5-1. 本研究の総括
大 腸 菌 に よ る ト ラ ン ス ポ ー タ ー の 大 量 発 現 ・ 精 製 系 を 用 い て 調 製 し た
VGLUT2 を質量分析法で効率的に検出することができた。さらに、この方法を
用いることで、VGLUT2 以外のトランスポーターでも高いカバー率で検出する ことができた。
5-2. 展望
過去の報告から、2003年にKabackらが、化学修飾剤を用いた質量分析法（ ESI-MS）により、原核生物の膜タンパク質であるラクトーストランスポーター
（lactose permease; LacY）の基質結合部位を明らかにしている（69）。すなわち、
精製した LacY とカルボキシル基に特異的に結合する化学修飾剤のカルボジイ ミドを反応させ、基質存在下および非存在下におけるマススペクトルのイオン 強度を比較した。その結果、Glu269 が基質であるラクトースの結合に関与して いると結論された。その後の X 線結晶構造解析により、基質が結合した状態の LacYの構造が解かれ、Glu269がラクトース結合に関与していることが証明され た（70、71）。このように、質量分析法はトランスポーターとリガンドの相互作 用を解析する有効な手法である。
本研究の質量分析を用いた予備的な実験から、精製したVGLUT2 にDIDSを 反応させた場合、コントロールと比較して m/z 2064 の増加がみられピークシフ トしている傾向が見られた。VGLUT2 の DIDS 結合数を検証する必要性がある と考えているが、この初期段階のデータから、VGLUT2 への化学修飾剤の結合 をMSにより検出可能であることが示唆された。今後の研究課題はDIDSが結合 したペプチド断片のピークを検出することである。2010 年以降、VGLUTs のグ ルタミン酸輸送に関する分子メカニズムの研究は長らく停滞していたが、化学 修飾されたペプチド断片を見出すことができれば、それを皮切りに、VGLUTsの 制御機構の分子メカニズムが明らかになるだろう。
トランスポーターは生体内において脂質二重膜上で機能している。これまで のトランスポーターの MS を用いた研究は界面活性剤溶液中の精製タンパク質 が用いられてきたが（69）、精製・再構成系によるトランスポーターの輸送活性 測定（図 6）のようにトランスポーターを人工膜小胞に再構成した状態のもの、
あるいは、タンパク質精製段階の膜画分を用いることなどの改良も重要な課題 といえる。VGLUTs の塩化物イオン結合部位を探索するにあたり、VGLUT2 を
発現させた大腸菌の膜画分、あるいは、精製 VGLUT2 の再構成人工膜小胞に DIDSを反応させ、DIDSが結合した状態のVGLUT2を単離するという手法を検 討中である。その後、溶液内トリプシン消化によりペプチド断片化し、ピークシ
フトした VGLUT2 由来のペプチド断片の検出を試みる（図 15）。その際には、
脂質をいかに除去するかが鍵となるだろう。予備的な実験としてVGLUT2を再 構成した人工膜小胞をMSにより解析したところ、目的のVGLUT2のピークの 検出には至らなかった。おそらく、TCA 沈殿およびジエチルエーテルとエタノ ールの混合溶液による洗浄作業では脂質を除去しきれていないことが考えられ、
イオン化が容易な脂質によりタンパク質のイオン化が抑制された可能性がある。
クロロホルムメタノール混液抽出法などの脂質の抽出方法から最適な実験条件 を探るとともに、再構成したVGLUT2を界面活性剤により可溶化し精製するこ とにより改善できるのではないかと考えており、改良の余地があるだろう。
MSにより見出されたDIDSが結合するアミノ酸残基に対して、部位特異的変 異導入と輸送活性測定法を組み合わせた分子生物学的、かつ、生化学的な機能解 析を行うことで VGLUTs の塩化物イオン結合部位に関する新たな知見を得るこ とができる。そして VGLUTs を標的とした難治性てんかん治療薬開発のための 基礎的な情報を提供することができると期待される。また、塩化物イオンによる 活性調節機構はSLC17型トランスポーターファミリーに共通の性質であること
から（6、7、43-45）、VGLUTsを標的とした難治性てんかんの新薬開発につなげ
るためには VGLUTs 特異的阻害作用を示す化合物であることが求められる。ホ モロジーモデリングを用いた VGLUTs と化合物の結合様式の予測から特異的な 化合物を設計し、さらに、in vitro実験の輸送活性測定によりVGLUTs特異的な 化合物を見出していく必要がある。
従来の手法はランダムに部位特異的変異導入し、それぞれの機能を解析して いたため、時間がかかるという問題があった。しかし、この実験系が確立されれ ば、簡便かつ短時間で化学修飾剤が結合するペプチド断片をスクリーニングで きるようになるため、今後のトランスポーターの構造解析への応用が期待され る。例えば、VEATはアスパラギン酸とグルタミン酸をシナプス小胞に濃縮する トランスポーターであり、VGLUTsと同じSLC17型トランスポーターファミリ ーに属している。VEATの遺伝子変異は、神経障害を主症状とする難病に指定さ れているサラ病を引き起こすことが報告されている。これはR39C変異によりア
スパラギン酸輸送活性が消失することに起因することが示唆されている（7）。一 方、VGLUT2のグルタミン酸輸送の必須残基は、His128、Arg184、Glu191 と報 告されており（39）、Arg184と Glu191 は、VEATにおいても共通に保存されて いるアミノ酸残基である（図5）。His128はVGLUTsにのみ保存されているアミ ノ酸残基であることから（図5）、His128がグルタミン酸とアスパラギン酸の基 質特異性を決定している可能性が考えられる。部位特異的変異導入法により、
His128をAlaに置換した場合、グルタミン酸輸送活性が完全に消失するため（39）、
輸送活性により評価することが困難である。そこで、His残基の化学修飾試薬で あるdiethyl pyrocarbonate（DEPC）を用いて質量分析することによって、His128 の役割を明らかにできるのではないかと考えている。また、グルタミン酸のアミ
ノ基とVGLUT2が結合するアミノ酸残基（カルボキシル基）の特定に、カルボ
キシル基の化学修飾試薬であるN,N’-diisopropylcarbodiimide（DIC）が有効である と考えている。以上の解析を通じて、VGLUTs および VEAT のより詳細な分子 メカニズムの解明に繋がると期待される。
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