第 2 章 リゾリン脂質アシル転移酵素を介したリン脂質組成調節とフェロトーシス感受性
11. 補助資料
0.001 0.01 0.1 1 10 0
20 40 60 80 100 120
[Erastin], μM
Cell viability, %
0.001 0.01 0.1 1 10 0
20 40 60 80 100 120
[Erastin], μM
Cell viability, %
A
0.0001 0.01 1 100
0 20 40 60 80 100 120
[FIN56], μM
Cell viability, %
Control 10 μM AA
B
0.0001 0.01 1 100
0 20 40 60 80 100 120
[FIN56], μM
Cell viability, %
Control 10 μM OA
A549
Calu-1
Figure S1. Dose response curves of A549 cells with AA (A) and Calu-1 cells with OA (B) to Erastin or FIN56 when continuously exposed to drugs for 48 hr. Fatty acids were treated 24 hr before various drugs stimuli. Each value is the mean ±SD of triplicate wells.
89
A
B
Ctrl 10 30 100 300 500
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
PC(36:2-18:1/18:1)
Ratio
OA, μM
† †
†
† †
Ctrl 10 30 100 300 500
0.000 0.005 0.010 0.015 0.020
PC(36:4-16:0/20:4)
Ratio
OA, μM
†
†
†
† †
Ctrl 10 30 100 300 500
0.000 0.005 0.010 0.015
PE(36:4-16:0/20:4)
Ratio
OA, μM
† †
†
† †
Ctrl 10 30 100 300 500
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
PE(38:4-18:0/20:4)
OA, μM
†
† †
† †
Ctrl 10 30 100 300 500
0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025
PE(38:5-18:1/20:4)
OA, μM
† †
Ctrl 10 30 100 300 500
0.0000 0.0005 0.0010 0.0015
PE(40:4-20:0/20:4)
OA, μM
† †
†
† †
Ctrl 10 30 100 300 500
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
PE(36:2-18:1/18:1)
Ratio
OA, μM
† † † † †
Ctrl 10 30 100 300 500
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08
PE(36:3-18:1/18:2)
OA, μM
†
† †
Ctrl 10 30 100 300 500
0.000 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005
PE(36:4-18:1/18:3)
OA, μM
†
†
Ctrl 10 30 100 300 500
0.00 0.02 0.04 0.06
PC(36:3-18:1/18:2)
OA, μM
†
† †
Ctrl 10 30 100 300 500
0.000 0.002 0.004 0.006
PC(36:4-18:1/18:3)
OA, μM
†
Ctrl 10 30 100 300 500
0.000 0.005 0.010 0.015 0.020
PC(38:4-18:0/20:4)
OA, μM
†
†
†
† †
Ctrl 10 30 100 300 500
0.000 0.005 0.010 0.015
PC(38:5-18:1/20:4)
OA, μM
†
† †
Figure S2. Measurement of AA (A) or OA (B) -containing phospholipid content ratio dependent on OA treatment concentration in PC or PE. Calu-1 cells were treated with each concentration of OA for 24 hr. Each value is the mean ± SD of triplicate dishes. †p<0.0001 compared with ctrl (sidak’s multiple test).
90
2-5. 考察
本研究では、脂肪酸添加実験よりKRAS変異陽性のNSCLC細胞株においても、リン脂質 組成がフェロトーシス感受性に影響を与えるか否か検討した (Fig. 3-8)。そして、FINsへの 感受性差とLPLATs発現量との相関解析からAGPAT5とLCLAT1を見出した (Table. 3)。こ
れらのLPLATs はOAを基質とし、フェロトーシス耐性誘導に寄与すことがわかった (Fig.
