150 Time (min)

Fig.2-16

酢酸緩衝液を用いた発光量操作 (n=4) 白い領域：pH4酢酸緩衝液発光量が低下灰色の領域：pH6酢酸緩衝液発光量が回復

2 2 2

2----8 8 8 8----3. 3. 3. 3.

酢酸処理前後酢酸処理前後酢酸処理前後酢酸処理前後のののヤコのヤコヤコウタケヤコウタケウタケ発光ウタケ発光発光発光スペクトルスペクトルスペクトルスペクトルののの測定の測定測定測定

酢酸緩衝液の

pH

による発光量の増減に伴って

pH

依存的に発光スペクトルが変化する可能性があるため、酢酸添加前後のヤコウタケ切片の生物発光スペクトルを測定した

(Fig.2-17)

。その結果、発光スペクトルは酢酸緩衝液の添加の前後で変化は認められな

かった。また、pH 4の酢酸緩衝液を添加した後に減衰していく発光のスペクトルも測定したが、発光波長の変化は起こらず発光量低下のみが起こった。この結果から、ヤコウタケ生物発光は環境の

pH

に依存して発光色を変化させることはないことがわかった。しかし、細胞内部の

pH

緩衝機能が働いてヤコウタケ切片細胞内部の

pH

が変化していない可能性も考えられる。

Fig.2-17

酢酸緩衝液添加前後のヤコウタケ切片発光スペクトル

太線：酢酸処理前の発光スペクトル

細線：酢酸で低下した発光量が回復した後の発光スペクトル

処理法：pH4添加後入れ替えで

pH6

緩衝液添加し、発光回復後のスペクトルを測定

Wavelength (nm)

A rb it ra ry u n it

1.2 1.0 0.8

0.4 0.6

0.2 0 300 400 500 600 700 800

Wavelength (nm)

A rb it ra ry u n it

1.2 1.0 0.8

0.4 0.6

0.2 0 300 400 500 600 700 800

2 2

2 2----9. 9. 9. 9. ヤコウタケヤコウタケ発光ヤコウタケヤコウタケ発光発光発光へのへのへのへの各種添加物各種添加物各種添加物の各種添加物ののの効果検証効果検証効果検証効果検証

ホタルの

L-L

発光系は

Mg

²⁺、

ATP

などの補因子が必要であり、発光反応にはルシフェリン以外に必要な物質が存在する。また、オワンクラゲの発光はキレート剤によって発光が減少することからカルシウムイオンが発光のトリガーとなることが発見された歴史がある。このことからヤコウタケの発光に添加物を加えることで、発光反応に関するヒントを得ることができる可能性がある。

前章で酢酸がヤコウタケ生物発光に対して顕著な効果を持っている事を示した。そこで酢酸と同じカルボン酸類の他、カルボン酸の還元体であるアルデヒド類、アルコール類、逆に塩基性のアミン類などを用いてヤコウタケ切片に添加して発光に対する影響を調査した。

2 2 2 2----9 9 9 9----1. 1. 1. 1.

ヤコウタケヤコウタケヤコウタケヤコウタケ発光発光発光への発光へのへのカルボンへのカルボンカルボンカルボン酸類酸類酸類酸類のののの添加添加添加添加

カルボン酸類のヤコウタケ発光への影響を調べるために、ヤコウタケ切片を

5％

DMSO

水溶液に浸しそこに約

10 mM

のカルボン酸を添加することで、発光への影響を確認した(Fig.2-18)。その結果、多くのカルボン酸類はヤコウタケの発光に影響なかったが、いくつかの添加物は発光を失活させる効果が確認できた。傾向としては水溶性の比較的高いものが発光を低下させる影響がある。

長鎖アルキルカルボン酸は水や緩衝液のみでは溶解しづらいので、今回の測定には

5％DMSO

水溶液を用いた。DMSO にもヤコウタケ発光を多少阻害する効果が見られ

た。発光低下効果があったものは、ケイ皮酸、乳酸、プロピオン酸、モノ、ジ、トリクロロ酢酸類があった。この中でモノ、ジ、トリクロロ酢酸類、プロピオン酸、乳酸はヤ

コウタケ発光を阻害する効果があった酢酸に分子構造が比較的類似しているため、今回の測定でも発光阻害効果があったと推測できる。しかし、ケイ皮酸については酢酸と類似性が見られないことから、酢酸とは異なる効果で発光阻害を起こしている可能性もあ

