第 2 章 アサナ心材の皮膚老化抑制作用
第 2 節 アサナ心材および oxyresveratrol の melanin 生成抑制作用 および抗酸化作用
I． 緒 言
本章第1節において，PM-extのtyrosinase阻害作用を確認し，その有効成分のひ とつが3 であることを確認した．さらに，比較対象として用いた1，2 および5は試 験した濃度で阻害作用が認められなかったが，3のみにtyrosinase阻害作用が認めら れたので，試験した化合物の中で最も高いtyrosinase阻害作用を示すことを確認した．
よって，PM-extおよび3は細胞によるmelanin産生にも抑制作用が期待できる．
また，dopaquinoneからmelaninへの重合は自動酸化が主要因であり，tyrosinase 阻害作用に抗酸化作用を併せ持つ素材は美白素材としてより有用である．そこで本節 では，PM-extおよび3のマウス由来B16メラノーマ細胞におけるmelanin産生の抑 制作用試験および抗酸化作用の汎用試験である DPPH ラジカル捕捉作用試験を検証 した．加えて，AGEs は活性酸素種の生成に寄与することで自動酸化を促し，RAGE
を介してmelaninの生合成を促進することが知られているため，抗酸化作用の指標と
してAGEs生成抑制作用についても検証した12, 35, 36)．
II．実験方法
1．実験材料および被検体の調製
PM-ext は本章第1節にて記したものを用いた．化合物 3および5 は東京化成工業
より購入したものを用いた．
2．試薬
試薬は，[Nle4, D-Phe7]-α-melanocyte stimulating hormone trifluoroacetate salt（α -MSH）およびsynthetic melaninはシグマアルドリッチジャパンから，fetal bovine serum（FBS）はニチレイバイオサイエンスから，protease inhibitor mixture は
スクから購入した．
4．B16メラノーマ細胞を用いたmelanin産生抑制作用試験 4-1) 細胞
2017年2月に大日本住友製薬より購入したB16メラノーマ細胞（細胞株：B16F1） を用いた．B16 メラノーマ細胞は 10% v/v FBS および 1% antibiotic-antimycotic
（10,000 U/mL penicillin，10,000 µg/mL streptomycin sulfate，25 µg/mL amphotericine B 含有，Invitrogen）を加えた Dulbecco’s modified Eagle medium
（DMEM）を用いて，37 ºC，5% CO2下で培養した．
4-2) Melanin産生抑制作用試験
B16メラノーマ細胞における細胞内melanin量の測定はOhguchi らの方法37)に準 じて行った．継代回数6回のB16メラノーマ細胞（2 × 104 cells/800 µL）をプレート
（24 wells）に播種し，37ºC，5% CO2下にて24 hr培養した．被検体はDMSOに溶 解し，DMSOの最終濃度が 0.1% v/vとなるようにDMEMで所定の濃度に希釈した 溶液を被検液とした．陽性対照薬には kojic acid を用いた．Control および Vehicle control群には0.1% v/v DMSO/DMEMを用いた．α -MSHは5% v/v acetic acid水溶 液に溶解し，DMEMで最終濃度が1 µMとなるように希釈した．培養24 hr後，被検 液 100 µLおよびα -MSH 100 µLを添加した．Melanin産生刺激剤であるα -MSH は Vehicle control 群および被検体群に添加し，Control 群には phosphate buffered
saline（PBS）を添加した．この混合液を37ºC，72 hr培養した．培養後，B16メラ
ノーマ細胞を1 mLのPBSで2回洗浄した後，2 M sodium hydroxide水溶液で溶解 した．この溶液について，マイクロプレートリーダーを用いて490 nmにおけるOD を測定し，synthetic melaninを用いて作製した検量線からmelanin量を算出した．
細胞内melanin量はµg/wellで表した．
4-3) 細胞増殖の評価
B16 メ ラ ノ ー マ 細 胞 の 細 胞 増 殖 率 は 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, mono sodium salt（WST-8）
を含んだTetraColor One（生化学工業）を用いて評価した38)．被検体はDMSOに溶 解し，DMSOの最終濃度が 0.1% v/vとなるようにDMEMで所定の濃度に希釈した 溶液を被検液とした．Control群には0.1% v/v DMSO/DMEMを用いた．プレート（96 wells）にB16メラノーマ細胞（2.8 × 103 cells/well/80 µL DMEM）を播種し，37ºC，
5% CO2下にて24 hr培養した．その後，被検液 10 µLおよび最終濃度が1 µMとな るように調製したα -MSH 10 µLをプレートに添加し，37ºC，5% CO2下にて4日間 培養した．培養後，WST-8を含んだ培地（10% WST-8/DMEM）100 µLに置換し，
その4 hr後の450 nmにおけるformazanのODを測定した．被検体群の増殖率は Control群のODを増殖率100%としたときの百分率（%）で表した．
5．DPPHラジカル捕捉作用試験
