Custom TaqMan ® SNP Genotyping Assays
セクション 5. 1 有無実験について
本セクションの内容：
概要 . . . 5-4 アッセイタイプの選択. . . 5-6
概要
有無実験とは？ 有無実験とは、特定の核酸配列（ターゲット）がサンプル中に存在するか、しないかを 決定するエンドポイントアッセイです。ターゲットの実際の量は定量できません。
有無実験は、ウイルスやバクテリアなどの病原体が存在するか、しないかを検出するた めに広く使用されています。例えば、有無実験を用いて、ハンバーガー肉中にSalmonella 菌が存在するかどうかを調べることができます。結果は、Salmonella 菌が存在するか、
しないかであって、菌の定量は行えません。
コンポーネント
有無実験用のPCR反応には、以下のコンポーネントが含まれます。
• サンプル－ターゲットの存在が未知のサンプル。
• 反復－同じコンポーネントと容量を含む同一の反応。
• 内在性ポジティブコントロール（IPC）－ PCR反応に添加する短い合成DNAテン プレート。IPCを使用して、真の陰性結果と、PCR阻害剤や不適切なアッセイセッ トアップ、試薬や装置の不具合が影響した反応とを区別できます。
参考：有無実験は、IPCを加えなくとも行えます。しかし、IPCによって、PCRの 失敗を陰性の試験結果と判断する誤りを防止できます。
• ネガティブコントロール － サンプルテンプレートの代わりに蒸留水やバッファー を含むウェル。ターゲットの増幅は、ネガティブコントロールウェルでは起こりま せん。
有無実験用の PCR 反応液は、StepOne ソフトウェアによって、3 種類の方法でセット アップができます。
セットアップ ウェルタイプ
IPCセットアップ 3種類のウェルがあります。
• Unknown-IPC wells（未知のIPCウェル）－ウェルには、サンプルテ ンプレートとIPC テンプレートが含まれます。ターゲットの存在は不明 です。
• Negative control-IPC wells（ネガティブコントロールIPCウェル）－ ウェルには、PCR反応液中にサンプルテンプレートの代わりにIPCテン プレートと蒸留水または緩衝液が含まれます。ネガティブコントロール IPCウェルではIPCテンプレートのみが増幅します。反応にサンプルテン プレートが含まれないからです。別称「IPC+」です。
• Negative control-blocked IPC wells（ネガティブコントロールブロッ ク済みIPCウェル）－ウェルには、PCR反応液中にサンプルテンプレー トの代わりにIPC 遮断剤が含まれます。増幅はネガティブコントロール ブロック済みIPC ウェルでは起きません。反応にサンプルテンプレート が含まれず、IPC の増幅が遮断されるからです。別称「no amplification control（NAC）（増幅しないコントロール）」です。
IPCなしの シングル プレックス セットアップ
2種類のウェルがあります。
• Unknown wells（未知のウェル）－ウェルには、サンプルテンプレート が含まれます。ターゲットの存在は不明です。
• Negative controls（ネガティブコントロール）－ウェルには、サンプル テンプレートの代わりに蒸留水やバッファーが含まれます。
エンドポイント検出と PCR後プレート 読み取り
有無実験は、エンドポイント実験であって、PCRが完了した後に蛍光データが収集され ます。
有無実験のトラブルシューティングを行うため、Applied Biosystems StepOne™および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems を用いてリアルタイムPCRを実施することが できます。 PCR増幅にStepOne™およびStepOnePlus™システムを用いる場合には、PCR 前読み取りとPCR後読み取りとを個別に実施してください。
有無実験の仕組み PCR中、蛍光プローブは、テンプレートDNA上のフォワードプライマー部位とリバー スプライマー部位との間にある相補的なターゲットに対して、特異的にアニーリングし ます。その後伸長中に、AmpliTaq Gold® DNA Polymerase は、ターゲットを含む各サ ンプル中のハイブリダイズしたプローブを開裂します。各一致プローブの開裂により、
レポーター色素は、クエンチャー色素から分離し、レポーター色素の蛍光が増加します。
PCRサイクリング後に、StepOne™およびStepOnePlus™装置は、PCR増幅中に発生し た蛍光を読み取ります。この蛍光信号を用いて、各サンプル中にターゲットが存在する か、しないかを決定します。レポーター信号は、以下の式により、パッシブリファレン スの蛍光に対してノーマライズが行われます。
IPCの取り込み
IPC は、低コピー数の構成核酸を検出するために反応プレートに加えられる、もう一つ のTaqMan®プローブとプライマーのセットです。同じ反応ウェル中のIPCとターゲッ トは、同時に増幅されます。ウェルに増幅が起こらない場合には、StepOne™ソフトウェ アは、IPC の陽性信号を用いて、ウェルに増幅が起こらなかったのはターゲットテンプ レートが存在しなかったからであって、分注時の誤操作や抑制によるものではないこと を確認します。
参考：有無実験は、IPCを加えなくとも行えます。しかし、IPCによって、PCRの失敗 を陰性の試験結果と判断する誤りを防止できます。
IPCなしの マルチ プレックス セットアップ
2種類のウェルがあります。
• Unknown-Unknown wells（未知－未知ウェル）－ウェルには、サンプ ルテンプレートが含まれます。ターゲットの存在は不明です。
• Negative control-Negative control wells（ネガティブコントロール－
ネガティブコントロールウェル）－ウェルには、サンプルテンプレート の代わりに蒸留水や緩衝液が含まれます。
セットアップ ウェルタイプ
Rn (TT) = ターゲットテンプレート配列の蛍光強度
パッシブリファレンスの蛍光強度