る

(Fig.2-19)

。カルボン酸類には発光への影響が少ないものが多かった理由として、カ

ルボン酸類は脂肪酸として生体内に存在し、また

TCA

サイクルなどにクエン酸、グルタル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸などが関連しているなど、生体内ではありふれた物質であることが挙げられる。このため、多くのカルボン酸類がヤコウタケ細胞へ与える悪影響は低く発光反応にも影響を与えなかったと考えられる。

1010 1010 1x101x10 1x101x10 ²²²² 1x10 1x10 1x10 1x10 ³³³³ 1x10 1x10 1x10 1x10 ⁴⁴⁴⁴ 1x101x10 1x101x10 ⁵⁵⁵⁵ 1x101x10 1x101x10 ⁶⁶⁶⁶ 1x10 1x10 1x10 1x10 ⁷⁷⁷⁷

0 00

0 5555 10101010 15151515

カルボンカルボンカルボン

カルボン酸類添加酸類添加酸類添加１酸類添加１１１

DMSO average DMSO average DMSO average DMSO average Arabic acid average Arabic acid average Arabic acid average Arabic acid average Myristic acid average Myristic acid average Myristic acid average Myristic acid average Chinnamic acid average Chinnamic acid average Chinnamic acid average Chinnamic acid average Citric acid average Citric acid average Citric acid average Citric acid average Fumaric acid average Fumaric acid average Fumaric acid average Fumaric acid average Palmitic acid average Palmitic acid average Palmitic acid average Palmitic acid average Lactic acid average Lactic acid average Lactic acid average Lactic acid average Arachidic acid average Arachidic acid average Arachidic acid average Arachidic acid average Linoleic acid average Linoleic acid average Linoleic acid average Linoleic acid average

L ig h t in te n s it y ( c o u n ts / s e c ) L ig h t in te n s it y ( c o u n ts / s e c ) L ig h t in te n s it y ( c o u n ts / s e c ) L ig h t in te n s it y ( c o u n ts / s e c )

time (h) time (h)time (h) time (h)

10 10 10 10 1x10 1x10 1x10 1x10 ²²²² 1x10 1x10 1x10 1x10 ³³³³ 1x10 1x10 1x10 1x10 ⁴⁴⁴⁴ 1x10 1x10 1x10 1x10 ⁵⁵⁵⁵ 1x101x10 1x101x10 ⁶⁶⁶⁶ 1x10 1x10 1x10 1x10 ⁷⁷⁷⁷

0 00

0 5555 10101010 15151515

カルボンカルボンカルボン

カルボン酸添加酸添加酸添加酸添加２２２２

water only average2 water only average2 water only average2 water only average2 Glutaric acid average Glutaric acid average Glutaric acid average Glutaric acid average DL-Tartaric acid average DL-Tartaric acid average DL-Tartaric acid average DL-Tartaric acid average Malonic acid average Malonic acid average Malonic acid average Malonic acid average Succinic acid average Succinic acid average Succinic acid average Succinic acid average Oxalic acid average Oxalic acid average Oxalic acid average Oxalic acid average Propionic acid average Propionic acid average Propionic acid average Propionic acid average Chloroacetic acid average Chloroacetic acid average Chloroacetic acid average Chloroacetic acid average Dichloroacetic acid average Dichloroacetic acid average Dichloroacetic acid average Dichloroacetic acid average Trichloroacetic acid average Trichloroacetic acid average Trichloroacetic acid average Trichloroacetic acid average

L ig h t in te n s it y ( c o u n ts / s e c ) L ig h t in te n s it y ( c o u n ts / s e c ) L ig h t in te n s it y ( c o u n ts / s e c ) L ig h t in te n s it y ( c o u n ts / s e c )

time (h) time (h)time (h) time (h)

