第 2 章 リゾリン脂質アシル転移酵素を介したリン脂質組成調節とフェロトーシス感受性
1. フェロトーシス関連因子のフェロトーシス感受性差への影響評価
始めに、鉄関連因子のフェロトーシス感受性差への影響を調べた。鉄キレート剤は、
RSL-3処理時のCalu-1株、あるいはAAとRSL-3処理時のA549株に対する細胞毒性を抑制した
(Fig. 2A)。細胞内の鉄イオン量をフェロジン法にて測定したところ、タンパク量に対する鉄
イオンの割合は細胞株間で異なり (Fig. 2B)、鉄イオン量はRSL-3感受性と相関する傾向が 見られた。そこで、A549株をFAC処理し、鉄イオン量の差がフェロトーシス感受性差に関 連するか否か調べた。Ferric Ammonium Citrate (FAC)は、トランスポーターである Divalent
metal transporter 1 (DMT1)を介して細胞内に鉄イオンを蓄積させ13、フェロトーシスを誘導
する14。そこで、A549あるいはCalu-1株をFAC処理すると、両株の鉄イオン量は増加した
(Fig. 2C)。しかし、A549とCalu-1株に対するFACの感受性差はRSL-3処理時と同程度であ
り (Fig. 2D)、また、A549株のRSL-3毒性に対するFAC処理の影響はなかった (Fig. 2E)。 そこで、脂肪酸処理が、鉄イオンの過量投与による細胞毒性に影響を与えるか否か調べた。
Calu-1株へのOA処理はFACによる毒性を軽減し、A549株へのAA処理は感受性を亢進さ
せた (Fig. 2F)。以上の結果から、鉄イオンはフェロトーシス誘導に関与する一方、FINsに
対する細胞株間の感受性差には影響しないことが示唆された。
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Control Control DFO
0 25 50 75 100 125
A549
RSL-3 + AA
†
#
Control Control DFO
0 25 50 75 100 125
Calu-1
Cell viability, %
RSL-3
†
#
A549 Calu-1 H2030 H358
0 1 2 3 4 5
Total Fe
nMol / mg protein
Calu-1 A549 0
50 100 150 200
Total Fe
Ratio of control, %
Control FAC
✱✱✱ ✱✱✱
0.01 0.1 1 10 100 0
25 50 75 100 125
[FAC], mM
Cell viability, %
A549 Calu-1
0.001 0.01 0.1 1 10 0
25 50 75 100 125
A549
mM, [FAC]
Cell viability, %
Control AA
0.01 0.1 1 10 100 0
25 50 75 100 125
Calu-1
mM, [FAC]
Cell viability, %
Control OA
0.01 0.1 1 10 100 0
25 50 75 100 125
A549
μM, [RSL-3]
Cell viability, %
Control FAC
A B C
D E
F
Figure 2. (A) DFO shows protective effects from the toxicity of 0.1 µM RSL-3 on Calu-1 cells or 2 µM RSL-3 with 10 µM AA on A549 cells (t-test). (B) Measurement of total Fe ion in A549, Calu-1, H2030 and H358 cells. (C) 5 mM FAC treatment for 24 hr increases intracellular total Fe ion content (t-test). (D) Dose response curve of A549 or Calu-1 cells to FAC when continuously exposed to drug for 24 hr. (E) Dose response curve of A549 cells to RSL-3 with/without 1 mM FAC when continuously exposed to drug for 24 hr. (F) Effects of 250 µM OA on the toxicity of FAC in Calu-1 cells, and 10 µM AA on the toxicity of FAC in A549 cells. Each value is the mean ± SD of triplicate wells or dishes.
†p<0.0001 and ***p<0.001 compared with Control. #p<0.0001 compared with treatment of RSL-3 with or without AA.
