Custom TaqMan ® SNP Genotyping Assays
セクション 5. 2 設計ガイドライン
本セクションの内容：
Inventoried/Made to Order（在庫／注文生産）アッセイ. . . 5-10 TaqMan® Gene Expression Assays . . . 5-10 Custom TaqMan® Gene Expression Assays . . . 5-12 TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents. . . 5-13 マスターミックスの選択. . . 5-15 実験の設計. . . 5-16 カスタムアッセイ . . . 5-16
Inventoried/Made to Order （在庫／注文生産）アッセイ
ワークフロー StepOne™ソフトウェアでInventoried/Made to Orderアッセイタイプを選択する場合に は、Applied Biosystemsは、以下のワークフローによることをお勧めします。
1. アッセイを選択します。
• TaqMan® Gene Expression Assays（下記）
• Custom TaqMan® Gene Expression Assays（5-12ページ）
2. TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagentsを使用します（5-13ペー ジ）。
参考：有無実験は、IPCを加えなくとも行えます。しかし、IPCによって、PCRの 失敗を陰性の試験結果と判断する誤りを防止できます。
3. マスターミックスを選択します（5-15ページ）。
4. StepOneソフトウェアを用いて実験を設計します（5-16ページ）。
TaqMan
®Gene Expression Assays
製品の説明 TaqMan® Gene Expression Assaysは、ヒト、マウス、ラット、Arabidopsis、Drosophila、 C. elegans、C. familiares（イヌ）およびM. mulatta（アカゲザル）遺伝子の有無実験を 行うために開発された、Inventoried/Made to Orderのプローブとプライマーのセットを 包括的に含むアッセイです。
このアッセイには、次の特徴があります。
• このアッセイは、TaqMan®試薬を用いてcDNAサンプル中のターゲットを増幅し、
検出します。
• このアッセイは、自動化デザインと品質管理されたパイプラインにより設計されて います。Inventoriedアッセイは、製造後在庫管理されており、Made to Orderアッ セイは、設計済みで注文があった後に製造されます。
• Applied Biosystems TaqMan®マスターミックスを用いて、広範なサーマルサイク リング条件により、最適な性能を発揮するように設計されています。
• 可能な場合には、エクソン－エクソン結合部とクロスするプローブを設計すること により、ゲノムDNAを増幅することなくターゲットcDNAの増幅が行えます（アッ セイIDにmサフィックスが表示される）。
製品の必要条件 TaqMan Gene Expression Assaysには、以下が必要です。
• 次の3コンポーネント：
– ウェル当たりのcDNAサンプル（RNAから変換）量は1～100 ngで、各測定 ウェル中のcDNA量は同じ。
– 20✕ Gene Expression Assay Mix（各ターゲットに特異的）。各アッセイミック スは、調製済み20✕ミックス中に、2つの非ラベルPCRプライマーとFAM™色 素ラベルTaqMan® MGB（マイナーグルーブバインダー）プローブを含みます。
1✕の最終濃度は、プローブが250 nM、各プライマーは900 nMです。
– TaqMan® Gene Expression Master MixまたはTaqMan Universal PCR Master Mix（withまたはwithout AmpErase UNG）。
利用可能なアッセイ TaqMan Gene Expression Assaysは、ヒト、マウス、ラット、Arabidopsis、Drosophila、 C. elegans、C. familiares（イヌ）および M. mulatta（アカゲザル）遺伝子用に利用でき ます。部品番号は、
• InventoriedアッセイはPN 4331182
• Made to OrderアッセイはPN 4351372
アッセイ名のプレフィックスは、アッセイ対象種を表しています。HsはHomo sapiens
（ヒト）、Mm は Mus musculus（マウス）、Rn は Rattus norvegicus（ラット）、At は Arabidopsis thaliana、DmはDrosophila melanogaster、CeはC. elegans、Cfは C. familiares（イヌ）、RhはM. mulatta（アカゲザル）です。
アッセイ名のサフィックスは、以下の表に示すようなアッセイの特徴を示します。
TaqMan® Endogenous Control Assays
TaqMan® Endogenous Control Assaysは、以下により入手可能です。
• Inventoried TaqMan Gene Expression Assays（PN 4331182）－各アッセイには、
1本の調製済み20✕チューブ中に、FAM™色素ラベルTaqMan® MGBプローブを 含みます。
• ヒト、マウスおよびラット種用個別コントロールアッセイ（部品番号は多岐）－各 アッセイには、FAM™ 色素ラベル TaqMan® MGB プローブ、VIC®色素ラベル TaqMan® MGBプローブまたはTAMRA™色素ラベルプローブを含みます。VIC色 素ラベルを含むTaqMan Endogenous Controlsでは、プライマーが制限されます。
重要！ Applied Biosystems は、TAMRA™ 色素をレポーターやクエンチャーとして StepOneシステムで使うことはお勧めしません。TAMRA色素は、StepOnePlusシステ ムでレポーターやクエンチャーとして使えます。
サフィックス 説明
_m このアッセイのプローブはエクソン結合部に広がるため、ゲノムDNA を検出 しません。
