1 ジェノタイピング実験について

本セクションの内容：

概要 . . . 4-4 アッセイタイプの選択. . . 4-6

概要

ジェノタイピング 実験とは？

ジェノタイピング実験とは、未知のサンプルのジェノタイプを決定するエンドポイント 実験です。この実験タイプでは、一塩基多型（SNP）の区別が可能です。

ジェノタイピング実験では、未知のサンプルが以下に該当するかどうかを決定します。

• ホモ接合体（アレル1のみを含むサンプル）

• ホモ接合体（アレル2のみを含むサンプル）

• ヘテロ接合体（アレル1およびアレル2の両方を含むサンプル）

コンポーネント

ジェノタイピング実験用のPCR反応には、以下のコンポーネントが含まれます。

• サンプル－ターゲットのジェノタイプが未知のサンプル。

•^{（オプション）反復－}同じコンポーネントと容量を含む同一の反応。

• ネガティブコントロール － テンプレートの代わりに蒸留水か緩衝液を含むサンプ ル。テンプレートを含まないコントロール（NTC）ともいう。ネガティブコント ロールでは増幅しません。

•（オプション）ポジティブコントロール－既知のジェノタイプ（アレル1^のホモ接 合体、アレル2のホモ接合体、アレル1および2のヘテロ接合体）を含むサンプル。

装置 ジェノタイピング実験には、二つのステップが必要であり、サーマルサイクリング（PCR 増幅）の後に、発生する蛍光信号のエンドポイント検出が行われます。サーマルサイク リングステップ（PCR^{増幅）は、}Applied Biosystems StepOne^™およびStepOnePlus^™ Real-Time PCR Systemsまたはスタンドアロンサーマルサイクラーで実施できます。

StepOne^™およびStepOnePlus^™システムを使用すると、

• PCRの解析を行うことができ、トラブルシューティングに役立ちます。

• エンドポイントプレート読み取りを個別に行えます。

ジェノタイピング 実験の仕組み

ジェノタイピング実験では、PCRには各アレルに特異的な蛍光色素でラベルしたプロー ブが含まれます。プローブには、各アレルを区別する、様々な蛍光レポーター色素が含 まれています。

StepOne ^および StepOnePlus ^{システムでは、}TaqMan^® マイナーグルーブバインダー

（MGB）プローブを使用できます。各TaqMan^® MGBプローブは、以下を含みます。

• 各プローブの5′ 末端に結合したレポーター色素

– VIC^®色素は、アレル1プローブの5′ 末端に結合しています。

– FAM^™色素は、アレル2プローブの5′ 末端に結合しています。

• マイナーグルーブバインダー（MGB）

この修飾により、プローブ長を増すことなく溶融温度（Tm）を高くすることが可 能となり（Afonina et al., 1997; Kutyavin et al., 1997）、短いプローブの設計がで きます。その結果、TaqMan MGBプローブによって、一致プローブと不一致プロー ブでTm値に大きな差が生じます。Tm値の差が大きいほど、正確なジェノタイピ ングを行うことができます。

• プローブの3_′ 末端に結合した非蛍光クエンチャー（NFQ）

クエンチャーは蛍光を発生しないため、リアルタイム PCR システムにおいて、レ ポーター色素の作用をより正確に測定することができます。

PCR中、各プローブは、フォワードプライマー部位とリバースプライマー部位との間で、

相補的な配列に対して特異的にアニーリングします。AmpliTaq Gold^® DNA Polymerase は、アレル配列にハイブリダイズ（一致）するプローブのみ開裂します。開裂により、

レポーター色素は、クエンチャー色素から分離し、レポーター色素の蛍光が増加します。

このように、PCR増幅中に発生する蛍光信号は、サンプル中に存在するアレルを示しま す。

プローブとアレル配列の不一致

プローブとアレルとの不一致により、プローブのハイブリダイゼーション効率が低下し ます（図4-1）。また、AmpliTaq Gold DNA Polymeraseは、不一致プローブを開裂する のではなく、不一致プローブを取り除いて、リポーター色素を生じる作用があると考え られています。

