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波長(nm)
phen添加に伴う6、Eu(III)、44merの複合体の発光スペクトル(À ex=285nm)の 変化(Eu(皿)に対して0、5、20、100当量のphenを添加)
6: 1μM， 44mer: 0.5μM， EuC13: 0.5μM，l、�aCl: 2M， HEPES (pH7.5): lmM，
測定温度: 50C
図4-25
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波長(nm)
phen添加に伴う6、Eu(ill)、26merの複合体の発光スペクトル(À ex=285nm)の 変化(Eu(ill)に対して0、5、20、100当量のphenを添加)
6: 1μM，26mer: 1μM， EuCI3: 0.5μM， NaCI: 2M， HEPES (pH7.5): 1mM，
測定温度:
SOC図4-26
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図4-27 phen添加に伴うふ Eu(III)、 CT-DNAの混合系の発光スペクトル(À ex=285nm) の変化(Eu(III)に対して0、 エ20、 100当量のphenを添加)
6:
1μM， CT-DNA(p): 43μM， EuC13: 0. 5μM， NaCl: 2M， HEPES (pH7.5): 1ロホ1，
測定温度: 50C
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図4-28 phen添加に伴うEu(ill)の発光強度の変化
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各場合においてプロ ットしたものを示す 。 これら の結果より、 Eu(III)の場 合も、 Tb(III)の場合 とほぼ同様 の挙動をとることがわかった。 すなわち、
26merの場合 が最も発光強度の増加の割合が高く 、 その次が44merの場合 で あ り 、 その 次がCT-DNA の場 合であった 。 また、 前節での検討と同様に、
Eu(III)の発光強度はかなり小さく、 Tb( II I)の1/5程 度であった。
4-3-3 まとめ
ここでは前節 とは考 え方を変え、 光増感剤としてphenを利用して、 プロ ーブオ リゴヌクレオチドが三本鎖DNAを形成した際に積極的にランタノイ
ドイオンを発光させることを試みた。 実際にTb(III)、 Eu(II I)の発光強度は、
6のターゲットとなるDNA二本鎖を共存させた場合に は、 phen 添加に伴い 顕著に 増大していった。 一方で、 CT-DN Aを共存させた場 合に は、 phenを 添加しでも-発 光強 度はほとんど増大しな かった。 従って 、 本実験系は、
DNA二本鎖上の三本鎖形成部位を検出する手段として活用できる可 能性を 有するものであると考えられる。
C2対称、配列 を 有するDNA二本 鎖42mer、 43mer、 44mer 共存 下での発光 挙 動と、 26mer共存下での発光挙動を比較すると、 26merを共存させた 方が 発光強度 の増加の程度が大きいことがわかった 。 このことは、 C2対称配列 を特異的に検出するという観点からは、 不利な点であると考えら れる。 し かしながら、 前節で述べたように、 オリゴヌクレオチド6はC2対称、配列に 対してより 高い親和性を有している。 従って、 三本鎖形成 の反応条件を調 節することによって、 C2対称、配列のみを特異的に認識させ、 検 出すること も可能であると考えられる。
ー145-�
本実験系は、 DNA 二本鎖上の特異な配列を検出する手法として活用 でき る可能性を有するもの の、 現時点では、 まだ多くの改善すべき 点が ある。
特に、 以下に示すように、 増感剤として使用したphenについては、 多くの 問題点がある。
まず第一に phenの励起 波長 の 問題である。 phen の吸収波長は核酸塩基 の それとほぼ同じである ため、 phenを励起させると 核酸塩基も同時に励起さ れることになる。 この場合、 前節の 検討で明らかになっ たように、 三本鎖 を形成 しない系において、 核酸塩基から のエネルギー移動に基づくTb(III) 発光が顕著になる。 従って、 この発光がすべて三本鎖、を形成しない系での 発光に上乗せ されることになり、 三本鎖を形成 する系と のコントラストが 小さくなっている 。 このような観点 から、 より長波長側に吸 収を有する DNA配位子 を増感剤として利用し、 そのような 長波 長側 の光で励起する必 要があると考え られる。
phenのDNA二本鎖に対する結合能も問題点として挙げられる。 図4-23、
4・28から明らかなように、 ランタノイドイオンを効果的に 発光させ る には かなりの高濃度のphenを必要としている。 また、 このような条件下では、
三本鎖を形成 せ ずに、 一本鎖 DNAとして存在している 系 でも、 ランタ ノイ ド イオン の発光強度の増大が観られる。 従って、 よりDNA二本鎖に対して 高い親和性を有する配位子を増感剤として 使う必要があると考え られる。
また 、 DNA二本鎖にインターカレートした状態での phen のランタノイド イオンに対する配位能も 問題点として考えられる。 す なわち、 phenはDNA 二本鎖に インタ ーカレーションすると 、 窒素原子を含むキレートサイトは、
基本的 にはDNAの溝から突き出た形では存在していないと 考えられる。 こ のような状態では、 と りわけC2対称、配列をターゲットと する 場合、 ランタ ノイド金属錯体は動 き得る空間的な自由度は制限されている ため、 容易に はphenと相互作用できないとものと考 えられる。 このような観点 から、 配 位サイトがDNAの溝から突き出せる ような構造を有する配位子を、 増感剤
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として利用することが望ましいと考えられる。
以上のような問題点を解決する配位子(光増感剤)としては、 ジピリド フェナジン(D PP Z)配位子等が候補として挙げられる。