AA 処理と ALDH3A1 阻害剤の併用処理における細胞死評価

AA 処 理 は 、Peroxisome Proliferator-Activated Receptor γ (PPARγ)の 活 性 化 を 介 し て

ALDH3A1の発現を抑制することが報告されている²⁴。しかしながら、A549株に10または

50 µMのAAを48時間処理しても、ALDH3A1発現量に差は見られなかった (Fig. 9A)。そ

こで、AAとALDH3A1がフェロトーシス誘導に関与するか否か調べた。10 µMのAA処理

はCB7の細胞毒性を亢進し (Fig. 9B)、その毒性はLip-1で抑制された (Fig. 9C)。従って、

ALDH3A1はGPX4とともに酸化脂質を消去し、フェロトーシス感受性に寄与する可能性が

示された。

0.0001 0.01 1 100

0 25 50 75 100 125

[CB7], μM

Cell viability, %

Control ALDH3A1 AA

GAPDH

Control 10 μMAA 50 μMAA

A B

Control AA + CB7 AA + CB7 + Lip-1

0 25 50 75 100 125

Cell viability, %

✱✱✱✱

C

Figure 9. (A) Expression levels of ALDH3A1 was analyzed by Western blot analysis when treated with 10 or 50 µM of AA to A549 cells for 48 hr. (B) Dose response curves of A549 cells to CB7 when continuously exposed to drugs with or without 50 µM AA for 24 hr. (C) Effects of 2 µM Lip-1 on the toxicity of 50 µM CB7 with 50 µM AA in A549 cells for 24 hr (t-test). AA was treated 24 hr before various inhibitor stimuli. Each value is the mean ±SD of triplicate dishes or wells. ****p<0.0001 compared with control. “ns” means not significant.

117

3-4. 考察

今回、LPO制御に基づいて、FINs感受性差に相関する因子を探索した。結果として、既 報のフェロトーシス関連因子は細胞死誘導に必須である一方、感受性差とは関連しないこ とが示された (Fig. 2-5)。そこで、FINs感受性差と発現量解析、およびデータベース解析か ら、酸化脂質の消去酵素である ALDH3A1 に着目し、細胞死への関与を調べた (Fig. 6 and 7)。その結果、ALDH3A1阻害剤CB7は、フェロトーシス耐性細胞株であるA549株のFINs 感受性を亢進させた (Fig. 8B)。さらに、AAを処理するとその効果は増強された (Fig. 8D)。 加えて、CB7とAA処理だけでもフェロトーシスが誘導されることから (Fig. 9)、ALDH3A1 はGPX4とともにフェロトーシス保護的に働くことが示唆された。

データベース解析から、ALDH の中でも ALDH3A1 は、フェロトーシス耐性に良好な相 関を示した (Fig. 6)。脂質由来アルデヒドに代謝活性を有するALDHには、1A1や1B1、 2、 3A1、3A2、3B1、3B2、7A1の8つが報告されている (Table. 1)。ALDH1A1および1B1、2 は、MDAや4-HNE、Acetaldehyde (C2)などの極短鎖のアルデヒドを基質とする^8,25–27。また、

ALDH7A1 は極短鎖よりも炭素鎖が長いHexanal (C6)やOctanal (C8)などのアルデヒドに活

性を有している²⁸。一方、ALDH3はさらに長い炭素鎖のアルデヒドに高い活性を有してお り、3A1はNonanal (C9)やDodecanal (C12)、3A2や3B1、3B2はHexadecanal (C16)を代謝す ることができる^21,29–31。以上の知見と、ALDH3A1のフェロトーシス保護的な働きから、フ ェロトーシス誘導には脂溶性の高い脂質由来長鎖アルデヒドが関与している可能性が考え られる。

118

一方、第2章で、ALDH3A1発現量の低いCalu-1株のRSL-3処理では、 1-palmitoyl-2-(5-oxovaleroyl)-sn-glycero-3-phosphocholine (POVPC) や

1-stearoyl-2-oxovaleroyl-sn-glycero-3-phosphorylethanol-amin (SOVPE)などの脂質アルデヒドが有意に生成し、逆にA549株では脂

質アルデヒドは増加しなかった (第2章 Fig. 8C)。このことは、脂質アルデヒドがフェロト ーシス誘導に関与する可能性を示唆している。これまで、フェロトーシス誘導におけるアル デヒドの関与についての報告はほとんどなく、HepG2 細胞で短鎖アルデヒド MDA 量の増 加が報告されているのみである¹⁷。一方、アポトーシスでは、MDAやHNEなどの短鎖アル デヒドがタンパク質の修飾やDNA障害などに関与すること³²、またリン脂質由来アルデヒ

ドの POVPC が血管平滑筋細胞の増殖を抑制することなどから、脂質由来アルデヒドとの

関連が報告されている³²。しかしながら、リン脂質アルデヒドは非常に不安定かつ、その存 在量が微量であることから、現状の測定手法では、どのようなリン脂質由来アルデヒドがフ ェロトーシスやアポトーシスを誘導するか評価が難しい。今後、リン脂質アルデヒドを標的 とした高感度な検出系の構築が期待される。

がん細胞株はその生存を ALDH 依存性にしており、Pan-ALDH と Bcl-2 阻害活性を持つ

Gossypolは、NSCLC細胞株のATP生産を抑制し、細胞死を誘導する³³。また、NSCLC患

者由来の初代培養がん細胞においてALDH 活性の高い細胞は、足場非依存的な増殖能が亢 進している³⁴。これらの報告から、ALDHはNSCLC腫瘍の生存を支える重要な役割を持つ ことが示唆されている。

