2は 、U 字 型

の コ ン フ ォ メ ー シ ョ ン で 結 合 し て お り 、 そ の 結 合 サ イ ト は 5 つ の 芳 香 族 ア ミ ノ 酸 の 側 鎖 ( P h e 1 2 5 4 , P h e 1 2 5 5 , T y r 1 6 8 2 , P h e 1 7 1 3 , お よ び P h e 1 7 1 7 ) を 含 む 多 く の 疎 水 性 ア ミ ノ 酸 に 囲 ま れ て い る 。( 2 ) 化 合 物 5 2 の ピ リ ド ン 環 の カ ル ボ ニ ル 基 が 、I l e 1 6 8 1 の 主 鎖 の N H と 水 素 結 合 を 形 成 し て い る (距 離 は 2 . 7 Ǻ )。( 3 ) 化 合 物 5 2の R1の ベ ン ジ ル 基 は 、I l e 1 1 9 3 , P h e 1 2 5 5 , P h e 1 7 1 3 , P h e 1 7 1 7 , L e u 1 7 2 2 , お よ び I l e 1 6 8 1の 側 鎖 で 形 成 さ れ た 大 き な 疎 水 性 の 空 洞 を 占 有 し て い る 。( 4 ) 末 端 の 3 -フ ル オ ロ ピ リ ジ ニ ル 基 は 、T h r 1 1 9 7 , P r o 1 2 5 7 , A s p 1 7 1 2 , P h e 1 7 1 3 , L y s 1 7 1 6 , お よ び P h e 1 7 1 7で 形 成 さ れ る 小 さ な 空 洞 を 占 有 し て い る 。

ドキュメント内 RNA代謝に関与するタンパク質CDK12、Brr2およびeIF4A3を標的とした選択的阻害剤の発見 (ページ 56-113)