Fig.2-18

ヤコウタケ切片へのカルボン酸類添加時の発光経時変化

(n=4)

S O

dimethyl sulfoxide

O HO

myristic acid

O HO

cinnamic acid HO

O OH

O HO

citric acid

O OH O

fumaric acid O HO

palmitic acid

OH O

lactic acid O HO

arachidic acid

O OH

linoleic acid O

OH O

OH glutaric acid

OH O HO

O OH tartaric acid

O HO

O OH

malonic acid O

OH O

succinic acid

O OH propionic acid

O Cl OH

chloroacetic acid

O OH Cl Cl

dichloroacetic acid

O HO

Cl Cl Cl

trichloroacetic acid

OH O HO

O oxalic acid O

OH OH

arabic acid

2 2 2 2----9 9 9 9----2. 2. 2. 2.

ヤコウタケヤコウタケヤコウタケヤコウタケ発光発光発光への発光へのへのアルデヒドへのアルデヒドアルデヒドアルデヒド類類類類、、、、アルコールアルコールアルコールアルコール類類類の類ののの添加添加添加添加

アルデヒド類のヤコウタケ発光への影響を確認するために、約

10 mM

の各種アルデヒドを含む

5％DMSO

水溶液中にヤコウタケ切片を浸すことで、発光への影響を確認した。その結果、ほぼ全てのアルデヒドにおいて発光の減衰が確認された

(Fig.2-20)

。そのため、アルデヒド類はヤコウタケ発光を阻害する効果があると考えられる。また、

5

％アルコール水溶液を用いた場合のヤコウタケ切片の発光経時変化は、エタノール、

メタノール水溶液では発光の減少傾向が見られたものの低い発光量で発光が持続した。

またイソプロパノール水溶液では発光が阻害された

(Fig.2-21)

。

アルデヒド類は多くの生物に対して有毒であるため、発光量が減少したと考えられる。

アルデヒド類の中でもグリオキサールだけが発光減少効果がほぼ見られない。測定した他のアルデヒドと違い、グリオキサールだけがアルデヒド基が

2

つ存在するジアルデヒドであるので、その点が影響していると考えられる

(Fig.2-22)

。

メタノールなどのアルコール類をそのままヤコウタケに添加すると、その発光は素早く失活することは確認している。それに対して今回の

5

％アルコール添加ではあまり低下しなかった。アルコールの濃度が十分に薄いために発光に対する影響が低いことが原因だと考えられる。

10 10 10 10 100100100 100 1x10 1x10 1x10 1x10³³³³ 1x101x10 1x101x10⁴⁴⁴⁴ 1x10 1x10 1x10 1x10⁵⁵⁵⁵ 1x10 1x10 1x10 1x10⁶⁶⁶⁶ 1x101x10 1x101x10⁷⁷⁷⁷

0 00

0 5555 10101010 15151515 アルコール

アルコールアルコールアルコール平均平均平均平均

Water Ave.

Water Ave.Water Ave.

Water Ave.

5% MeOH Ave.

5% MeOH Ave.5% MeOH Ave.

5% MeOH Ave.

5% EtOH Ave.

5% EtOH Ave.5% EtOH Ave.

5% EtOH Ave.

5% IPA Ave.

5% IPA Ave.5% IPA Ave.

5% IPA Ave.

L u m in e sc en c e i n te n si ty L u m in e sc en c e i n te n si ty L u m in e sc en c e i n te n si ty L u m in e sc en c e i n te n si ty

time (h) time (h)time (h) time (h)

Fig.2-21

ヤコウタケ切片へのアルコール類添加時の発光経時変化(n=8)

10 10 10 10 100 100100 100 1x101x10 1x101x10³³³³ 1x10 1x10 1x10 1x10⁴⁴⁴⁴ 1x101x10 1x101x10⁵⁵⁵⁵ 1x10 1x10 1x10 1x10⁶⁶⁶⁶ 1x10 1x10 1x10 1x10⁷⁷⁷⁷

0 00

0 5555 10101010 15151515 アルデヒド

アルデヒドアルデヒドアルデヒド平均平均平均平均

Formaldehyde Ave.

