ｍlを加えて混和し，３７℃で４１０，ｍにおける吸光度の差の変化を記録した。別に，ｐ‐

nitroaniline標準液を用いて検量線を作成した。酵素活性は，別に測定したタンパク質量を

加算して，タンパク質1ｍｇ当たりの国際単位(IU)で表示した。

８．タンパク質の測定

測定はLowryらの方法95)に従って行った。試料（適当な濃度に希釈したホモジネートあ

るいは血紫）0.1ｍlにｌＮＮａＯＨＯ５ｍｌを加えて30分間放置し，銅試液５ｍlを加えて,0分間 放置した。次に，希釈フェノール試液0.5ｍlを加えて30分間放置し，750,ｍにおける吸光 度を測定した。別に，アルブミン標準液を用いて検量線を作成した。

3章に関する実験

1．飼料および実験動物

タンパク質含量の異なる２種類の精製飼料（ＬＰＤおよびＮＰＤ）は２章の１と同じも のを使用した。ＡＳＤはＮＰＤの含硫アミノ酸含量と同じになるようにＬＰＤにＬ−メチ オニンおよびＬ−シスチンを添加して調製した。雄性のC57BL/6Nマウス（7週令）を5日間 それぞれの飼料で飼育して実験に用いた。

2．ＭｅＨｇｌ回投与24時間後の水銀動態

１）MeHgの投与

マウスにMeHg投与液（0.4ｍｇＨｇ/ml）を0.2ｍl/20ｇ体重となるように経口投与した（２０ Umol/kg)。

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２）糞，尿の採取および組織の摘出

マウスはMeHg投与後は代謝ケージで飼育し（１匹／ケージ)，投与の24時間後に糞と 尿を分離して採取し，２章の２の２）と同様の方法で組織を摘出した。

３）水銀の測定

２章の３と同様の方法で行った。

３．水銀の組織移行

マウスにMeHg‑アルブミン投与液(0.08ｍｇＨｇ/ml）を0.2ｍl/20ｇ体重となるように静脈 内投与し（４Umol/kg)，投与の５および60分後に２章の２の２）と同様の方法で組織を摘 出した。組織の水銀蓄積量は２章の３と同様の方法で測定した。

４．ＭｅＨｇｌ回投与2時間後の血紫の水銀分布

マウスにＭｅＨｇ投与液（0.4ｍｇＨｇ/ml）を０．２ｍl/20ｇ体重となるように経口投与し（２０ Umol/kg)，投与の２時間後に２章の４と同様の方法で血紫を得た。血紫200UlをＹＭＴメ

ンブレンフィルター（アミコン社製）を用いて直ちに限外浦過（5000×9,4分間）し，得ら れた漁液(低分子分画）および全血紫中の水銀濃度を２章の３と同様の方法で測定した。

５．血紫および尿中の低分子チオール化合物の測定 １）血紫の低分子チオール化合物

２章の４と同様の方法で血紫を得た。血紫は直ちに5％過塩素酸（１，ＭＥＤＴＡ含有）

と等量混合し，遠心分離(7000×9,5分間)後，上清を分取して反応に用いた。

チオール基のラベル化はToyookaとImaiの方法9 )に従って行った。上清2001Ａ１に２５Ｍ

ホウ酸緩衝液（４，ＭＥＤＴＡ含有,ｐＨ10.5）200皿，ＳＢＤ−Ｆ試液lOOUlを加えて，

60℃で1時間反応させた。氷冷後，６NHCllOOUlを加え，緩衝液Ａ（血紫用）で適当な濃 度に希釈して測定に用いた。測定は高速液体クロマトグラフを用いて行い，ピーク高さか

ら定量した。別に，標準液を用いて検量線を作成した。

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測 定 条 件

カラム：ウオーターズ社製RadialPackC‑18

移動相：移動相Ａ（血紫用）および移動相Ｂ（血紫用）を用いて，グラジェント 溶出を行った（20分)。

流速：１ｍl/mｉｎ 測定波長：515,ｍ 励起波長：385,ｍ

２）尿中の低分子チオール化合物

尿を採取後直ちに5％過塩素酸(１，ＭＥＤＴＡ含有）と等量混合し，遠心分離(7000×9,

5分間）後，上清を分取して反応に用いた。

チオール基のラベル化はToyookaとImaiの方法96)に従って行った。上清l00Ulに2.5Ｍ ホウ酸緩衝液(４，ＭＥＤＴＡ含有,ｐＨ10.5）lOOUl，ＳＢＤ−Ｆ試液50Ulを加えて，６０℃

で１時間反応させた。氷冷後，６ＮＨＣｌ５０Ｕ１を加え，緩衝液Ａ（尿用）で適当な濃度に希 釈して測定に用いた。測定は高速液体クロマトグラフを用いて行い，ピーク高さから定量 した。別に，標準液ＩおよびIIを用いて検量線を作成した。ただし，標準液IIはＴＢＰ試 液10ulを加えて反応を行った。