DPPHラジカル捕捉作用試験はBloisの方法39)に準じた．被検体はDMSOに溶解 し，DMSOの最終濃度が5% v/vとなるように0.5 M acetate 緩衝液（0.5 M sodium acetate，acetic acidを用いてpH 5.5に調製）で所定の濃度に希釈した溶液を被検液 とした．陽性対照薬にはL-ascorbic acidを用いた．0.5 M acetate 緩衝液 16 µL，EtOH 64 µLおよび被検液 100 µLを加えて混合した．これに0.5 mM DPPH溶液（EtOH
に溶解） 20 µLを加え混合した．この混合液を30 min室温放置後，マイクロプレー
トリーダーを用いて520 nmにおけるODを測定した．なお，被検体のDPPHラジカ ル捕捉作用は，被検体添加群のODをControl群のODと比較した際の百分率（%） で記した．
6．AGEs生成抑制作用試験
AGEs生成抑制作用試験はShimodaらおよびItohらの方法を改変して行った40, 41)． 被検体は DMSO に溶解し，DMSO の最終濃度が 1% v/v となるように 0.2 M potassium-sodium phosphate緩衝液（0.2 M potassium dihydrogenphosphate水溶 液，0.2 M sodium hydroxide水溶液，pH 7.2に調製）で希釈した溶液を被検液とし た．陽性対照薬にはaminoguanidine hydrochlorideを用いた．試験液はbovine serum albumin（BSA）を1% w/vとなるように0.2 M potassium-sodium phosphate緩衝 液で溶解し，試験直前に氷冷下で10% w/vとなるようにD-glucoseを加えて調製した．
プラスティックチューブに試験液 900 µLおよび被検液100 µLを添加し，60ºC，遮 光下で 48 hr インキュベートした．Control 群の blank は試験液 900 µL に 1%
DMSO/potassium phosphate緩衝液 100 µLを添加し，4ºC，遮光下で48 hrインキュ ベートした．黒色プレートに反応液 160 µLをそれぞれ移し，370 nmの励起光によ る460 nmにおける蛍光強度 F をマイクロプレートリーダー（2030 ARVO X4, パー キンエルマージャパン）を用いて測定した．AGEs 生成抑制率の算出は以下の方法で 行った．
[抑制率%] = [ (Fcontrol-Fnormal) - (Fsample-Fsample blank) ] / (Fcontrol-Fnormal) × 100
Fcontrol：試験液添加，被検液非添加群の反応液の蛍光強度，Fnormal：試験液添加，
被検液非添加，非インキュベート群の反応液の蛍光強度，Fsample：試験液および被検 液添加群の反応液の蛍光強度，Fsample blank：試験液非添加，被検液添加群の反応液の 蛍光強度．
4．統計処理
第1章第2節に記した方法で実施した．
III．実験結果
1．B16メラノーマ細胞におけるmelanin産生抑制作用
PM-ext の B16 メラノーマ細胞における melanin 産生抑制試験を検証した結果，
Table 10に示したごとく，5.0，10，20および50 µg/mLで細胞毒性を示すことなく，
それぞれ24，45，53および69%の産生抑制作用を示した．
Table 10 Effects of PM-ext on Melanin Content in Cultured B16 Murine Melanoma Cells.
Samples Concentration (µg/mL or µM)
Melanin content (µg/well)
Suppresion (%)
Cell proliferation
(%)
Control - 5.0 ± 0.76 - 57.1 ± 8.9
Vehicle control - 33.3 ± 1.53## - 100.0 ± 2.9##
PM-ext 5.0 µg/mL 26.7 ± 1.32** 69 94.7 ± 2.0
10 20.7 ± 1.80** 90 93.7 ± 2.0
20 18.3 ± 1.61** 24 94.0 ± 3.3
50 13.7 ± 1.32** 45 91.5 ± 2.4
Kojic acid 100 µM 13.8 ± 1.04** 53 101.3 ± 2.4
200 7.8 ± 1.53** 69 98.4 ± 3.9
Each value in melanin content represents the mean ± S.D. of triplicates. Significantly different from the control group, ##: p < 0.01. Significantly different from the vehicle control group, **: p
<0.01. Each value for cell proliferation represents the mean ± S.D. of triplicates.
次に，1，2，3，および5のB16メラノーマ細胞におけるmelanin産生抑制作用を 検証した結果，Table 11に示したごとく，3は2.0，10および20 µMで細胞毒性を示 すことなく 38，74および83%の抑制作用を示し，試験した化合物の中で最も高い作 用を示した．
Table 11 Effects of Pterostilbene (1), Resveratrol (2), Oxyresveratrol (3) and Piceatannol (5) on Melanin Content in Cultured B16 Murine Melanoma Cells.