一方、ALDH3A1をsiRNAで3~5日間発現抑制すると、A549株の細胞増殖能は顕著に抑

制されたが、Lip-1添加では回復しなかった (data not shown)。このことから、ALDH3A1は A549株においていくつかの役割を持つことが想定される。事実、マウス線維芽細胞ではあ るが、p53に変異を導入しアポトーシス誘導経路を阻害すると、フェロトーシスが生じるこ とが報告されている³⁵。つまり、複数の細胞死が協調的に働いており、ALDH3A1を単独で 阻害しても、アポトーシスが優先されフェロトーシスが誘導されなかった可能性がある。

119

以上のことから本研究では ALDH3A1 が脂質アルデヒドの消去を介して、フェロトーシ スを抑制する可能性を示した。また、A549株では他のNSCLC細胞株と比較してALDH3A1 発現が非常に高ことからも、その発現量の差はFINsの感受性差を説明できる可能性がある

(Fig. 11)。今後、LPOが惹起された後どのようにしてフェロトーシスが誘導されるか、酸化

脂質の消去機序について明らかにしなければならない。ALDH とフェロトーシスとの直接 的な関連を明らかにした本研究が、LPO 由来アルデヒド種の新たな役割を見出す一助にな ることを期待したい。

Lipid derivative aldehyde and

Oxidized PCs and PEs

Carboxylic acid

Survival (Resistance) Ferroptosis

LPO ALDH3A1

Figure 10. Removal of highly oxidized and toxic lipids via ALDH3A1 protects from ferroptosis in NSCLC cell lines.

120

3-5. 参考文献

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123

第 2 部 第 4 章

総括

124

近年のがん治療戦略は、宿主と腫瘍の区別なく障害を与える殺細胞性の抗がん剤を用い た治療から、がん細胞に特徴的な分子を阻害する標的型の治療へと変容している。標的型は がん細胞に特異的である反面、生存に寄与する因子を適切に阻害することが必要であり、奏 功率に直結する。このことから、それぞれの患者に適切な治療の実現には、対象となるがん 細胞の耐性がどのような因子に依存しているかを精査し、分子標的薬が効果を示すための 分子メカニズムを明確化する必要がある。

第1部では、分子標的薬の薬剤耐性機序と臨床的な意義について議論した。がんの治療に おいては、再発腫瘍で新たに生じた遺伝子の変容が予後を大きく左右する。例えば、最新の

EGFR-TKIであるオシメルチニブに耐性を示した腫瘍に対し、現状で有効な治療法は確立さ

れていない。本研究では、樹立したオシメルチニブ耐性株を用いた阻害剤および発現抑制の 検討から、獲得耐性メカニズムとして CDCP1-AXL/SRC/Akt 代替経路の活性化を明らかに した。耐性株で見られたCDCP1やAXLの発現亢進は、EGFR-TKI治療再発患者の腫瘍サン プルでも観察された。従って、がん細胞は薬剤に対して耐性を誘導し、その機序の解明はが ん治療に大きく貢献できる。

一方、近年新たな細胞死機序としてフェロトーシスが提唱され、がん治療の応用に向けた 研究が盛んに行われている。フェロトーシスは、KRAS変異陽性細胞に対する薬剤スクリー ニングから発見され、がん細胞特異的に細胞死を誘導できる可能性が示された。これまで、

フェロトーシス誘導に関わる因子として、発現抑制スクリーニング手法から ACSL-4 や

LPCAT3などの酵素が見出されてきた。しかし、この手法ではフェロトーシス抑制因子はヒ

ットしないため、フェロトーシス耐性機序についてはほとんどわかっていなかった。

また、細胞株ごとにフェロトーシス誘導剤に対する顕著な“感受性差”が存在し、その機序 を説明する因子の探索も進められている。しかし、これまでに検討されてきた感受性因子の 中で優れた相関性を示したのはEMT Scoreのみであった。一方、このEMT Scoreは、肺癌 細胞に対してフェロトーシス感受性とは相関しないことがわかっている。

125

そこで、第2部では、非小細胞肺癌細胞を用いてFINs感受性差を説明可能な因子の探索 を目的とし、第2章でリゾリン脂質アシル転移酵素 (LPLATs)の、第3章でアルデヒドデヒ ドロゲナーゼ (ALDHs)の関与を調べた。

第 2 部第2 章では、リン脂質組成調節がフェロトーシス感受性に重要であることがわか り、脂肪酸のリン脂質導入酵素であるLPLATsに着目した。結果として、OA処理によるリ ン脂質のPUFA割合の減少が、フェロトーシス感受性差の原因である可能性が示唆された。

そして、フェロトーシス感受性差とLPLATs発現量の相関解析から、特にOAのリン脂質導 入酵素である AGPAT5 と LCLAT1 が、FINs 耐性因子である可能性を見出した。さらに、

AGPAT5の発現抑制は、FINs耐性細胞株であるA549株のフェロトーシス感受性を亢進させ

た。以上のことから、本章では、AGPAT5によるリン脂質組成変動がフェロトーシス耐性誘 導に関与する可能性を見出した。

次に、第2部第3章では、フェロトーシス誘導に関わる酸化脂質の消去酵素として、ALDH に着目した。ALDHには19種のファミリーが存在し、フェロトーシス感受性差との相関解

析から、ALDH3A1が最も強い相関を示した。さらに、ALDH3A1阻害剤とAAを用いた検

討から、ALDH3A1 がフェロトーシス耐性に重要な役割を持つことを示した。本章は、

ALDH3A1とフェロトーシスとの関連を示した初めての報告である。

以上の研究成果から、第2部では、AGPAT5を介したリン脂質の組成調節とALDH3A1 による脂質由来アルデヒドの消去が、細胞株の潜在的なフェロトーシス耐性を形成してい る可能性を示した (Fig. 1)。