プラスミドONAの光切断

pBR32 2プラスミドDN A (スーパーコイル型)に

2を共存させ

、

超高圧水銀灯(USHIO HB-SOI01AA+ローカ ットフィルタ一)を 用いてこれに可祝光( À孟390nm)を照身ずした。 照身す後フェノール :}1I1出をして反応溶液から2 を除去し た後、 アガロースゲjレ電気泳動 ( 1 0/0アガロース、10V/cm)を行ない、 DNA断片をエチジウムブロ ミドにより染色して切断の様子を観察した。

スーパ-コイル梢造(ccc)を持つDNAは、 その2重らせんのい ずれか一方の鎖のl箇所でも切断を受けると3次情造が開環型(

0

c )へと変化する。 電気ijk WJJによりc ccとocは容易に分離する ことが でき、 さらにエチジウムブロミド染色により20---30ngの感度で検

出できるのでcccD N Aは、 DNAの切断反応、において感受性の高い タ

-193-司咽r

ーゲットである。 プラスミドDNAの3程の3次構造の形態(ccc、

oc、 1)と、 その典型的なゲル電気泳動の泳動パターンは図2- 1 1に示 したとうりである。

13.光照射によるビオ口ーゲン還元体の観察

分子内のかなり速い逆電子移動を抑えたいので2に対して大過剰 (

1

0 000倍) のEDTA(犠牲試楽)を含む溶液をエッペ ンドjレフチ ューブ中に調製し た。 この溶液を数分間アjレゴンガスパブリングを

して脱酸素した後、 セロハンテープで密封して可視光( À註390nm) を照射した(セロ ハンテープ で密閉しても切断活性に変化がないこ とは事前に確かめている)。 全く同じ数本のサンプルを調製し て、

所定のH寺町ごとに素早く吸収スペクトルの測定を行なった。 なお、

可視光照射中の溶液の温度の上昇を避けるために、 エツペンドルフ チューブは、 7i?に氷冷して行なった。

14.オリゴヌクレオチドの化学合成1

1 ^{4 )}

オリゴヌクレオチドの合成はPharmacia社の自動合成装置Ge ne

Assem bler

Plasを用いて区14-2に示したホスホロアミダイト泣ミで行-なった。 この装ti1の送泌システムを図6-3に示す。

この合成装世での反応収率に広も影響を与えるのはアミダイト試 必、 テトラゾーjレ、 それに浴似のアセトニトリルの乾燥度である。

-194-司可

アセトニトリルは和光純楽工業のモレキュラーシーブス3A ^1/16で1 晩、 続い てメルク社の球状(2mm)モレキュラーシーブスO.3n ^mで

1

[ぬ乾燥させ、 カールフイ ツシャ一法(三菱化成工業 ^{微量水分測定} 装置 CA-OS)で水分定止を行ない、 10 ppm以下(検出下限に近い)

になっていることをf位認して用いている。

アミダイト試薬

「11111

川 l IA 山

一 寸

11111 げ l A間v

/\Jレフ4

DCE AcCN 般化押J Cap.A Cap. B 脱トリチjレイヒ押l

廃液

[�16・3 DNA自動合成袋世の送法システム 4つのバルブを適宜切り替える(コンピュ ータ制御)ことによって反応カラムヰlでオ1)ゴヌクレオチドが由利1合成される. A，C，G，

T:アミダイト試楽; X， Y:カスタム合成アミダイト試薬; Tz:テトラゾー)1/; DCE:ジクロロエ タン; 脱トリチjレイヒ斉11:3% ジク口口酢酸/ジクロロエタン; AcCN:アセトニトリjレ;

酸化

斉IJ:0.01 Mヨウ素/コリジン/オく/アセトニトリル; Cap.A:69'o ジメチルアミノピリジン/アセト

ニトリル; Cap.B: 209'0 1Hりk面ド出Uコリジン/アセトニトリル

さらに、 合成の際にはバルブi及びバルブ2のアセトニトリル は アルゴンガス雰囲気下で、 'j;:-にある程度の圧力をかけ水分を遮断し ている 。 4つのバルブをi自立切り替えて、 適当なタイミングでそれ

ぞれの 試薬を反応カラムに送り込み、 カラム中の固相担体上でオリ ゴヌクレオチド合成を行なった。 なお、 T12-A、 C6T6、 C6

T6・A、

の合成において、 アミノリンカーアミダイトとテメチル シトシンの

アミダイ ト試薬はそれぞれX、 Yに導入して行なった。 各段階の合 成収率は脱保護の操作で切り放されたトリチルカチオンの吸収をモ ニ ター す る こ とで 概 算し た。 各段階96---97%の収率 で反 応、が進行し ていることカfわかった。