15)。中でもAGPAT5の発現抑制は、FINs耐性を示すA549株の感受性を亢進した (Fig. 16)。 以上より、AGPAT5はフェロトーシス耐性に寄与する因子であり、その発現量はFINs感受 性を説明できる可能性が示された。
NSCLC細胞株において、AAまたはOA処理はFINs感受性を変動させた (Fig. 4)。これ
まで、NSCLC細胞株の中でもA549株とCalu-1株との間に顕著なRSL-3感受性差が報告さ
れていたものの、その要因については明らかにされていなかった24。今回、LC/MS/MSを用 いた検討から、この感受性差はリン脂質組成に依存する可能性を見出した (Fig. 5-8)。
フェロトーシス誘導には、AA-PE の酸化体である PE (18:0/15-HpETE)が細胞死シグナル として重要であることが示唆されている。この15-HpETEはAAの15位にヒドロペルオキ シドを有した構造を持ち、細胞膜上の15-リポキシゲナーゼ / PE-Binding Protein 1 (PEBP1) 複合体により生成される28。さらに、15-HpETEの生成に伴い、PEの側鎖にAAとAdrenic
Acid (AdA, 22:4)を含む酸化脂質も検出されている5。しかし本研究では、PEのみならずPC
の側鎖にAAを含む酸化脂質量が、脂肪酸処理より変動していた (Fig. 8)
先行研究でOA処理は、ヒト肉腫細胞HT-1080株のフェロトーシス耐性を誘導し、Bodipy の蛍光強度は抑制しないことが報告されている 6。しかしながら今回の検討で OA 処理は、
RSL-3を処理した際のBodipy蛍光強度を抑制するだけでなく (Fig. 7)、PEおよびPCの酸
化脂質量を減少させた (Fig. 8)。HT1080株とNSCLC株におけるOA処理を比較した場合、
Bodipy 蛍光強度への影響は異なった。この理由は現時点では不明であるが、今後 HT-1080
91
株をNSCLC株と同様の条件で比較することにより、細胞株間による違いかどうか明らかに
する予定である。
OA のリン脂質への導入酵素であるAGPAT5 と LCLAT1の発現量は、肺癌細胞株の感受 性差と相関した (Table 3 and Fig. 13)。一方で、フェロトーシス誘導への関与が報告されてい
るLPCAT3は、NSCLC細胞株でもAA添加した際のFINs感受性亢進に寄与していたが (Fig.
14)、NSCLC細胞株間のFINs感受性差とは相関しなかった (Table. 3)。このLPCAT3の基質 はLPCとLPEである29。一方、AGPAT5はOA-CoAをLPAとLPE、LPCへ導入し8、LCLAT1
はLPA23へのOA-CoA導入活性を有する。AGPAT5とLPCAT3 では基質となるリゾリン脂
質の中でもLPCとLPEが重複しており、これらは競合的にリン脂質組成を調節している可 能性が考えられる。
Calu-1株のOA処理によるRSL-3耐性誘導は、AGPAT5またはLCLAT1の発現抑制によ
り阻害された (Fig. 15)。一方で、A549株のRSL-3感受性は、AGPAT5の発現抑制でのみ亢 進した。従って、NSCLC細胞株においては細胞株間で違いがあるものの、AGPAT5 が共通 してフェロトーシス耐性に寄与する可能性が示唆された。
以上のことから、① LPCAT3はフェロトーシス誘導に必須の因子であるが、感受性差には 影響しないこと、② AGPAT5 などによる競合的なリン脂質組成の調節がフェロトーシス感 受性差には重要である可能性が示された。
92
FINs耐性株であるA549株のAGPAT5発現を抑制すると、リン脂質組成の変動を伴う RSL-3感受性が亢進した (Fig. 16)。AGPAT5の発現抑制によりどのようなPUFA含有リン脂質が 変動しているか、Vocano Plotにて解析した。興味深いことに、AGPAT5の発現抑制はAAだ けでなくDHAを含む分子種の量比を有意に増加させた (Fig. S3A and B)。特にPCではPE よりも量比が増加した分子種の種類が多く、9種類の分子種が該当した。その中でも5種類 はAAまたはDHAを含む分子種であった。一方で、AA以外のPUFAを処理した場合でも、
RSL-3感受性が亢進する結果が得られている (Fig. 10)。以上より、FINsへの感受性に対し
ては、AA以外のPUFAも寄与する可能性も考えられる。
-0.04 -0.02 0.00 0.02 0.04 0
1 2 3 4 5
PEs
Difference
-log(Adjusted P Value)
PE(32:0-16:0/16:0)
PE(32:1-16:0/16:1) PE(34:1-16:1/18:0)
PE(34:2-16:1/18:1) PE(36:2-18:1/18:1)
PE(38:4-18:0/20:4) PE(38:6-16:0/22:6) PE(38:6-18:2/20:4)
PE(40:6-18:0/22:6)
-0.006 -0.003 0.000 0.003 0.006 0
1 2 3
PCs
Difference
-log(Adjusted P Value)
PC(28:0-14:0/14:0) PC(30:0-14:0/16:0)
PC(32:1-14:0/18:1) PC(36:0-18:0/18:0)
PC(36:4-16:0/20:4)
PC(38:4-18:0/20:4) PC(38:6-16:0/22:6) PC(40:6-18:0/22:6)
PC(40:7-18:1/22:6)
A B
siControl v.s siAGPAT5
Increment Reduction
Figure S3. LCMS-based volcano plot of all PE (A) or PC (B) molecular species. Difference indicates the subtraction comparing siC and siAGPAT5. The threshold of significance was set at a statistical significance p < 0.05. All experiments were performed biologically triplicate.
