9-1-1.pHスカウティング
固定化したいリガンドの等電点が不明な場合には、各種のpHの10mM酢酸緩衝 液に希釈した同一濃度のリガンド溶液をセンサー表面にインジェクトし、デキ ストランへの濃縮の程度を見ることができる。
リガンド（5～100μg/ml、10mM 酢酸緩衝液、pH4～6） 洗浄溶液（50mM NaOH）
Run → Run Application Wizard…をクリックする。
↓
Surface Preparationを選択し、Start…をクリックする。
↓
Immobilization pH Scoutingを選択し、Next＞をクリックする。
↓
使用するpHの酢酸緩衝液にチェックを入れ、Next＞をクリックする。
濃縮効果が見られるpHはpH5～4の範囲にある場合が多い。また、pH3.5 以下の緩衝液は使用しない。
表示された緩衝液以外を使用する場合には、Add…をクリックして設定する。
↓
リガンド名、インジェクト時間（分）、流速（μl/min）、使用するセルを選択し、
Next＞をクリックする。
↓
pHスカウティング終了後、非特異的に結合したリガンドを洗浄溶液で洗浄する。
2段階（2種類の洗浄溶液）を使用する場合には、Wash MethodのTwo Injections をクリックする。
洗浄溶液名および条件を入力し、Next＞をクリックする。
洗浄溶液は最後のリガンドを添加した後に添加される。それぞれのpHのリ ガンドを添加した際には洗浄操作は行われない。
洗浄溶液は、高イオン強度あるいは高いpHの溶液での洗浄を推奨する（た とえば、3M NaCl,50mM NaOH, 1M Etnaolamine-HCl,pH8.5等）
↓
サンプルの位置を確認あるいは変更し（101 ページ参照）、Next＞をクリックす る。
↓
サンプルの位置、容量を再度確認し、Startをクリックする。
↓
保存先のフォルダーを指定し、ファイル名を入力し、Saveをクリックする。
↓ 実験がスタートする。
（実験結果の表示）
実験が終了すると、以下のような結果が表示される。
さらに以下のようなレポートも表示される。
上記の結果から使用するpHを決める。
（結果の評価）
一般的には、濃縮効果が得られる最も高いpHの条件を用いて固定化する。
濃縮効果および使用しているリガンドの安定性等を考慮して最終的に決定する。
基本的に濃縮効果が得られる条件では固定化が可能である。
9-1-2.Immobilization（固定化操作）
～アミンカップリングによる固定化方法
この方法は、アミンカップリングによりリガンドを固定化する方法である。そ の他の固定化方法（チオールカップリング、アルデヒドカップリング）につい
ては、Wizard Template（172ページ）を参照すること。
Run → Run Application Wizard…をクリックする。
↓
Surface Preparationを選択し、Start…をクリックする。
↓
Immobilizationを選択し、Next＞をクリックする。
↓
センサーチップ（CM5）および固定化方法（Amine Coupling）を選択し、Next＞ をクリックする。
↓
Aim for Immobilized Level（99ページ参照）
目的の固定化量に調節したい場合に使用。
Specify Flow Rate and Injection Time（107ページ参照）
決められた条件（リガンドインジェクト時の流速とインジェクト時間の み設定）で行う場合に選択する。
↓ いずれかを選択し、Next＞をクリックする。
① Aim for Immobilized Level
あらかじめ目的の固定化量を設定して固定化操作を行う場合に使用する Wizard である。
流速は5μl/min、NHS活性化時間、エタノールアミン不活性化時間はそれ
ぞれ7分間に固定化されており変更はできない。
Aim for Immobilized Level選択し、をNext＞をクリックする。
↓
固定化したいリガンド名を固定化するフローセルに入力し、目的の固定化量
（RU）、洗浄溶液を入力し、Next＞をクリックする。
（補足）
① 複数の固定化を同時に行うこともできる。
この場合には、それぞれのフローセルに同様にリガンド名、固定化量を入力する。
②フローセル 1 および 3 をブランクコントロールとして使用することができる。この場合 には、Blankにマーク（√）を入力すると、NHS活性化後、そのままエタノールアミンで ブロッキングしたセルを作製する。
③何も処理していないフローセルをコントロールにしたい場合には、この画面上では処理 を行わない。
④ブランクコントロールのセルは、フローセル1および3にすると、後の実験に便利であ る｡
リガンドや試薬のバイアルのセット位置がラックベース上に表示される。
バイアルのセット位置を変更する場合には、ラック上のバイアルにカーソル を移動し､ドラッグして、好きな場所に移動することができる。その場合には、
上部表中のサンプル位置も自動的に変更される｡サンプル位置の変更にとも ない、バイアルの大きさが変わる場合には、サンプル必要量も変更されるの で注意すること。