Samples Concentration (µM)
Melanin content (µg/well)
Suppresion (%)
Cell proliferation
(%)
Control - 4.5 ± 1.04 - 69.7 ± 4.72
Vehicle control - 38.8 ± 1.89## - 100.0 ± 2.07##
1 2.0 30.0 ± 3.06** 26 99.8 ± 0.93
10 14.5 ± 0.76** 71 86.9 ± 8.74**
20 12.0 ± 0.76** 78 73.9 ± 4.64**
2 2.0 32.0 ± 1.53** 20 99.1 ± 1.34
10 24.8 ± 1.04** 41 100.8 ± 1.10
20 19.3 ± 1.04** 57 96.5 ± 2.34
3 2.0 25.8 ± 1.61** 38 100.3 ± 1.93
10 13.5 ± 0.76** 74 101.4 ± 1.52
20 10.2 ± 1.73** 83 99.4 ± 2.37
5 2.0 38.0 ± 0.58 2.4 98.6 ± 2.64
10 36.2 ± 0.50 7.8 98.2 ± 2.17
20 32.8 ± 0.29** 17 100.4 ± 2.99
Kojic acid 100 19.3 ± 1.04** 57 100.6 ± 0.73
200 10.7 ± 1.32** 82 99.5 ± 1.08
Each value in melanin content represents the mean ± S.D. of triplicates. Significantly different from the control group, ##: p < 0.01. Significantly different from the vehicle control group, **: p <
しかしながら，1は2.0，10および20 µMでそれぞれ26，71および79%と高い抑 制作用を示したが，10および20 µMで細胞の増殖をそれぞれ13および26%抑制し たことから細胞毒性が認められた．一方で，2は同濃度で細胞毒性を示すことなく20，
41および57%の抑制作用が認められた．化合物5は20 µMで18%とわずかに抑制作 用が認められた．
2．DPPHラジカル捕捉作用
PM-ext の DPPH ラジカル捕捉作用を検証した結果，10，20および 50 µg/mLで 16，33および73%の捕捉作用が認められた（Table 12）．
Table 12 Radical-Scavenging Activity of PM-ext.
Samples Concentration
(µg/mL or µM) OD (× 103) Radical scavenging activity (%)
Control - 775 ± 20.0 -
PM-ext 10 µg/mL 655 ± 19.5** 16
20 517 ± 4.4** 33
50 208 ± 4.0** 73
Ascorbic acid 10 µM 662 ± 55.5** 15
20 533 ± 12.1** 31
50 126 ± 15.0** 84
Each value represents the mean ± S.D. of triplicates. Significantly different from the control group,
**: p < 0.01. OD: Optical densiy at 520 nm.
次に，1，2，3 および5のDPPHラジカル捕捉作用を検証した結果，5は10，20 および50 µMでそれぞれ19，36および69%の捕捉作用が認められ，3は同濃度でそ れぞれ19，31および59%の捕捉作用を示した（Table 13）．化合物2は同濃度でそれ ぞれ28，38および47%の捕捉作用が認められ，1は同濃度でそれぞれ10，15および 31%の捕捉作用が認められた．
Table 13 Radical-Scavenging Activities of Pterostilbene (1), Resveratrol (2), Oxyresveratrol (3) and Piceatannol (5).
Samples Concentration
(µM) OD (× 103) Radical scavenging activity (%)
Control - 756 ± 27.7 -
1 10 681 ± 18.7** 10
20 645 ± 7.0** 15
50 526 ± 20.9** 31
2 10 541 ± 8.4** 28
20 469 ± 9.6** 38
50 400 ± 18.0** 47
3 10 611 ± 10.1** 19
20 522 ± 33.0** 31
50 311 ± 11.0** 59
5 10 612 ± 11.5** 19
20 486 ± 7.2** 36
50 236 ± 9.1** 69
Ascorbic acid 10 614 ± 17.1** 19
20 519 ± 9.0** 31
50 208 ± 8.5** 73
Each value represents the mean ± S.D. of triplicates. Significantly different from the control group,
**: p < 0.01. OD: Optical densiy at 520 nm.
3．AGEs生成抑制作用
PM-extのAGEs生成抑制作用を検証した結果，3.1，12.5および50 µg/mLでそれ ぞれ29，48および80%の抑制作用を示した（Table 14）．
Table 14 Suppressive Activity of PM-ext on AGEs Production.
Samples Concentration
(µg/mL or mM) Fluorescence Inhibition (%)
Control - 39243 ± 3914 -
PM-ext 3.1 µg/mL 27720 ± 73* 29
12.5 20282 ± 392** 48
50 7723 ± 4113** 80
Aminoguanidine 0.30 mM 28374 ± 94* 34
10 22661 ± 141** 47
30 12935 ± 454** 70
Fluorescence wavelength at 460 nm and excitation wavelength at 370 nm were measured. Each value represents the mean ± S.D. of triplicates. Significantly different from the control group, **: p
< 0.01, *: p < 0.05.
