司".-43mer
物=ひフェナンスロ1)ン
44mer
図4-21 Tb(III)-6-三本鎖DNAの複合体の模式図
置する確率が高いと考えられる。 一方、 44merの場合、
Tb(III)錯体は かな
りDNA二本鎖に近接していると考えられる。 ここでphen はDNA二本鎖にイ ンターカレーションしていると考えられるので、 よりTb(I11)錯体がDNA二 本鎖に近接 している方が発光効率 は高いと推測される。 ゆえに、 ここで観 測された発光強度の違いは、 このよう なTb(III)錯体 と DNA二本鎖との間の相対的な位置関係を反映したもので は ないかと考えている。
次に、 DNA二本鎖として26merを使用して同様の検討を行った。
Tb(II1)-6-26me rの複合体 に、 ph
enを添加して いった場合の発光スペクトル( Àex = 285 n m)の変化を図4-22に示す。 この場合も明らかにphen添加 に伴い
Tb(III)の発光強度が増加していった。 増加の程度 は、 先の42mer、 43mer、
44mer を用いた場合よりも明らかに大き かった。 図4-23に、 phen添加に伴 うTb(lll)の発光強度の変化をプロ ットしたものを、 44merの場合 と併せて 示す。 こ れより、 phenをTb (111 ) に対して100当量加えた点で比較す る と、
26merの方が44merよりも約1.5倍強度が大きいことがわかる。
-139-一一一一 0
・・ー・・・・ 5
- ー ー ー - 20
一一・・・ー100
‘トトal--ドJ一いハベ山川川トいいい山内
1 . 6
1.0
0.2 1.4 1.2
0 . 8
0.6 0.4
ωmgパ沢山m
650 550 600
波長(nm)
500
。
450
phen添加に伴う6、 T吹田)、 26merの複合体の発光スペクトル(À ex=285nm) の変化(Tb(III)に対して0、 5、 20、 100当量のphenを添加)
図4-22
6 : 1μM， 26mer: 1μM， Tb(N03)3: 0.5μM， NaCl: 2M， HEPES (pH7.5): 1mM，
測定温度: 50C
30 35
2 0 25
ハU噌EEA
15
5
脳出米紙
。
。
2 0 4 0 6 0 8 0 100
[phen]/[Tb(皿)]
phen添加に伴うTb(III)の発光強度の変化 44mer、 26mer、 CT-DNA間での比較 図4-23
-140-これについては、 以下のようなことが要因として考えられる。 6が 26mer と三本鎖を形成する場合は、
Tb(III)はl分子のイミノ二酢酸によってのみ
配位されているため、 その残余配位能力は高い と 考えられる。 この場合、より効 果的にphenと錯形成が可能であり、 この ことが原 因で大きな発 光強 度 の増大 が観られた 可能性 が考えられる 。 も う一つの要因と しては 、 Tb(III)錯体が動き得る空間的な自由度が考えられる。 すなわち、 26merの 場合、 44merの場合と比較して、 Tb(III )錯体はそ れほど固定されておらず、
ある程度自由に動くことが可能であると考えられる。 そのため、 phenとの 錯形成に有利なコンフォメーシ ョンをとることも 可能で あり、 このような ことが原因 で効 果的な発光が観測された可能性も考えられる。
次に、 オリゴヌクレオチド6とTb(III)の複合体 にCT-DNAを共存させ、
phen添加に伴う発光挙動の変化を観察した。 図4-24に、 phen添加に伴う発 光スペクトルの変 化を示す。 また、 phen添加に伴う Tb(III) の発光強度の変 化をプロ ットしたものを、 先の図4-23に示した。 CT-DNAの場合、 44 mer や26merの場合と比較して、 phen添加に伴い Tb(III )の発光強度はほとんど 増大しなかった。 これより、 phenはDNA二本鎖上に濃縮されており、 6が DNA二本鎖と三本鎖を形成して初めてTb(III)の 効果的な発光が観察される ものと判断でき る。 このことは、 本実験系 がDNA 二本鎖上の三本鎖形成部 位の検出法として活用できる 可能性を有することを示すもの である。
ところで 、 CT-DNAの系では他の系と比べて、 phenを添加していない状 態で の発光強度が高い。 前節での検討で明らかになったよ うに、 本系では
6が三本鎖を形成していない状態では、
核酸塩基からのエネルギー移動 に基づくTb(III )の発光が効果的に起こる 。 ここでは、 増感剤として利用 した phen の吸収波長が、 核酸塩基の吸収波長とほぼ一致しているため、 励起波 長として 核酸塩基を励起させる 波長とほ ぼ同じ波長を利用した。 このため、
phenを 励起させると必然的に核酸塩基も同時に励起されることになり、
ー141-.r-'
1.2
0.8
生gd