（サンプル位置の変更例）
毎回同じ設定で固定化したい場合には、この設定を保存することもできる。
Menu▼ → Template Save As…で保存する。
Next＞をクリックする。
↓
バイアル位置およびサンプル容量に間違いがないことを確認してStartをクリッ クする。
↓
保存先のフォルダーを選択し、ファイル名を入力し、Saveをクリックする。
↓ 固定化操作が開始される。
固定化が終了すると、上記の様なレポートが表示される。
Response 1. リガンド添加の前後でのレスポンスの比較
Response 2. NHS活性前とエタノールアミン添加後のレスポンスの比較
固定化量が少ない場合（1000RU以下）にはResponse 1.を参考にする。
（補足）
このWizardでは、固定化操作に入る前に、リガンド溶液をフローセルにテストインジェク トし、プレコンセントレーション効果がえられるか？また目的の固定化量に固定化できる 条件であるかを機械的に判断する。
セットしたリガンド溶液に問題がある場合には、この時点でプログラムが自動的に終了す る。この場合、フローセルにはリガンドは固定化されていないので、リガンド溶液を調製 しなおして、同じフローセルに再度固定化操作を試みる。
リガンド溶液に問題がある場合には以下のような表示が出る。
①プレコンセントレーション効果が少なすぎる場合
テストインジェクトにおいてリガンドの濃縮が観察されなかった場合、もしくはあまりに も濃縮がゆっくりしているため、添加時間を長くしても目標のレベルまで固定化できそう もない、と判断される場合は上のようなメッセージが表示され、固定化操作が中止される。
この場合には、希釈緩衝液のpHを下げるか、リガンド濃度を上げて、プレコンセントレ ーション効果を上げて固定化操作をやり直す。
②プレコンセントレーション効果が高すぎる場合。
テストインジェクトにおいてリガンドの濃縮が高すぎて、添加時間を短くしても目標のレ ベル以上に固定化されてしまうと判断される場合は上のようなメッセージが表示され、固 定化操作が中止される。
この場合には、希釈緩衝液のpHを上げるか、リガンド濃度を下げて、プレコンセントレ ーション効果を下げて固定化操作をやり直す。
② Specify Flow Rate and Injection Time
リガンドのインジェクトの際の流速およびインジェクト時間だけを設定して、
固定化を行うWizardである。決められた固定化方法を繰り返すような場合に簡 単で便利である。
実験条件 流速 時間
NHS活性化 5μl/min 7分間 リガンドインジェクト 自由に設定 自由に設定 エタノールアミン不活性化 5μl/min 7分間
Specify Flow Rate and Injection Timeを選択し、Next＞をクリックする。
使用するフローセルに固定化するリガンドの名前を入力し、リガンドインジェ クト時間および流速を設定し、Next＞をクリックする。
↓
サンプルのポジションが表示されるので、指示どおりにサンプルをセットする か、もしくはサンプルの位置を確認あるいは変更（101 ページ参照）し、Next
＞をクリックする。
↓
サンプルの位置および容量を確認し、Startをクリックする。
↓
保存先のフォルダーを指定し、ファイル名を入力し、Saveをクリックする。
固定化操作が開始される。
さらに固定化量が下のように表示される。
Response 1および2についての解説は104ページ参照のこと。
9-1-3. Regeneration scouting (再生条件検討実験)
固定化操作を終了後、アナライトとの相互作用を分析するにあたって、アナラ イトの再生条件を検討する必要がある。
再生条件として、以下を満たす必要がある。
①結合したアナライトを完全に再生できること。
②固定化したリガンドが失活しないこと。
③リガンドが、デキストランから脱落しないこと。
再生条件検討のためのWizardがRegeneration scoutingである。
Regeneration scoutingを選択し、Next＞をクリックする。
↓
アナライトの名前、インジェクト時間、および流速を入力し、使用するフロー セルを設定し、Next＞をクリックする。
↓
指定された場所にアナライトを置くか、位置を変更し、Next＞をクリックする。
↓
サンプル位置および容量を再度確認し、Startをクリックする。
↓
保存先のフォルダーを開き、ファイル名を入力し、Saveをクリックする。
実験が開始される
↓
センサーグラムがスタートし、アナライトがインジェクトされる。
↓
上のようなボックスが開いたら、Regeneration…をクリックする。
（アナライトの結合量が少ない場合には、Add Analyte…をクリックすると、ア ナライトを再度添加できる）
14400 14600 14800 15000 15200 15400 15600 15800 16000
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Tim e s
Response