その他の小胞型神経伝達物質トランスポーターの解析

アよりも大きく 108 および 138 であり、測定したタンパク質は、有意に Mus musculus（マウス）VEAT（gi|27370146）、Homo sapiens（ヒト）VAChT（gi|507744）

であると示した（P < 0.05）。PMF 解析によりヒットしたタンパク質のうち、閾 値スコア未満で示されたタンパク質は、VEATにおいては、Mus musculus（マウ ス）PREDICTED: dynein heavy chain 17, axonemal isoform X2（gi|568975683）およ びMus musculus（マウス）PREDICTED: dynein heavy chain 17, axonemal isoform X1

（gi|568975681）であり、VAChTにおいては、Homo sapiens（ヒト）immunoglobulin heavy chain variable region, partial（gi|519672022）であった。また、生物種をAll

entriesに設定した場合、生物種が異なるVEATおよびVAChTのみ有意に検出さ

れた。一方で、大腸菌由来のヘリックスタンパク質である YbeL と YaiN は検 出されなかった。

また、MIS解析により、VEATは1つのペプチド断片の全配列を同定し、5つ のペプチド断片の配列を部分的に同定した（表9）。VAChTは7つのペプチド断 片の配列を部分的に同定した（表10）。したがって、PMF解析により検出したタ ンパク質はそれぞれMus musculus（マウス）VEAT（gi|27370146）、Homo sapiens

（ヒト）VAChT（gi|507744）であることが示された。

さらに、LC/MSによりVEATは52%（表11）、VAChTは57%（表12）のアミ ノ酸残基を検出し、LC/MS/MSにより、12個のVEAT由来のペプチド断片（表

9）および8個のVAChT由来のペプチド断片を同定した（表10）。以上の結果か

ら MS と LC/MS を組み合わせることにより、VEAT および VAChTはそれぞれ

58%（図 14A、+および－表記）、64%のアミノ酸残基を検出した（図 14B、+お

よび－表記）。

VGLUT2のトリプシン消化物の質量分析は、MSとLC/MSを組み合わせるこ

とで88%のカバー率を得ることができた。これに比べると、VEATおよびVAChT

のトリプシン消化物は十分に検出できているとはいえない。VGLUT2 と同程度

までVEATとVAChTのカバー率を向上させるために、トリプシン以外の消化酵

素であるキモトリプシンと Asp-N を検討した。キモトリプシンは芳香族アミノ 酸（Tyr残基、Phe残基、Trp 残基）とLeu残基のC末端を選択的に加水分解す る酵素であり、切断箇所が多いため単独で用いた。また、Asp-N は Asp 残基と Cys 残基の N 末端側のペプチド結合を加水分解する酵素であり、切断箇所が少 ないため、トリプシン消化後に追加で酵素処理した（トリプシン+ Asp-N）。

キモトリプシン消化物のPMF解析により、VEATは40個のペプチド断片を検 出した。このうち、16個のペプチド断片は、1 か所の未切断部位を含み、16 個 のペプチド断片は、2か所の未切断部位を含んでいた（表13）。しかし、MIS解 析によるアミノ酸配列の特定には至らなかった（表 14）。一方で、VAChT のキ モトリプシン消化物は63個のペプチド断片を検出した。このうち、20個のペプ チド断片は、1か所の未切断部位を含み、23個のペプチド断片は、2か所の未切 断部位を含んでいた（表15）。MIS解析により、3つのペプチド断片の配列を部 分的に同定した（表16）。

トリプシン+ AspN消化物のPMF解析により、VEATは33個のペプチド断片 を検出した。このうち、13個のペプチド断片は、1か所の未切断部位を含んでい た（表13）。MIS解析により、3つのペプチド断片の全配列を同定し、4 つのペ プチド断片の配列を部分的に同定した（表14）。一方で、VAChTは26のペプチ ド断片を検出した。このうち、12のペプチド断片は、1か所の未切断部位を含ん でいた（表15）。MIS解析により、8つのペプチド断片の配列を部分的に同定し た（表16）。また、どちらのトランスポーターにおいても、キモトリプシン、ト リプシン+ AspN処理サンプルのPMF解析では大腸菌由来のヘリックスタンパ ク質であるYbeLとYaiNは検出されなかった。

したがって、トリプシン消化したMSとLC/MSの結果とキモトリプシン消化 とトリプシン+ AspN消化したMSの結果を組み合わせることにより、VEAT は 495アミノ酸残基中447のアミノ酸残基、すなわち、90%のアミノ酸残基をカバ ーすることができた（図14A）。VAChTは532アミノ酸残基中484のアミノ酸残 基、すなわち、91%のアミノ酸残基をカバーした（図14B）。

以上より、VGLUT2以外のトランスポーターにおいても、VGLUT2 と同様の

方法で精製し、かつ、前述した溶液内消化法により調製することにより、可溶性 タンパク質と同程度の約 90%のカバー率でトランスポーター由来のペプチド断 片を検出することが可能であることが示唆された（表17）。

第 4 章