次に，1，2，3および5のAGEs生成抑制作用を検証した結果，3は10，50およ び100 µM で32，47および55%の抑制作用が認められた（Table 15）．化合物5は 10および50 µMでそれぞれ37および47%の抑制作用が認められ，100 µMで抑制作 用が認められなかった．化合物2は10，50および100 µMでそれぞれ34，41および 48%の抑制作用が認められた．化合物1は10および50 µMで27および20%の抑制 作用が認められ，100 µMでは抑制作用が認められなかった．
Table 15 Suppressive Activities of Pterostilbene (1), Resveratrol (2), Oxyresveratrol (3) and Piceatannol (5) on AGEs Production.
Samples Concentration
(µM or mM) Fluorescence Inhibition (%)
Control - 40378 ± 4329 -
1 10.30 µM 29477 ± 2190** 27
50 32230 ± 3273** 20
100 41232 ± 1779 -2.1
2 10 26630 ± 1588** 34
50 23959 ± 1961** 41
100 21049 ± 1588** 48
3 10 27400 ± 667** 32
50 21504 ± 2482** 47
100 18461 ± 624** 55
5 10 25549 ± 1254** 37
50 21459 ± 2017** 47
100 36654 ± 2310 9.2
Aminoguanidine 0.30 mM 22497 ± 1943** 44
10 17146 ± 1613** 58
30 7555 ± 567** 81
Fluorescence wavelength at 460 nm and excitation wavelength at 370 nm was measured. Each value represents the mean ± S.D. of triplicates. Significantly different from the control group, **: p
< 0.01.
IV．考察および小括
本第2節では，第1節において，PM-extのtyrosinase阻害作用を確認し，その有 効成分のひとつとして3を確認したことから，PM-extおよび3のマウス由来B16メ ラノーマ細胞における melanin 産生抑制作用およびDPPH ラジカル捕捉作用を検証 した．加えて，AGEs が活性酸素種の生成に寄与することで自動酸化を促し，RAGE
を介してmelaninの生合成を促進することが報告されていることから，AGEs生成抑
制作用についても検証した．
PM-ext のB16 メラノーマ細胞におけるmelanin産生抑制作用を検証したところ，
その作用が確認されたので，1，2，3および5のmelanin産生抑制作用を比較検証し た．その結果，3 に2.0，10 および20 µM で細胞毒性を示すことなくそれぞれ38， 74 および 84%と，最も高い抑制作用が認められた．化合物 1 は高い作用が認められ たが，10および20 µMで細胞毒性を示した．化合物2は2.0，10および20 µMで細
害作用は認められなかった．他の研究ではB16メラノーマ細胞において，3 µMで明
らかなmelanin産生抑制作用が報告されており，tyrosinaseに対して弱いながらに阻
害作用が報告されている42)．これらの結果は2がtyrosinaseを阻害することなくB16 メラノーマ細胞におけるmelanin産生を抑制することを示している．また，3はkojic
acidより10倍高いmelanin産生抑制作用を示すことを明らかにした．
自動酸化がmelaninの生合成において主要因のひとつであることから，美白剤にお いて抗酸化作用は重要である35)．そこで，PM-extおよび1，2，3および5の抗酸化 作用をDPPHラジカル捕捉作用およびAGEs生成抑制作用を指標に検証した．
PM-extのDPPHラジカル捕捉作用を検証したところ，その作用が確認されたので，
1，2，3および5のDPPHラジカル捕捉作用を比較検証した．その結果，3および5
は50 µMでそれぞれ59および69%のDPPHラジカル捕捉作用が認められた．一方
で，1 および2は同濃度で31および47%のDPPH ラジカル捕捉作用が認められた．
化合物2のC-4’位の水酸基はラジカル捕捉作用に重要であることがすでに報告されて いる43)．本研究で試験した4種stilbenoidはC-4’位に水酸基を持ち，異なる作用を示 したことから，他の構造がDPPHラジカル捕捉作用に重要であることを示している．
AGEsは活性酸素種の生成に関与し，AGEs受容体に結合することでmelaninの生 合成の促進に関与することが報告されている36)．それゆえに，AGEsの生成抑制は皮 膚老化予防に重要である．PM-ext の AGEs 生成抑制作用を検証したところ，その作 用が確認されたので，1，2，3および5のAGEs生成抑制作用を検証した．その結果，
いずれの化合物も10および50 µMで抑制作用を示し，その中でも，3は100 µMで
55%と最も高い抑制作用を示した．興味深いことに，5は100 µMで抑制作用が消失
し，1は100 µMで減弱した．これらの化合物の抑制作用には至適濃度の存在が示唆
された．