[36]により一つの断片に繋いだものを作製した. 得られたDNA断片を, Jumping cat assay
systemを含む枯草菌168株に形質転換し, 薬剤入りの培地で選択, 単離後, シークエンス解
析によりmuB遺伝子がrecA遺伝子と置換されていることを確認し, 目的の株を得た.
＜結果＞
この株を用いて, これまで通りCI培地を用いてJumping cat assayを行った（転移頻度の 測定方法は第2章第1節を参照する）. その結果, recA::muB置換株の転移頻度は, recAを持 たないにも拘らず, recAを有する場合（つまりWT）と同等であり, 互いに統計的なレベル で差は無いことが分かった（0.93倍, p = 0.40, 図10）. つまり, IS256Bsu1によるmini-ISの 転移に対するrecAの必須性は, muBにより相補されることが分かった.
図10. muB遺伝子のmini-ISの転移におけるrecAへの相補性
mini-IS転移頻度をrecA::muB置換株を用いて測定した結果ををBox plotで示す. 箱の上辺 は第一四分位点, 中央の太線は中央値, 下辺は第三四分位点を示す. 箱に対して垂直な直線 の上端は最大値, 下端は最小値を意味する. TPF（縦軸）は転移頻度, Strain（横軸）は各株 の遺伝型を示す（recAd：recA欠損, recA::muB：recA遺伝子をmuB遺伝子で置換した株, WT：野生株）. アスタリスク（*）は, 並べ替えBrunner-Munzel検定により, CI培地を用い た場合の転移頻度と比較して有意差が認められたものを示す（p < 0.05）. 尚, 参考のため, 茂木 俊丞氏のrecAdの測定値を並べて図示した[27].
2-2. muB遺伝子のUV耐性におけるrecAへの相補性
続いて, これらのmuBのrecAに対する相補性が, mini-ISの転移に限定されるのか, それと もDNA修復能も相補可能かを調べるため, recA::muB置換株のUVに対する耐性を検証した.
＜材料, 方法＞
実験は, 半定量的な大腸菌のUV耐性検証法として過去に報告のある方法を参照した[70].
実験には通常の枯草菌168株, Jumping cat assayシステムを有する枯草菌168株3種（WT, ΔrecA, recA::muB）を用いた. 凍結保存したこれらの株は, LB寒天培地に塗り広げて一晩培 養し, 翌日LB液体培地で吸光度（600nm）が1.0となるまで培養した. この培養液を, 白金耳 でLB寒天培地に直線状に塗り広げた. プレートを光の反射率が小さい硬質ウレタンで部分 的に覆いながら, 照射線量（J/m2）が昇順となるようUV-Cを照射した. その後, 37℃で16時 間, 光を遮蔽して培養し, recA::muB置換株のUV耐性を他の株と比較した.
＜結果, 考察＞
実験の結果, muBとrecAを置換した株のUV耐性は, recAを欠損している場合と同様, 非常 に低いことが分かった（図11）. また, 野生株について, Jumping cat assayシステムを含む ものとそうでないものを比較し, Jumping cat assayシステムの有無はUV耐性とは無関係で あることも分かった（図11）. 以上を踏まえると, recAは, IS256Bsu1によるmini-ISの転移 に寄与するが, その役割は少なくともin vivoでは相同組換え反応とは異なる機能であり, か つmuBに保存されているものと同等である. つまり, IS256Bsu1を介したmuBとrecAの系統 的なつながりの存在が示唆された. 一方, recAや他の相同組換え因子に見られるDNA修復能
は, muBとrecAの共通祖先配列が変異する中で獲得されたものであると考えられる.
Fig4
UV
-168 trpC2 (WT) WT
(Jumping cat) recA::muB (Jumping cat) recAd
(Jumping cat)
132 66 22 0
UV +
[J/m
2]
図11. UV耐性におけるmuB遺伝子のrecAに対する相補性試験
recA::muB置換株の, recAにおけるUV耐性の相補性を検証した結果を示す. 左の写真は UV照射群（UV+）, 右はUV非照射群（UV-）, 右端は塗抹した菌株の遺伝型に対応する. UV照射群（UV+）における縦線は, 照射した紫外線の強度を区別するためのものであり, 各々の紫外線の照射強度を写真下に記載した(J/m2).