Rn (IPC) = 内在性ポジティブコントロールの蛍光強度
パッシブリファレンスの蛍光強度
ワークフロー StepOneシステムおよびStepOnePlusシステムで実験を行う前に、以下のように実験の 準備を行います。
1. アッセイタイプを選択します（下記）。
2. 選択したアッセイタイプに関する設計ガイドラインを確認します（セクション 5.2
（5-9ページ））。
アッセイタイプの選択
StepOneソフトウェアで実験を設計する場合には、有無実験として、以下のアッセイタ
イプを選択できます。
• Inventoried/Made to Order（在庫／注文生産）（5-7ページ）
• カスタム（5-8ページ）
本セクションでは、各アッセイタイプに利用可能な製品をリストします。
参考：アッセイは、目的とするターゲットに特異的です。マスターミックスには、PCR 反応を行うために必要なその他のコンポーネントが含まれています。
Inventoried/Made to Order
（在庫／注文生産）
アッセイ
重要！ Applied Biosystems は、TAMRA™ 色素をレポーターやクエンチャーとして StepOneシステムで使うことはお勧めしません。TAMRA色素は、StepOnePlusシステ ムでレポーターやクエンチャーとして使えます。
参考：有無実験では、FastまたはSYBR® Greenマスターミックスやプロトコルは使用 できません。
Inventoried/Made to Order（在庫／注文生産）アッセイを用いて実験を設計する際のガ イドラインについては、（5-10ページ）をご参照ください。
製品 属性
TaqMan® Gene Expression Assays
• ヒト、マウス、ラット、Arabidopsis、Drosophila、C. elegans、 C. familiares（イヌ）およびM. mulatta（アカゲザル）遺伝子 用の調製済み遺伝子特異的プライマーとプローブのセット
• プローブは、FAM™色素ラベルMGBプローブ
• 便利な単一の20✕チューブで提供
• Inventoried（在庫）またはMade to Order（注文生産）アッセ イとして入手可能
TaqMan® Endogenous Control Assays
参考：FAM™色素ラベル化 TaqMan® Endogenous Control Assaysは、
Inventoried TaqMan Gene Expression Assaysとして 含まれています。
• 最適化、調製済み、そのまま使用可能な内在性コントロール アッセイ
• ヒト、マウス、ラット、Arabidopsis、Drosophila およびあら ゆる真核生物種用のコスト効果が高い遺伝子発現定量
• FAM™色素とVIC®色素ラベルの選択が可能（プライマー制限）
Custom TaqMan® Gene Expression Assays
• あらゆる種または生物
• 自由にターゲットを選択
• プローブは、FAM™色素ラベルMGBプローブ
• 便利な単一の20✕チューブで提供 TaqMan® Gene Expression
Master Mix
リアルタイム PCR により、通常の実験や特殊な実験で正確な定 量を行う場合に使用
• ターゲットの1コピーまで検出する優れた検出精度
• 1回の反応中に含まれる2つのターゲットを一緒に増幅するマ ルチプレックスPCR
• 同じ遺伝子ファミリーに属する遺伝子の区別が可能な高い特 異性
• Custom TaqMan® Gene Expression Assaysにより検証済み
• 全アッセイに同一試薬を用いることで、アッセイの実施を簡素 化
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix （with またはwithout AmpErase® UNG）
• cDNAまたはDNAをテンプレートに用いるTaqMan®アッセイ で最適性能を発揮
• 優れたアッセイ能を保証するコンポーネントを含む
• 全アッセイに同一試薬を用いることで、アッセイの実施を簡素 化
カスタムアッセイ
重要！ Applied Biosystems は、TAMRA™ 色素をレポーターやクエンチャーとして StepOneシステムで使うことはお勧めしません。TAMRA色素は、StepOnePlusシステ ムでレポーターやクエンチャーとして使えます。
参考：有無実験では、FastまたはSYBR® Greenマスターミックスやプロトコルは使用 できません。
カスタムアッセイを用いて実験を設計する際のガイドラインについては、（5-16ページ）
をご参照ください。
製品 属性
カスタムTaqMan®プローブ とプライマー
• あらゆる種または生物
• 色素ラベル、クエンチャーおよび合成スケールを自由に選択
• Applied Biosystemsのアッセイ設計ガイドラインに従い、Primer Express® Softwareで使用
Primer Express® Software リアルタイム PCR 用のプライマーとプローブを設計するソフト ウェア
TaqMan® Gene Expression Master Mix
リアルタイム PCR により、通常の実験や特殊な実験で正確な定 量を行う場合に使用
• ターゲットの1コピーまで検出する優れた検出精度
• 1回の反応中に含まれる2つのターゲットを一緒に増幅するマ ルチプレックスPCR
• 同じ遺伝子ファミリーに属する遺伝子の区別が可能な高い特 異性
• Custom TaqMan® Gene Expression Assaysにより検証済み
• 全アッセイに同一試薬を用いることで、アッセイの実施を簡素 化
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix （with またはwithout AmpErase® UNG）
• cDNAまたはDNAをテンプレートに用いるTaqMan®アッセイ で最適性能を発揮
• 優れたアッセイ能を保証するコンポーネントを含む
• 全アッセイに同一試薬を用いることで、アッセイの実施を簡素 化