106
続いて、KRAS活性型変異陽性のNSCLC細胞株4株におけるリポキシゲナーゼの発現量 を、ウエスタンブロッティングで評価した。しかし、12と15-リポキシゲナーゼの発現量に 細胞株間で顕著な差はなかった (Fig. 3)。
次に、GPX4がフェロトーシス感受性差に影響するか調べるため、siRNA を用いてA549 とCalu-1株のGPX4発現を抑制した (Fig. 4A)。Calu-1株ではsiRNA処理3日目から細胞数 が減少した一方、A549株では siGPX4 を処理してもsiC群と同程度の細胞増殖能であった
(Fig, 4B)。また、このときAA処理を加えると、A549株の細胞数は減少し、これはLip-1処
理により抑制された (Fig. 4C)。続いて、データベースを用いて非小細胞肺癌9株における、
GPX4のmRNA発現量とRSL-3感受性との相関を2章と同様の方法で解析した。しかし、
両因子は良好な相関を示さなかった (Fig. 4D)。
5-LOX 12-LOX 15-LOX GAPDH
Calu-1
A549 H2030 H358
Figure 3. Western blot analysis of lipoxigenase family proteins in cell lysates of A549, Calu-1, H2030 and H358.
107 siC #1 #5
0.00 0.05 0.10 0.15
Calu-1
Relative expression
siGPX4
† †
siC #1 #5
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08
A549
siGPX4
† †
siC #1 #5
0
Calu-1
Cell counts, x104
8.0 6.0 4.0 2.0
siGPX4
✱✱✱✱
✱✱✱✱ ✱✱✱✱ ✱✱✱✱
✱
ns
siC #1 #5
0
A549
1 day 3 day 5 day
2.0 4.0 6.0 8.0
siGPX4
ns
Ctrl + AA DMSO + AA + AA / Lip-1
0
A549
Cell counts, x104
siC siGPX4
15
10
5.0 ✱✱✱✱
A
B
C
-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3
4 5 6 7 8 9
Log(LC50 [RSL-3]), M GPX4 mRNA expression r = -0.35
p = 0.351
D
Figure 4. (A) The expression levels of GPX4 mRNA against β-actin in A549 or Calu-1 cells. siRNAs were treated for 3 days (t-test). (B) Effects of GPX4 knockdown on cell growth of A549 or Calu-1 cells (tukey’s multiple comparisons test). (C) Effects of GPX4 knockdown on cell growth when cells were treated with/without 10 µM AA and 2 µM Lip-1 (sidak’s multiple test). (D) Correlation analysis between GPX4 mRNA expression level (RNAseq) and IC50 log value of RSL-3 in 9 NSCLC cell lines.
Each value is the mean ± SD of triplicate wells or dishes. †p<0.0001, ****p<0.0001, *p<0.05 compared with siC. “ns” indicates “not significant”.
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さらに、GSH枯渇に対する影響を評価した。Calu-1およびA549株にErastinまたはBSO を処理すると、A549およびCalu-1株のGSH量は同様に減少していたが (Fig. 5A)、A549株 はGSH枯渇剤に対しても顕著な耐性を示した (Fig. 5B)。
以上の結果から、鉄イオンとGSH量ならびにGPX4とリポキシゲナーゼ発現量はフェ ロトーシス誘導に必須であるが、それらの存在量または発現とフェロトーシス感受性差は 独立していることが示唆された。
0.01 1 100
0 20 40 60 80 100
BSO
[BSO], mM
A549 Calu-1 A549 Calu-1
0 25 50 75 100 125
Total GSH (% of control)
Control BSO Erastin
† †
†
†
A
B
0.001 0.01 0.1 1 10 0
20 40 60 80 100 120
Erastin
[Erastin], μM
Cell viability, %
Figure 5. (A) Measurement of the amount of GSH. 1 mM BSO or Erastin (10 µM for A549 or 1 µM for Calu-1 cells) was exposed cells for 24 hr (t-test). (B) Dose response curves of A549 and Calu-1 cells to Erastin or BSO when continuously exposed to drugs for 72 hr. Each value is the mean ±SD of triplicate wells or dishes. †p<0.0001 compared with siC.
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