93
また、A549株へAGPAT5発現抑制した際には、リン脂質の総OA割合は変化しなかった
(Fig. 16D)。そこで、リン脂質分子種に着目したところ、OAを含むリン脂質の中でも量比が
上昇するものと減少するものがあった (data not shown)。このことからAGPAT5は、リゾリ ン脂質の親水性頭部だけでなく、側鎖の脂肪酸も含めた基質選択性を有していることが示 唆された。
A549株のAGPAT5発現抑制で量比が増加する分子種について、どのような機序が関与す
るかについては議論の余地が残されている。DHA導入に関与するAGPAT3の欠損マウスで は、DHA含有リン脂質の代わりにAA含有リン脂質が増加する11。従って、LPLATsを抑制 した際、代わりに導入されるリン脂質には規則性が存在する可能性がある。今後、この規則 性について個々のLPLATsがどのように協調してリン脂質組成を調節するのか、1つ1つ明 らかにする必要がある。
フェロトーシス誘導に関与するLPOの基質として、どのリン脂質分子種が直接関与する かについては、今後更なる検討が必要とされる。本研究ではPCとPEに着目して検討した。
しかし、OAやAAを含有したリン脂質総量に着目すると、脂肪酸処理 (Fig. 5 and 6)や酸化 脂質の生成 (Fig. 8)、LPLATsの発現抑制 (Fig. 15 and 16)のどの条件においても、PCとPE は同様に変動した。一方、これまでの報告から、PE-AA のフェロトーシスへの関与が報告 されているが、本検討では他のPUFAも同様に働く可能性を示した (Fig. 10)。以上のことか ら、フェロトーシス誘導にはPE-AA-O-OH 以外の酸化脂質も関与している可能性がある。
今後、酸化脂質検出技術の向上や複数のLPLATsによるリン脂質組成制御機序の解明が、フ ェロトーシスに関与する新たなリン脂質分子種の発見に貢献することを期待したい。
94
2-6. 小括
今回我々は、KRAS活性型変異陽性のNSCLC細胞株を用いたAA処理とLPCAT3の発現 抑制実験から、LPCAT3を介したAA含有リン脂質量比の上昇がLPOの惹起と酸化脂質の 蓄積に関連することを示した。また、OA処理とAGPAT5もしくはLCLAT1の発現抑制実験 から、特にAGPAT5がリン脂質へのOA導入とPUFA含有リン脂質量比の減少に関与し、
それに伴う酸化脂質生成量の低下とフェロトーシス耐性を誘導する可能性を示した。さら
に、NSCLC細胞株におけるAGPAT5発現量とフェロトーシス感受性差は相関した。以上よ
り、本研究では、AGPAT5がFINs耐性に関与するだけでなく、FINsの感受性差を説明でき る可能性を初めて報告した (Fig. 17)。
フェロトーシスは近年提唱された新たな細胞死様式であり、疾患への関与や新たな生化 学的役割の解明について活発に研究が進められている。今回明らかにした AGPAT5 による 感受性調節は、NSCLCのFINs耐性を打ち消せる可能性がある。逆に、フェロトーシスが原 因となる虚血性疾患や神経変性疾患に対して、AGPAT5などのLPLATを活性化させること で病態の悪化を抑制できる可能性がある。本研究を基に、リン脂質組成調節による新たな創 薬研究が発展することを期待している。
95 AA
OA
Ferroptosis
Survival (Resistance) LPO
LPO LPCAT3
AGPAT5
AA-containing PLs
Reduction of oxPLs Acquisition of
resistance to LPO
Accumulation of oxPLs
Figure 17. LPLATs control the susceptibility of FINs via modulating LPO vulnerability.
