Cに冷却。

3

.ギ酸50μiを加え20 "C、 5分間インキュベート。

4

. ヒ ド ラ ジン 停 止 溶 液 *

1 8 0μ!とエタノール750μ!を加え、 よく 撹持した後、 - 8 0 oCで15分間放置。

5.15000rpm、 15分間遠心し、 ペレ ットに0.3M酢酸ナトリウム250 μl、 エタノール750μlを加え、 撹枠後再び- 80 oCで15分間放置。

6.15000rpm、 15分間遠心し、 遠心j農紡により乾燥させたペレ ット に1Mピペリジン60μiを添加し、 900Cで30分間インキュベート。

7.遠心濃縮後、 20μlの水を力ílえた。

8.遠心濃縮後、 20μlの水を加えた。

9.遠心濃縮後、 1 0μlのローデイ ング緩衝液*2を加え、 -2 0 oCで貯蔵 した。

C+T反応、

1

.水1 5μl、 標識DNA溶液5μ1 (40ng/5μ1 )を混ぜ、た。

2.00Cに冷却。

3.ヒドラジン30μlを加え20 "C、 5分間インキュベート。

4.ヒドラジン停止溶液>.< 1200μ!とエタノール750μiを加え、 よく 撹粋した後、 - 80 oCで15分間放置。

5以下の操作はA+G反応と同様にして行なった。

* 1ヒドラジン停止泌液�0.3M酢酸ナトリウム、 O.lmMEDTA、 2Sμg/ml仔牛 胸腺DNA

*2ローデイング緩衝液� 98%ホルムアミド、 0.025%キシレンシアノール、 ブ ロモフェノーjレブjレ一、 10mM EDTA

9.ゲルの銀染色86. 8 ^{7 )}

1

.ゲルをメタノールー酢酸水溶液、 次いでメタノールー酢酸ーグルタ jレアルデヒド水溶液中でそれぞれ1 5分間振とうした。 (固定) 2.脱イオン水中で5分間x3回洗j争後、 ジチオスレイトール水溶液

で3分間振とうした。 (増感)

、， 、， I，A

-3.再び脱イオン水で5分間]洗浄後間酸銀-アンモニアー水酸化ナトリ ウム水溶液で15分間振とうした。 (染色)

4.脱イオン水で5分!日J x 3回洗ffト後ホルムアルデヒドークエン酸水溶 液中で振とうした。 (現像)

5.この液に0.1---0.S%vjvになるまで酢酸を加えて3分間振とうした。

(現像停止)

6.最後に脱イオン水で2分間x3回洗浄した。

10.DNAのトポロジ_1

原核細胞の中でも真核細胞の中でも、 DNAは全てスーパーコイル をもった状態で存在している。 このスーパーコイル 状態のわかりや

すい例として、 閉環型のプラスミドDNAがあげられる。 DNAのス ーパー コイル 状態 は数学的には3つのパラメーターで表現される。

lつ は環状DNAを平面に広げた とき(プラスミ ドDNAのスーパー コイルを強制的に解かせた状態)にDNAに生じるらせん軸の ま わり の巻数L(Linking number)であり、 整数 となる。 2つ目は対象と する2本鎖DNAが2重らせんを形成するときのねじれ数(巻数)で ありTwisting number (T) と呼ばれる。 通常約10塩基対あたりlピ

ッチが安定であるために、 この他はDNA分子の総塩基対数を10で 割った値の前後で変化する。 LとTが等しい場合は環状DNAはスー パーコイjレ状態にはならず、 緩和された開環型になる。 3つ目が Wr ithing number (W)と呼ばれる数で、 これがスーパーコイルの

数を表し、

= L - Tの式で表現される。 L=Tの場合はw=Oとな り、

緩和状態を示す。 ところが、 L宇Tの場合、 W宇Oとなり、 DNA分子 まスーパーコイル状態をとる。

-189-Lは、 ある特定の環状DNA 分子においては 、 DNA鎖上に切断が起 こら ない限り変わらない固有の値である。 故に、 先の式よりWとT は相互に変化する 変数となり得る。 仮に、 もともとL<Tのプラスミ

ドDNAをWキOの状態に広げようとするならば、 LキTとならねばな らず、 環状DNA上でそれに見合うだけの2重らせんのねじれがほど けた状態になる。 その結果、 水素結合がはずれ、 一部塩基対が ほど けた箇所が生じ、 l本鎖音1$分が露出した状態になる 。 しかしこの状

態は不安定であり、 エネルギ一的に安定なスーパー コイル状態、に戻 ってしまうことになる(図6

)。 即ち、 スーパー コイルの形成と は、 環状2重らせん DNA分子が自分自身に内在する分子のひずみを

解消するために自分自身をねじることにより生じた状態、を示す。

33dwyd、zbdpb仁~~ら仁て、

、�

図6

多iのスーパー コイ ルをギfするプラスミドDNA L<Tの分子を平田上に広げるとしキTとなって， 1本鎖部分が現れ る不安定な椛造をとる(右側) . 通常は安定なスーパーコイル椛

造へ向かう(左側)

-190-司咽町

全て の生体中のDNAは自らを複製または転写しなければならない。

いず れ の場合にも、 必ずある特定のタ ンパクが結合し2本鎖を解離

させることから始まる。 このWf.献によって解離 の進行方向には正の スーパーコイルが誘起されるため、 複製や転写の初期の段階で は負 のスー パーコイル の存在によってこれら の生命活動がスムーズに開 始されるのである。 従って、 染色体DNAを含め て、 生体中のたいて いのDNAはL<T、 即ちW<Oで負のスーパーコイル状態にある。

平板状化合物が DNAに インターカレートするためには、 その塩基 対問を約3.4 A押し広げる必要がある。 塩基問を結ぶリン酸エステル とリボース環からなるパックボーンの距離は決まっ て いるから、 イ ンターカレーシ ョ ンによって、 DNA分子は巻戻し を受けざるを得な くなる(図6-2)。 従って、 約360であった隣り合う塩基対間の角度 は、 そ のインター カレータに回有の巻き戻し角併の分だけ減ること になる。

このとき、 DN A が負のスーパー コイルをもっ環状のプラスミド DN Aの場合 にはTの値がインター カレータに よって強制的に減らさ れるために、 結合反応、初期の段階ではTがしに近づき負のスーパーコ イルは緩和を受ける。 結合が進んでT がしより も小さくなるとW>O になり、 正のスーパーコイルが誘起されることになる。

-191-司咽『

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