測定条件

カラム：HiberLiChroCART250‑4LiCHrospherlOOCica戸MerckRP‑l8(e)(5Um）

移動相：７５，Ｍクエン酸緩衝液(ｐＨ2.75)‑4％メタノール 流速：１ｍl/mｉｎ

測定波長：515,ｍ 励起波長：385,ｍ

６．MeHgと血紫アルブミンの親和性

２章の４と同様の方法で得た血紫2001』lに直ちにMeHg‑システイン溶液２ulを加えて 混和し,４分間放置した。この溶液を３章の４と同様の方法で限外漁過（5000×9,4分間）

し，得られた漁液（低分子分画）および漁過前の混合液中の水銀濃度を２章の３と同様の 方法で測定した。親和性は低分子分画の割合で表示した。

7．血紫のアルブミンおよび総タンパク質の測定

３章の６で得た血紫の一部を精製水で適当な濃度に希釈して測定に用いた。

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１）アルブミン

測定は高速液体クロマトグラフを用いて行い76)，ピーク高さから定量した。別に，アル ブミン標準液を用いて検量線を作成した。

測 定 条 件

カラム：東ソー社製TSKG3000SW

移動相：５０，Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ7.38）

流速：0.5ｍl/mｉｎ 測定波長：220,ｍ ２）総タンパク質

２章の８と同様の方法で測定した。

８．中性アミノ酸の脳内移行

マウスにＬ−['4Ｃ(U)]‑フエニルアラニン投与液を0.2ｍl/20ｇ体重となるように尾静脈か ら投与した（1.85ＭＢq/kg)。投与の60分後に，ペントバルビタール麻酔下で，生理食塩水 を用いて心臓から全身還流して血液を除去した後，脳を摘出した。組織溶解剤（ソルエン ー350,パッカード社製）４ｍlを加え，６０℃に加温して脳を溶解した後，液シン用カクテル 剤(ハイオニックフロー,パッカード社製）１０mlを加えて放射活性を測定した。

４ 章 に 関 す る 実 験

1．飼料および実験動物

３章の１と同じものを使用した。

２．MeHg反復投与時の死亡率，運動障害および体重

１）MeHgおよび生理食塩水の投与

マウスにMeHg投与液(0.4ｍｇＨｇ/ml）をＯ２ｍｌ/20ｇ体重/日となるように毎日経口投与し た（2oUmol/kg/日)。コントロール群には生理食塩水を投与した（loml/kg/日)。

２）動物の処置

マウスが死亡するまでMeHgの投与を続け，死亡率の変化を調べた。同時に，中枢障害 の指標として運動障害の発現率を調べ，体重の変化を記録した。

３．MeHg反復投与時の水銀動態の変化

１）MeHgおよび生理食塩水の投与 ４章の２の１）と同様の方法で行った。

２）糞，尿の採取および組織の摘出

マウスはMeHgの最初の投与直後から代謝ケージで飼育した（１匹／ケージ)。最初の 投与の１日後から１日おきに糞と尿を分離して採取した。ＮＰＤ群は1,4,7,10,14,19,23

日後に，ＬＰＤ群は1,4,7,10,14日後に，ＡＳＤ群は１，４，７，１０日後に，２章の２の２）

と同様の方法で組織を摘出した。

４．水銀の測定

１）総水銀

２章の３と同様の方法で測定した。なお，水銀排池量は体内に残存する水銀に対する排 世された水銀の割合で表示した。

２）無機水銀

測定はYasutakeとHirayamaの方法97)に従って行った。まず，ホモジネート500Ulに６N

HCl200ulを加えて酸性にした。次に，適当量のベンゼンを加えて５分間振鐙しぃ遠心分 離（8000×9,5分間）後，ベンゼン層を吸引除去した。このMeHgの抽出除去操作を５回繰 り返した後，石油エーテルを用いて残余のベンゼンを除去した。水層と1.71ＮＮａＯＨを等 量混和して中和した後，必要に応じて適当な濃度に希釈して測定に用いた。試料中の水銀 は酸化燃焼一金アマルガム法９１)で測定し，無機水銀の濃度，投与量に対する割合あるいは 総水銀に対する割合で表示した。

５．血紫の低分子分画の水銀

４章の３の２）で得た血擬の一部（５０ul）をセントリカット超ミニＷ−５０（分画分子 量50000,クラボウ社製）を用いて直ちに限外浦過(5000×9,4分間）し，得られた漁液(低 分子分画)および全血紫中の水銀濃度を２章の３と同様の方法で測定した。