96
2-7. 参考文献
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98
99
第 2 部 第 3 章
アルデヒドデヒドロゲナーゼ 3A1 と
フェロトーシス感受性
100
3-1. 略語一覧
AA Arachidonic Acid
AGPAT5 1-Acylglycerol-3-Phosphate O-Acyltransferase 5
ALDH Aldehyde Dehydrogenase
BSO Buthionine Sulfoximine
CTRP Cancer Therapeutics Response Portal
DFO Deferoxamine
DMT1 Divalent metal transporter 1
FAC Ferric Ammonium Citrate
FINs Ferroptosis inducers
GPX4 Glutathione Peroxidase 4
GSH Glutathione
HNE Hydroxynonenal
LCLAT1 Lysocardiolipin Acyltransferase 1
Lip-1 Liproxstatin-1
LPO Lipid Peroxidation
MDA Malondialdehyde
NRF2 Nuclear factor erythroid 2-Related Factor 2
POVPC 1-Palmitoyl-2-(5-Oxovaleroyl)-sn-glycero-3-Phosphocholine PPARγ Peroxisome Proliferator-Activated Receptor γ
SSZ Sulfasalazine
SOVPE 1-stearoyl-2-oxovaleroyl-sn-glycero-3 phosphorylethanolamin
TfR Transferrin Receptor
101
xCT SystemXc-
ROS Reactive Oxygen Species
102
3-2. 序論
前章ではLPLATによるリン脂質組成の制御が、フェロトーシス感受性に寄与することを
示 し た 。 し か し な が ら 、1-Acylglycerol-3-Phosphate O-Acyltransferase 5 (AGPAT5)や Lysocardiolipin Acyltransferase 1 (LCLAT1)を阻害した際、リン脂質組成は変動するものの、
RSL-3耐性への影響は部分的であった。従って、NSCLC細胞株間のFerroptosis inducers (FINs) の感受性差を説明するためには、他の因子の影響を考えなければならない。そこで本章では、
フェロトーシス誘導に重要なLPOの制御機構に着目し、関連因子のFINs感受性への影響を 検討した。
フェロトーシス誘導には、LPOの進展および除去因子が関与する。LPO 進展には、リン 脂質のリポキシゲナーゼによる酸化1と、鉄を介した脂質ラジカル伝搬2が必要である。特 に鉄は、がん細胞の生存に必須の因子であり、鉄取り込み受容体であるTransferrin Receptor
(TfR)の中和抗体は腫瘍の成長を阻害する3。非小細胞肺癌や乳癌、腎細胞癌など様々な癌種
で鉄代謝の変動が見られるだけでなく 4、腫瘍の悪性度とも相関する 5。従って、それぞれ のがん細胞で必要とする鉄の量や、代謝関連因子の発現量が異なることが予想される。
一方、LPO消去には、Glutathione Peroxidase 4 (GPX4)やSystem Xc- (xCT)が関与する。GPX4 は、リン脂質のヒドロペルオキシド体に高い還元活性を示し、フェロトーシスの主な制御因 子である6。xCTは抗酸化物質であるGlutathione (GSH)の取り込みを介して、GPX4を始め とする様々な抗酸化タンパク質の基質として働く7。これらの酵素の阻害によりフェロトー シスが誘導されることから、細胞株間における発現量の違いは、フェロトーシス感受性差に 影響を与えることが考えられる。
以上より、フェロトーシスはLPOの進展と消去のバランスが崩壊することで誘導される 細胞死であり、関連因子の存在量はFINs感受性差を説明できる可能性がある (Fig. 1)。