Formaldehyde Ave.Formaldehyde Ave.

Formaldehyde Ave.

Acetaldehyde Ave.

Acetaldehyde Ave.Acetaldehyde Ave.

Acetaldehyde Ave.

Propionaldehyde Ave.

Propionaldehyde Ave.Propionaldehyde Ave.

Propionaldehyde Ave.

Crotonaldehyde Ave.

Crotonaldehyde Ave.Crotonaldehyde Ave.

Crotonaldehyde Ave.

Isobutyraldehyde Ave.

Isobutyraldehyde Ave.Isobutyraldehyde Ave.

Isobutyraldehyde Ave.

n-Nonanal Ave.

n-Nonanal Ave.n-Nonanal Ave.

n-Nonanal Ave.

2-Ethylhexylaldehyde Ave.

2-Ethylhexylaldehyde Ave. 2-Ethylhexylaldehyde Ave.

2-Ethylhexylaldehyde Ave.

Glyoxal Ave.

Glyoxal Ave. Glyoxal Ave.

Glyoxal Ave.

Methyl glyoxal Ave.

Methyl glyoxal Ave. Methyl glyoxal Ave.

Methyl glyoxal Ave.

5% DMSO only Ave.

5% DMSO only Ave. 5% DMSO only Ave.

5% DMSO only Ave.

Water Ave.

Water Ave. Water Ave.

Water Ave.

L u m in e sc e n c e i n te n si ty L u m in e sc e n c e i n te n si ty L u m in e sc e n c e i n te n si ty L u m in e sc e n c e i n te n si ty

time (h) time (h) time (h) time (h)

Fig.2-20

ヤコウタケ切片へのアルデヒド類添加時の発光経時変化

(n=8)

L ig h t in te n s it y ( c o u n ts /s e c ) L ig h t in te n s it y ( c o u n ts /s e c )

(125 mM) (85 mM) (65 mM)

Fig.2-22

ヤコウタケ切片へ添加したアルデヒド類、アルコール類の化学構造式例 O

formaldehyde O

acetoaldehyde

propionaldehyde

crotonaldehyde

isobutyraldehyde O

nonanal O

2-ethylhexylaldehyde O

O glyoxal

O O

methyl glyoxal

OH methanol

HO ethanol

HO isopropanol

2 2 2 2----9 9 9 9----3. 3. 3. 3.

ヤコウタケヤコウタケヤコウタケヤコウタケ発発発光発光光への光へのへのアミンへのアミンアミンアミン類類類類のののの添加添加添加添加

アミン類のヤコウタケ発光への影響を確認するために、各種アミン類を含む水溶液中にヤコウタケ切片を浸すことで、発光への影響を確認した(Fig.2-23)。その結果、全てのアミン類添加物においてヤコウタケ発光の失活が確認された。そのため、

10 mM

のアミン類にはヤコウタケ発光を阻害する効果があるといえる。

2-8

章において塩基性の緩衝液中でのヤコウタケ切片発光測定も行ったが、そちらでは塩基性溶液の発光に対する悪影響はそれほど存在しなかった。それに対して、今回のアミン類を添加した水溶液中での発光測定では発光の失活が顕著に起こった。この結果から、pH変化はヤコウタケ発光に対して余り影響はないが、添加したアミン自体が発光減少効果をヤコウタケ細胞に対して与えているということがわかった。

2 2 2 2----9 9 9 9----4. 4. 4. 4.

ヤコウタケヤコウタケヤコウタケヤコウタケ発光発光発光への発光へのへの添加剤効果への添加剤効果添加剤効果添加剤効果のまとめのまとめのまとめのまとめ

酢酸緩衝液のヤコウタケ発光失活効果に端を発し、各種添加物の影響を今回調査した。

カルボン酸類は、酢酸と構造的に似た物質にヤコウタケ発光失活作用が存在した。長鎖アルキル基を持つカルボン酸類は発光に対する影響があまり存在しなかったが、その理由としてはカルボン酸類が生体内ではありふれた物質であることや、溶解度が低くあまりヤコウタケに吸収されなかった可能性が考えられる。