_s このアッセイのプライマーおよびプローブは単一エクソン内で作用するよう設 計されており、ゲノムDNAを検出します。
_g このアッセイのプライマーおよびプローブは単一エクソン内で作用する可能性 があり、ゲノムDNAを検出する可能性があります。
_mH このアッセイは、配列相同性が高い遺伝子ファミリーに属するトランスクリプ ト用に設計されています。このアッセイでは、ターゲット遺伝子と最も類似し た配列相同性を有する遺伝子との間で、10 CTから15 CTの差が出ます。その ため、サンプル中にターゲットトランスクリプトと最も相同性が高いトランス クリプトに同数のコピーがあった場合、最も相同性が高いトランスクリプトの
1000から30,000倍の感度でターゲットトランスクリプトを検出できます。
_sH _gH
_u このアッセイのアンプリコンはエクソン結合部に広がり、プロ－ブはそのうち の一つのエクソン内に完全に配置されます。
詳細について • 最新の製品および各製品の使用方法については、Applied Biosystemsウェブサイト をご覧ください：
http://www.appliedbiosystems.com/
a. ホームページの［TaqMan® Products］（TaqMan®製品）から、［TaqMan® Gene Expression Assays］を選択します。
b.［Gene Expression Assays & Arrays］のページで、
•［Individual Assays］（個別のアッセイ）にてTaqMan® Gene Expression Assaysを選択します。このオプションを選択すると、FAM色素ラベル化 プローブを含むTaqMan Endogenous Control Assaysをはじめとして、全 TaqMan Gene Expression Assaysへリンクされます。
または
•［Individual Control Assays］（個別のコントロールアッセイ）にて
「TaqMan® Endogenous Control Assays」を選択します。このオプショ ンを選択すると、個別のTaqMan Endogenous Control Assays（FAM色素 ラベル化 TaqMan MGB プローブ、VIC色素ラベル化 TaqMan MGBプ ローブ、またはTAMRA色素ラベル化プローブを含む）へリンクされます。
• Custom TaqMan Endogenous Control Assaysについての情報は、『Using TaqMan® Endogenous Control Assays to Select an Endogenous Control for Experimental Studies Application Note』をご参照ください。
• TaqMan Gene Expression Assays を使って PCR 反応を調製する方法については、
『TaqMan® Gene Expression Assays Protocol』をご参照ください。
Custom TaqMan
®Gene Expression Assays
製品の説明 Custom TaqMan® Gene Expression Assaysは、TaqManプローブとプライマーのセット で、お客様から提示のあった配列情報に基づいて Custom TaqMan® Genomic Assays サービスが設計、合成、調製したものです。Custom TaqMan Gene Expression Assays を使うと、どのような生物の遺伝子やスプライシング変異でも有無実験を実施できます。
このアッセイには、次の特徴があります。
• TaqMan®試薬を用いてcDNAサンプル中のターゲットを増幅し、検出します。
• 独自のアッセイ設計ソフトウェアを用いて開発されています。
• Applied Biosystems TaqMan®マスターミックスを用いて、広範なサーマルサイク リング条件により、最適な性能を発揮するように設計されています。
製品の必要条件 Custom TaqMan Gene Expression Assaysには、以下が必要です。
• ターゲット配列に関する提出用ファイル。無償のFile Builderソフトウェアを使用 して提出用ファイルを作成し、Custom TaqMan® Genomic Assaysサービスに当該 ファイルを提示してください。
• 次の3コンポーネント：
– ウェル当たりのcDNAサンプル（RNAから変換）量は1～100 ngで、各測定 ウェル中のcDNA量は同じ。
– 20✕ Gene Expression Assayまたは60✕ Gene Expression Assay（各ターゲット に特異的）。各アッセイは、調製済み20✕または60✕ミックス中に、2種類の ターゲット特異的プライマーとFAM™色素ラベルTaqMan MGBプローブを含 みます。1✕の最終濃度は、プローブが250 nM、各プライマーは900 nMです。
– TaqMan® Gene Expression Master MixまたはTaqMan Universal PCR Master Mix（withまたはwithout AmpErase UNG）。
詳細について • 最新の製品および各製品の使用方法については、Applied Biosystemsウェブサイト をご覧ください：
http://www.appliedbiosystems.com/
a. ホームページの［TaqMan® Products］（TaqMan®製品）から、［TaqMan® Gene Expression Assays］を選択します。
b.［Gene Expression Assays & Arrays］ページの［Individual Assays］（個別の アッセイ）で［TaqMan® Gene Expression Assays］を選択します。
• Custom TaqMan Gene Expression Assaysの注文方法については、『Custom TaqMan® Genomic Assays Protocol: Submission Guidelines』をご参照ください。
• Custom TaqMan Gene Expression Assaysを使ってPCR反応を調製する方法につ いては、『Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol』をご参照ください。