６．腎障害の指標

４章の３の２）で得た血紫の一部をＢＵＮおよびクレアチニンの測定に用いた。

１）ＢＵＮ

測定は和光純薬社製尿素窒素測定キット尿素窒素一テストワコー（ジアセチルモノオ

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キシム法)98)を用いて行った。血紫２０ulに発色試液（45％リン酸‑0.6％ジアセチルモノオ

キシム溶液ｌ：５混液,用時調製）５ｍlを加えて，沸騰水浴中で25分間加熱した。冷水中で 冷却後，530,ｍにおける吸光度を測定した。別に，尿素窒素標準液(50ｍｇ/dl）を用いて検 量線を作成した。

２ ） ク レ ア チ ニ ン

測定はカイノス社製クレアチニン測定キットＣＲＥ−ＥＮカイノス（酵素的測定法)99）

を用いて行った。血紫５０ulに反応試薬Ｉ（クレアチナーゼ４０単位/ml,ザルコシンオキシ ダーゼ3.6単位/m1,用時調製）１ｍlを加えて，３７℃で10分間反応させた。次に，反応試薬 IＩ（クレアチニナーゼ５０単位/m1,4‑アミノアンチピリン0.244ｍｇ/m1,用時調製）１ｍlを加 えて，３７℃で20分間反応させ，５１５，ｍにおける吸光度を測定した。別に，クレアチニン 標準液(5ｍｇ/dl）を用いて検量線を作成した。

5章に関する実験

1．飼料および実験動物

2章の１と同じものを使用した。

２．ＭｅＨｇｌ回投与後の生存率および体重

１）MeHgおよび生理食塩水の投与

マウスにMeHg投与液(0.8,1.6あるいは2.4ｍｇHg/ml）を0.2ｍl/20ｇ体重となるように経 口投与した（40,80あるいはl20Umol/kg)。コントロール群には生理食塩水を投与した（１０ ml/kg)。

２）動物の処置

マウスはMeHg投与の40日後まで個別ケージで飼育し（１匹／ケージ)，生存率の変化 を調べ，体重の変化を記録した。

３．ＭｅＨｇｌ回投与24時間後の水銀動態

１）MeHgおよび生理食塩水の投与 ５章の２の１）と同様の方法で行った。

２）糞，尿の採取および組織の摘出

マウスはMeHg投与後は代謝ケージで飼育し（１匹／ケージ)，投与の24時間後に糞と

尿を分離して採取し，２章の２の２）と同様の方法で組織を摘出した。

３）水銀の測定

総水銀および無機水銀はそれぞれ２章の３および４章の４の２）と同様の方法で測定し た。

▽

４．組織障害の指標

５章の３の２）で得た血紫の一部を，腎障害の指標であるクレアチニンおよび肝障害の 指標であるＡＳＴ，ＡＬＴ活性の測定に用いた。

１）クレアチニン

４章の６の２）と同様の方法で行った。

２）ＡＳＴおよびＡＬＴ活性

測定は和光純薬社製トランスアミナーゼ測定キットエス・ティエーテストワコー (Reitman‑Frankel法)'00>を用いて行った。ＡＳＴ基質液（2ｍＭａ−ケトグルタル酸,200ｍＭ Ｌ−アスパラギン酸）あるいはＡＬＴ基質液（2ｍＭａ−ケトグルタル酸,200ｍＭＤＬ−アラニ ン）2501』』（あるいは500皿）を37℃で２〜3分加温し，試料(血紫あるいは血清）501』１（あ るいは100Ul）を加えて37℃でＡＳＴは１時間，ＡＬＴは30分間反応させた。その後，発

色試液（１，Ｍ2,4‑ジニトロフエニルヒドラジン）250ul（あるいは500ul）を加えて室温で

20分間放置し，用時調製したO4NNaOH溶液２５ｍ'（あるいはＳｍl）を加えて混和し，５０５

，ｍにおける吸光度を測定した。別に，２，Ｍピルビン酸リチウム標準液を用いて検量線を 作成した。なお，酵素活性は血紫１１当たりの国際単位(IU)で表示した。

5．塩化第二水銀の肝臓に対する影響

マウス（ＮＰＤ群）に塩化第二水銀投与液を0.2ｍl/209体重となるように皮下投与した (2.5ｍｇＨｇ/kg)。コントロール群には生理食塩水を投与した（10ｍl/kg)。投与の24時間後 に２章の２の２）と同様の方法で血紫を分離し，肝臓を摘出した。肝臓の水銀濃度を２章 の３と同様の方法で測定し，血擬のＡＳＴおよびＡＬＴ活性を５章の４の２）と同様の方 法で測定した。

６章に関する実験

1．飼料および実験動物

コントロール飼料はＣＥ−２（日本クレア社製）を用いた。鉄含有飼料はＣＥ−２にフ マル酸鉄（II）を3.5％加えて調製した。雄性のWistar系ラット（9週令）をコントロール飼

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