アルデヒド類とアミン類がヤコウタケ発光を失活させるのは物質そのものに毒性があるためと考えられる。

アルコール類は濃度が低いためか発光低下効果は低かった。しかし、消毒に用いられ

ドキュメント内発光キノコ、ヤコウタケ生物発光機構研究 (ページ 54-64)

Fig.2-16

2 2 2

2----8 8 8 8----3. 3. 3. 3.

pH

pH

(Fig.2-17)

pH

pH

pH

Fig.2-17

pH6

Wavelength (nm)

A rb it ra ry u n it

1.2 1.0 0.8

0.4 0.6

0.2

0 300 400 500 600 700 800

Wavelength (nm)

A rb it ra ry u n it

1.2 1.0 0.8

0.4 0.6

0.2

0 300 400 500 600 700 800

2 2

2 2----9. 9. 9. 9. ヤコウタケ ヤコウタケ発光 ヤコウタケ ヤコウタケ 発光 発光 発光への への への への各種添加物 各種添加物 各種添加物の 各種添加物 の の の効果検証 効果検証 効果検証 効果検証

L-L

Mg

ATP

2 2 2 2----9 9 9 9----1. 1. 1. 1.

5％

DMSO

10 mM

5％DMSO

(Fig.2-19)

TCA

カルボン カルボン カルボン

カルボン酸類添加 酸類添加 酸類添加１ 酸類添加 １ １ １

L ig h t in te n s it y ( c o u n ts / s e c ) L ig h t in te n s it y ( c o u n ts / s e c ) L ig h t in te n s it y ( c o u n ts / s e c ) L ig h t in te n s it y ( c o u n ts / s e c )

カルボン カルボン カルボン

カルボン酸添加 酸添加 酸添加 酸添加２ ２ ２ ２

L ig h t in te n s it y ( c o u n ts / s e c ) L ig h t in te n s it y ( c o u n ts / s e c ) L ig h t in te n s it y ( c o u n ts / s e c ) L ig h t in te n s it y ( c o u n ts / s e c )

Fig.2-18

(n=4)

2 2 2 2----9 9 9 9----2. 2. 2. 2.

10 mM

5％DMSO

(Fig.2-20)

5

(Fig.2-21)

2

(Fig.2-22)

5

L u m in e sc en c e i n te n si ty L u m in e sc en c e i n te n si ty L u m in e sc en c e i n te n si ty L u m in e sc en c e i n te n si ty

Fig.2-21

2-Ethylhexylaldehyde Ave.

2-Ethylhexylaldehyde Ave. 2-Ethylhexylaldehyde Ave.

2-Ethylhexylaldehyde Ave.

Glyoxal Ave.

Glyoxal Ave. Glyoxal Ave.

Glyoxal Ave.

Methyl glyoxal Ave.

Methyl glyoxal Ave. Methyl glyoxal Ave.

Methyl glyoxal Ave.

5% DMSO only Ave.

5% DMSO only Ave. 5% DMSO only Ave.

5% DMSO only Ave.

Water Ave.

Water Ave. Water Ave.

Water Ave.

L u m in e sc e n c e i n te n si ty L u m in e sc e n c e i n te n si ty L u m in e sc e n c e i n te n si ty L u m in e sc e n c e i n te n si ty

Fig.2-20

(n=8)

L ig h t in te n s it y ( c o u n ts /s e c ) L ig h t in te n s it y ( c o u n ts /s e c )

Fig.2-22

2 2 2 2----9 9 9 9----3. 3. 3. 3.

10 mM

2-8

2 2 2 2----9 9 9 9----4. 4. 4. 4.

2 2----9. 9. 9. 9. ヤコウタケヤコウタケ発光ヤコウタケヤコウタケ発光発光発光へのへのへのへの各種添加物各種添加物各種添加物の各種添加物ののの効果検証効果検証効果検証効果検証

カルボンカルボンカルボン

カルボン酸類添加酸類添加酸類添加１酸類添加１１１

カルボンカルボンカルボン

カルボン酸添加酸添加酸添加酸添加２２２２