合成終了後、 アンモニア処理により担体からオリゴヌクレオチド を切り出し、 逆相の カラムを用いたHPLCでl 次精製を行なった。

合成の際には各段階で未反応のS'末端 は無水酢酸でキャ ッピングし ているため、 l次精製の際に反応、混合物中で末端にトリチノレ基を有 してい るの は理論上ほとんど全て目的物である。 従って、 トリチル 基の疎水性のため最も溶出の遅いピークが目的オリゴヌクレオチド である(トリエチル アミンー酢酸緩衝液/アセトニトリ ル のリニア一

グラジエント)

l次精製後の溶液の酢酸処理により末端トリチル基の脱保護を行 なった後、 ïljび同校にHPLCにより2次精製を行なった。

15.変性ポリアクリルアミドゲjレによる合成オリゴヌクレオチドの 精製

通常のほとんどのオリゴヌクレオチドは上記の手法により充分に 精製できるが、 本論文中で用いているH P 1やH P2の ようなヘアピン

-196-構造を取り得る配列や、 自己相手!lJ 的配列を有するオ 1)ゴヌクレ オチ ドは安定な2次椛迭をとるために逆オ[jのHPLCでの精製はできない ( 2次構造の形成により刻水的な骨格を表面に露出するために溶出 が非常に早くなり他の百Ij生成物と分離できない)。

そこで190/0変性ポリアクリjレアミドゲルを用いたゲル電気泳動に より目的オリゴヌクレオチドを料製した11

4

)。 具体的な操作を以下 に示す。

1

.回相担体から切り出し、 5'末端を脱保護(末端トリチル基) 2.変性斉iJを含むローディング緩街液*1と混合し900Cで5分間温浴

3.ゲルにローデイングして1000--1500Vで泳動

4

.トランスイルミネ-ターでオ1)ゴヌクレオチドのバンドを直接観 察し* 2、 最もi;k W)Jの巡いバンドの部分のゲルを切り取る

5

.-sJJり取ったゲルをスピッ ツ包;に入れ、 ゲルが完全に浸る程度に溶 出緩衝液* 3を加え、 ガラス棒を月Jいてゲルをできるだけ細かく粉

砕する

6 .3 7

oCで12時間投手f

7

.1500rpmで5分間遠心してゲルを分離

8 上澄みをN A P

™ -

1 0カラム(Pharmacia Sephadex G-25)を通 して3回脱塩

9.遠心減給して純水に溶かして貯蔵

* 1ローデイング緩衝液...

98%ホルムアミド、 0.025%キシレンシアノール、 プ

ロモフェノーjレブjレ一 、 10mMEDTA

勺オリゴヌクレオチドの存在量が通常の電気泳動と比べて非常に多いので染 色せずにバンドが観察できる

牢3裕tB緩衝液...0.1%505、 O.5MM:酸アンモニウム、

10mM�作酸マグネシウム

得られた オ1)ゴヌ クレオチドの定量は、 2次約iiliを依壊するために 900Cで加熱技押しながら160n mの吸光度を測定して行なった。

-19⁷

-

唱..-16.オリゴヌクレオチドのハイブリダイセ.ーション

2本鎖のハイブリダイセ-ション

WY-WRのハイプリダイゼーシ ョ ンを花実にするために下に示す

ような出臥波位、 出オリゴヌクレオチド波度(実際に測定に用いる 政伎の100化)条件下でハイブリダイズさせた。

WY、 WR:それぞれ50μM NaCl: 0.5 M

Tris-HCl (pH 7.4 ) ^{1 mM}

川いるオ1)ゴヌクレオチドの長さにもよるが、 ハイブリダイゼーシ ヨ ンのj主j立はTmよりも15

^{-- 20}

oc低いところで最大となる。

T m

= 81 .5 + 16.6 (loglo[NイJ) + 0.41 (%G+C) - (600/ N)

(24)

上式より11

⁹

)この条件([Na+J= 0 . 5、 % G + C=33" N=2 4)でのTmは 650C程度と考えられる のでこの溶液を5 00Cで3時間インキュベート、

その後室jjJLに数時間f次世してハイブリダイズさせた。

H P

1については分子内のハイブリダイゼーシ ョ ンであるので、 容

易に進行すると考えられるが、 ヘアピン構造の形成を確実なものに するた めに 、 WY-WRと同じ組成の溶液でインキユベート温度を6 0

℃とし 、 同様にハイブリダイゼーシ ョ ンの操作を施した。

3*鎖のハイブ1)ダイセーション

水溶液中で安定に3本21を形成させるためには、 電荷問の反発を 抑えるためにマグネシウムイオンなどの2 {tffi金属や、 スペルミンな どのポリカチオンを共存させる必要がある 。 そこで先に調製した2

-鎖のスト ック溶液を用いて下記の条件でo oC、

3時間インキュベー

-19…

卜してそのまま測定にハ!いた。

ドキュメント内 新規な機能をもつ核酸結合性小分子の研究 (ページ 52-58)