図4-1 ジェノタイピング実験におけるアレルとプローブ配列の一致および不一致に よる結果

表4-1に、上記のジェノタイピング実験例で考えられる結果を要約しました。

ワークフロー StepOneシステムおよびStepOnePlusシステムでジェノタイピング実験を行う前に、以 下のように実験の準備を行います。

1. アッセイタイプを選択します（下記）。

2. 選択したアッセイタイプに関する設計ガイドラインを確認します（セクション 4.2

（4-9ページ））。

表4-1 ジェノタイピング実験結果

以下のシグナルが大幅に増加した場合 意味

VIC^®色素の蛍光のみ アレル1のホモ接合性 FAM^™色素の蛍光のみ アレル2のホモ接合性

両方の蛍光シグナル ヘテロ接合性

アッセイタイプの選択

StepOneソフトウェアで実験を設計する場合には、ジェノタイピング実験として、以下

のアッセイタイプを選択できます。

• 設計済み／検証済み（下記）

• カスタム（4-7ページ）

本セクションでは、各アッセイタイプに利用可能な製品をリストします。

参考：アッセイは、目的とするターゲットに特異的です。マスターミックスには、PCR 反応を行うために必要なその他のコンポーネントが含まれています。

設計済み／

検証済みアッセイ

参考：ジェノタイピング実験では、FastまたはSYBR^® Greenマスターミックスやプロ トコルは使用できません。

設計済み／検証済みアッセイを用いて実験を設計する際のガイドラインについては、

4-10ページをご参照ください。

製品 属性

TaqMan^® SNP Genotyping Assays

• 高密度でゲノムワイドなマーカー範囲用設計済みアッセイ。

• スクリーニング、関連解析、候補領域、候補遺伝子やファイン マッピング研究用。

• 便利な単一チューブ形式。

TaqMan^® Drug

Metabolism Genotyping Assays

• 各種の薬物代謝酵素や薬物トランスポーターをコードする 220種類に及ぶ遺伝子の多型を検出。

• 一塩基多型（SNP）、挿入／欠失（in/del）や多塩基多型（MNP） の研究用。

Pre-Developed TaqMan^® Assay Reagents for Allelic Discrimination

• ジェノタイプに応じて精製した、特異的な突然変異用DNAサ ンプル。ほとんどのアッセイで 2 つのアレル間の一塩基多型

（SNP）の判別が可能。

• ジェノタイピングの精度を高めるため、マイナーグルーブバイ ンダー（MGB）を添加。

• アレル1および2コントロールDNAを含み、各測定において 各ホモ接合体信号が発生するように設計。

• 密閉チューブシステムにより、PCR後の操作やゲルが不要。

TaqMan^® Genotyping Master Mix

SNPジェノタイピングアプリケーションでエンドポイント蛍光検 出に最適化されています。

• 特異的なクラスターと高いコール率により、明確なアレル識別 が可能。

• 優れたPCR前および後の安定性により、ハイスループットセッ トアップと解析を実現。

• TaqMan^® SNP Genotyping Assaysにより検証済み。

• 全アッセイに同一試薬を用いることで、アッセイの実施を簡素 化。

TaqMan^® 2✕ Universal PCR Master Mix （with またはwithout AmpErase^® UNG）

• cDNAまたはDNAをテンプレートに用いるTaqMan^®アッセイ で最適性能を発揮。

• 優れたアッセイ能を保証するコンポーネントを含む。

• 全アッセイに同一試薬を用いることで、アッセイの実施を簡素 化。

カスタムアッセイ

参考：ジェノタイピング実験では、FastまたはSYBR^® Greenマスターミックスやプロ トコルは使用できません。

カスタムアッセイを用いて実験を設計する際のガイドラインについては、4-14ページを ご参照ください。

製品 属性

Custom TaqMan^® SNP Genotyping Assays

• いかなる生物体でも一塩基多型（SNP）の検出が可能。

• 6塩基までの挿入／欠失（in/del）を検出。

• 6塩基までの多塩基多型（MNP）を検出。

• 便利な単一チューブ形式。

TaqMan^® Genotyping Master Mix

SNPジェノタイピングアプリケーションでエンドポイント蛍光検 出に最適化されています。

• 特異的なクラスターと高いコール率により、明確なアレル識別 が可能。

• 優れたPCR前および後の安定性により、ハイスループットセッ トアップと解析を実現。

• TaqMan^® SNP Genotyping Assaysにより検証済み。

• 全アッセイに同一試薬を用いることで、アッセイの実施を簡素 化。

TaqMan^® 2_✕ Universal PCR Master Mix （with またはwithout AmpErase^® UNG）

• cDNAまたはDNAをテンプレートに用いるTaqMan^®アッセイ で最適性能を発揮。

• 優れたアッセイ能を保証するコンポーネントを含む。

• 全アッセイに同一試薬を用いることで、アッセイの実施を簡素 化。