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いた。He 菌体に対してイオンポンプ活性を測ると、He 菌体膜小胞と同じ結果が 得られた (図 4.1)。その結果についてのいくつかの可能性を検討した。 1). 作 られた菌体膜小胞のプロトン伝導性 (proton conductance)が高いため、HeHR 由 来の pH 変化がHeAR 由来の pH 変化より強く見られたと考えられた。He と Hs の 菌体膜小胞を作製して、3M NaNO3 溶液に光で照射してイオンポンプ活性を測定 した。菌体膜小胞のプロトン伝導性は pH 回復曲線の変化直を単一指数方程式に よってフィッティングして得られた。その結果、菌体膜小胞のプロトン伝導性 は一緒だった。2). HeAR のプロトンポンプ活性 (ion-pumping efficiency)がHeHR の内向きクロライドイオンポンプ活性より弱いと考えた。HeAR と BR のプロトン ポンプ活性 (ion-pumping efficiency)を比較するため、He と Hs 菌体膜小胞を 3M NaNO3の溶液に懸濁して、イオンポンプ活性を測った結果、その活性比は BR : HeAR = 1 : 0.86 ことが分かった。HeHR のイオンポンプ活性を測るには HeHR を 発現精製する必要があるため、今の段階では分からない。3). mRNA の量はタン パク質発現量と一致すると言えないため、実際の菌体で存在している HeHR は HeAR より多い可能性もあると考えられる。
以上の結果より、He 菌体膜小胞から HeAR 由来の外向きプロトンポンプ活性と HeHR 由来の内向きクロライドイオンポンプ活性を見出したと結論した。
HeCM の光反応サイクルより BR（HeAR）の M-like 中間体を見出した。また、
クロライドイオンの有無による測定結果の比較から、HeHR 由来の N/L 中間体の 変化を見出した。つまり、HeCM に HeAR と HeHR がふくまれ、それぞれの光反応 サイクルを行っていることを明らかにした。
本論文第二章の研究は He の菌体膜小胞や菌体膜など、３種のロドプシン類 タンパク質が混在した状態で進められたため、結果の解析が複雑だった。そこ で、第三章では、He の３種類のロドプシン類（ HeAR, HeHR, HeSRII）タンパク
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質を大腸菌を用いて発現精製し、一種だけにして、その機能を調べることにし た。
３種類のロドプシン類をの発現精製を試みたところ、ただ、HeAR のみが発現 精製出来た。精製したHeAR の吸収スペクトルを取ると吸収極大は 555nm でした。
精製したHeAR と HeＣM の光反応サイクルを比較した結果、HeCM の M 中間体の 生成崩壊時間と精製したHeAR の M 中間体の生成崩壊時間とが一致していた。つ まり、菌体膜 HeCM で M 中間体と判断していたが、確かに HeAR 由来の M 中間 体であることが示された。また、この結果は HeCM 中の AR と 0.15％界面活性 剤中の AR とで光反応に大きな差のない事を示している。精製した HeAR の全体 の光反応を同じくプロトンポンプである BR 光反応と比較するとかなり遅くな っている。精製したHeAR の光反応サイクルでは、まず、HeAR から K へ移動、そ の後 K から M、M から短波長の中間体と N/O 混合中間体へ移動、最後に短波長の 中間体と N/O 中間体から元のHeAR に戻っていると考えられた。
HeAR 遺伝子をもつ大腸菌を用いてその光駆動ポンプ活性を測ったところ、
HeAR は大腸菌膜でも He の菌体膜と同様に配向し、光によってプロトンを菌体内 部から外部へポンプしていることを明らかにした。つまり、HeAR は BR と同様に 単一のタンパク質で光駆動プロトンポンプとして働くことを示した。
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図 4.1 : He菌に対するイオンポンプ活性。赤バーは光 (590 ± 8.5 nm) を当てた時間である。菌体を 3M NaCl 溶液(a)と 3M NaNO3溶液に懸濁 して測定を行った。
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謝辞
本論文は著者が室蘭工業大学 大学院工学研究科 創成機能工学専攻 博士 後期課程に在学中の研究成果をまとめたものです。
指導教官である岩佐達郎教授には私が室蘭工業大学の研究生、修士課程に入 学した際から、約 6 年に渡りお世話になってまいりました。留学生の私に日本 語、英語論文の書き方をご指導いただくことや、研究内容・考察について鋭い ご指摘をいただくことが何度もありました。特に博士の間は休日であるにも関 わらず、私に実験を指導するか私との研究議論に多くのお時間を割いていただ きました。深夜まで時間と戦って論文を直したこと、厚意により様々な発表の 機会を与えて頂いたこと、留学生活までに助けたことにつきましての深く感謝 致します。
現勤務先である中国内モンゴル師範大・環境化学の代鋼講師には、マイクロ バイアルロドプシン類タンパク質実験手法などに関して、多くのご助言をいた だきました。私がロドプシンの研究を始めたばかりの頃、低温実験、遺伝子導 入、シーケンス方法とかを深夜まで教えていただいたことは、非常によい思い 出であります。大変辛抱強く見守っていてくださり、そのおかげで納得のいく 論文を作成することができました。ありがとうございました。
本学 生体分子材料研究室 澤田研准教授から研究指導、貴重なご助言を頂 きまして、ありがとうございました。
北海道大学 生物情報解析科学研究室 菊川峰志講師にはロドプシンのレー ザー閃光分解解析やイオンポンプ活性の測定方法を教えて頂きました。また、
実験手法などに関して、多くのご助言をいただきました。心から感謝いたしま す。
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名古屋大學 遺伝子実験施設 井原邦夫准教授には遺伝子解析を行って頂いた
こと、研究にご意見やご助言をいただきましたことにありがとうございました。
岩佐研メンバーのみなさん、澤田研メンバーのみなさんそのほかたくさんの 方々からアドバイスや励ましのお言葉をいただきました。みなさんに大変お世 話になりました。ありがとうございました。
本学 国際交流センターメンバーたちには留学生活に助けたこと、国際活動 に参加させたことに心より感謝いたします。
在日生活に大変お世話になり、いつも温かい激励を頂きました三津谷様、船 森様、松崎夫婦、田澤早智子様から始めたたくさんの友人たち、留学生同士に 心より感謝致します。
外国人留学生として「研究留学生日本政府（文部科学省）奨学金」を付与さ
れた日本文部科学省と知識で育てくれた室蘭工業大学に厚く礼を申し上げます。
最後に長い留学生活を応援してくれたご両親や妻に、深く感謝の意を表しま す。
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研究業績
学術雑誌（査読あり）
1. Chaoluomeng, Gang Dai, Takashi Kikukawa, Kunio Ihara, Tatsuo Iwasa;
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3. Gang Dai, Lamei Liu, Qingchao Ouyang, Chaoluomeng, Tatsuo Iwasa;
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学会発表
国際会議における発表 口頭発表
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Three retinal proteins from the cell membrane of Halorubrum species